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문제 정의
- 본 연구에서는 고농도의 PAHs로 오염된 토양으로부터 나프탈렌 분해 미생물을 분리 및 동정하고 미생물의 성장 특성과 나프탈렌으로 오염된 토양슬러리 시스템에서 토양 유기물 함량이 서로 다른 토양을 사용하여 나프탈렌의 분해특성을 조사하고 배지 종류에 따른 biofilm의 형성특성과 그에 따른 나프탈렌의 분해특성을 관찰하였다.
제안 방법
- 염색이 완료된 e-tube는 증류수로 3번 세척하여 잔류된 염색시약을 제거한다. Cell과 결합된 dye는 1 mL의 95% EtOH를 사용하여 탈색시키고 탈색액을 O.D. = 570 nM에서 흡광도를 측정하여 biofilm의 생성량을 측정하였다(Roongsawang et al., 2003).
- 순수 분리된 미생물을 동정하기 위하여 LB agar plate 에 전배양된 미생물을 솔젠트(주)에 의뢰하여 균주의 16S rRNA 염기서열을 해독하였다. Sequencing결과는 NCBI의 Blast검색 프로그램을 통하여 유사성을 판단하였다. 동정결과, 순수분리된 균주는 Pseudomonas aeruginosa sp.
- 균주 CZ6의 성장이 배양 온도에 의한 영향을 조사하기 위하여 20℃, 30℃, 40℃로 배양기의 온도를 조절하여 나프탈렌을 0.10%, 150 rpm의 배양 조건으로 배양특성을 조사하였으며 결과를 Fig. 2에 나타냈다. 배양 온도 30℃와 40℃에서 초기 대수증식기로 들어서 빠른 성장속도로 비슷하게 성장하나 25 h 후 부터는 배양 온도의 영향을 받아 유지기로 들어섰고 20℃에서는 기타 배양 조건보다 유도기가 길어서 20 h부터 대수증식기에 들어서서 30℃ 조건에서 배양 할 때와 비슷한 성장경향을 보이는 것으로 나타났다.
- 나프탈렌 분해 균주 CZ6의 성장특성을 조사하기 위하여 200 ml MSM 배지에 나프탈렌을 0.5%(w/v)넣고 CZ6를 1%(v/v)접종하여 배양하였다. 미생물의 성장은 미생물 배양액의 흡광도를 통하여 간접적으로 측정하였다.
- 나프탈렌 분해 미생물 CZ6의 biofilm 생성특성을 연구하기 위하여 영양특성이 다른 LB, YM(Y-medium), MSM 배지에 CZ6를 접종하여 biofilm의 생성량을 측정하였다. Biofilm 측정실험에 추가로 사용된 YM 배지는 0.
- 나프탈렌 분해 시 미생물의 형태와 배양상태를 관찰하기 위하여 광학현미경(Olympus CX40, Japan)으로 검경하여 균주의 운동성, 미생물의 형태학적 특징과 MSM 배지에서 나프탈렌 분해 시 성장상태를 연구하였다. 관찰된 현미경 사진은 Dino Eye-piece 현미경 카메라(AM423X, TaiWan)를 사용하였다.
- 600nM를 측정하였다. 나프탈렌의 농도에 따른 영향을 파악하기 위하여 0.05%, 0.10%, 0.50%, 1.00% 나프탈렌을 넣고 배양액의흡광도를 측정하였고 pH 조건에 따른 영향을 파악하기 위해 배양액의 초기 pH를 pH 4, pH 6, pH 7, pH 9, pH 10으로 조절하여 사용하였다. 배양 온도에 대한 영향을 보기 위하여 20℃, 30℃, 40℃의 배양조건에서 성장 곡선을 측정하였다.
- 00% 나프탈렌을 넣고 배양액의흡광도를 측정하였고 pH 조건에 따른 영향을 파악하기 위해 배양액의 초기 pH를 pH 4, pH 6, pH 7, pH 9, pH 10으로 조절하여 사용하였다. 배양 온도에 대한 영향을 보기 위하여 20℃, 30℃, 40℃의 배양조건에서 성장 곡선을 측정하였다.
- ) = 600 nM에서 배양액을 석영 cell에 주입하여 배양액의 흡광도를 측정하였다. 성장상태를 확인하기 위하여 일정시간 간격으로 O.D.600nM를 측정하였다. 나프탈렌의 농도에 따른 영향을 파악하기 위하여 0.
- 순수 분리된 미생물을 동정하기 위하여 LB agar plate 에 전배양된 미생물을 솔젠트(주)에 의뢰하여 균주의 16S rRNA 염기서열을 해독하였다. Sequencing결과는 NCBI의 Blast검색 프로그램을 통하여 유사성을 판단하였다.
- 49%이다. 시료중의 나프탈렌을 분석하기 위하여 HPLC pump 시스템(YongLin 930)과 자외선검출기(YongLin 730D)를 사용하여 UV254nm에서 분석을 하였다. 준비된 샘플은 HPLC 분석용 2 mL vial에 옮겨 HPLC column (LC-PAH 25 cm × 4.
- 여러 가지 농도의 나프탈렌의 균주 CZ6의 성장특성을 파악하기 위하여 나프탈렌을 0.05%, 0.10%, 0.50%와 1.00%(w/v)로 결정상태의 나프탈렌을 주입하여 150 rpm, 30℃의 배양기에서 배양을 하였으며, 배양결과를 Fig. 1에 나타냈다. Fig.
- 여러 가지의 pH 조건에서 균주 CZ6의 성장특성을 관찰하기 위하여 pH 4, pH 6, pH 7, pH 9와 pH 10로 초기 배지의 pH를 조절하여 CZ6의 성장을 측정하였다. Fig.
- 2 g씩 넣고 2 mL의 멸균된 서로 다른 배지(LB, YM, MSM)를 넣고 초기 토양슬러리 용액의 나프탈렌 농도를 10 ppm이 되도록 각각 오염시켰다. 오염된 토양슬러리는 실온에서 6 rpm으로 48시간 rolling하여 나프탈렌이 흡착평형에 이르게 한 후 균주를 접종하여 나프탈렌 분해특성을 조사하였다. 접종 미생물은 0.
- 이 colony를 10 ml의 LB 액체배지(Bacto tryptone 10 gL−1, Yeast extract 5 gL−1, NaCl 10 gL−1)에서 전배양을 한 다음 다시 나프탈렌을 포함하는 MSM 배지에 접종하여 분해여부를 확인하였다.
- 미생물의 성장은 미생물 배양액의 흡광도를 통하여 간접적으로 측정하였다. 자외선 흡광광도기 UV 1800pc(HUMAN, Korea)를 사용하여 Optical Density(O.D.) = 600 nM에서 배양액을 석영 cell에 주입하여 배양액의 흡광도를 측정하였다. 성장상태를 확인하기 위하여 일정시간 간격으로 O.
- 준비된 샘플은 HPLC 분석용 2 mL vial에 옮겨 HPLC column (LC-PAH 25 cm × 4.6 mm × 5 um, Supelco)을 사용하여 분석하였으며 acetonitrile와 증류수(80 : 20)를 이동상으로 사용하여 실험을 하였다.
- 흑음지, 장성토양에서의 CZ6의 나프탈렌의 분해특성과 배지의 종류에 따른 나프탈렌 분해특성을 관찰하였다. 토양슬러리 시스템은 4 mL 스크류 vial에 유기물 함량이 다른 위의 두 가지 토양을 각각 0.2 g씩 넣고 2 mL의 멸균된 서로 다른 배지(LB, YM, MSM)를 넣고 초기 토양슬러리 용액의 나프탈렌 농도를 10 ppm이 되도록 각각 오염시켰다. 오염된 토양슬러리는 실온에서 6 rpm으로 48시간 rolling하여 나프탈렌이 흡착평형에 이르게 한 후 균주를 접종하여 나프탈렌 분해특성을 조사하였다.
- 토양슬러리에서 나프탈렌의 농도를 측정하기 위하여 토양슬러리를 원심분리한 후 상등액 1 mL을 vial에 옮기고 토양에 흡착된 나프탈렌은 MeOH를 유기용매로 초음파 추출기로 3 min간 추출하여 원심분리한 후 상등액을 분석하였다. 토양슬러리 내 나프탈렌의 recovery rate는 98.
- 1%(w/v)의 나프탈렌을 기질로 MSM 배지에서 전배양한 배양액을 원심분리하여 cell를 회수하고 160 mM의 phosphate buffer saline(PBS) 용액으로 3번 이상 washing하였다. 회수된 미생물은 O.D.600nm = 2.0이 되게끔 조절한 후 2%(v/v) 접종하여 분해특성을 4시간 간격으로 관찰하였다.
- 흑음지, 장성토양에서의 CZ6의 나프탈렌의 분해특성과 배지의 종류에 따른 나프탈렌 분해특성을 관찰하였다. 토양슬러리 시스템은 4 mL 스크류 vial에 유기물 함량이 다른 위의 두 가지 토양을 각각 0.
- 흑음지와 장성토양을 사용한 토양 슬러리에서 배지의 종류에 따라 24시간 내의 나프탈렌의 분해특성을 관찰하였다. Fig.
대상 데이터
- 나프탈렌 분해 미생물 CZ6의 biofilm 생성특성을 연구하기 위하여 영양특성이 다른 LB, YM(Y-medium), MSM 배지에 CZ6를 접종하여 biofilm의 생성량을 측정하였다. Biofilm 측정실험에 추가로 사용된 YM 배지는 0.2% Bacto tryptone, 0.1% NaCl, 0.2% Yeast extract, 0.025% KH2PO4, 0.025% K2HPO4, 0.01% (CH3COO)2Ca, 0.01% (CH3COO)2Mg를 1 L 증류수에 녹이고 pH 7.0으로 조절하여 사용하였다(Morikawa, 2009). 구체적인 방법은 전배양 시킨 CZ6(O.
- 나프탈렌 분해 시 미생물의 형태와 배양상태를 관찰하기 위하여 광학현미경(Olympus CX40, Japan)으로 검경하여 균주의 운동성, 미생물의 형태학적 특징과 MSM 배지에서 나프탈렌 분해 시 성장상태를 연구하였다. 관찰된 현미경 사진은 Dino Eye-piece 현미경 카메라(AM423X, TaiWan)를 사용하였다.
- 흡착실험과 토양에 따른 나프탈렌의 분해실험에서 사용한 토양은 SOM(soil organic matter)이 서로 다른 흑음지(제주도의 검은색 화산재 토양)(이광춘 외, 2007)와 장성 토양(전라남도 장성의 인근 산에서 채취한 유기물이 풍부한 부식토)을 사용하였다. 실험에 사용된 토양은 그늘에서 건조한 후 2 mM의 체로 걸러 낸 후 감마살균을 하여 사용하였다. Table 1에서는 두 가지 토양의 특성을 나타내었다.
- 나프탈렌을 분해하는 미생물은 전남지역 산업단지의 오염된 토양에서 분리하였다. 실험에는 무기배지 MSM(mineral salt medium)을 사용하였다(Harwood et al, 1994). 그 조성은 다음과 같다.
- 흡착실험과 토양에 따른 나프탈렌의 분해실험에서 사용한 토양은 SOM(soil organic matter)이 서로 다른 흑음지(제주도의 검은색 화산재 토양)(이광춘 외, 2007)와 장성 토양(전라남도 장성의 인근 산에서 채취한 유기물이 풍부한 부식토)을 사용하였다. 실험에 사용된 토양은 그늘에서 건조한 후 2 mM의 체로 걸러 낸 후 감마살균을 하여 사용하였다.
성능/효과
- LB, YM, MSM 배지등 영양물질의 함량이 서로 다른 배지를 사용하여 biofilm 생성량을 측정하였으며 부영양 상태의 LB 배지에서 biofilm이 가장 많이 생성되는 것으로 나타났다. 0.05%, 0.10%, 0.50%와 1.00%(w/v)농도의 나프탈렌을 기질로 한 배양조건에서 기질의 농도 영향을 크게 받지 않고 20℃, 30℃, 40℃의 배양 온도조건과 pH 4, pH 6, pH 7, pH 9와 pH 10의 초기 배지의 pH조건에서 배양결과 0.10%, 150 rpm 조건에서 최적 배양조건은 30℃, pH 7로 나타났다.
- 여러 가지의 pH 조건에서 균주 CZ6의 성장특성을 관찰하기 위하여 pH 4, pH 6, pH 7, pH 9와 pH 10로 초기 배지의 pH를 조절하여 CZ6의 성장을 측정하였다. Fig. 3에서 관찰하면 균주 CZ6은 pH 7인 중성 조건에서 가장 활성이 좋은 것으로 나타났고 pH 4와 pH 10인 강산 강염기 조건에서는 미생물의 성장이 미비한 것으로 나타났다. 그러나 pH 6부터 pH 9인 넓은 pH 조건에서 모두 높은 성장활성을 보이고 있다.
- 나프탈렌 분해균주인 Pseudomonas aeruginosa CZ6는 결정상태의 나프탈렌 주변에 EPS를 형성하고 나프탈렌 결정 표면에 biofilm 상태로 부착하면서 나프탈렌의 분해를 촉진시키는 것으로 사료된다. LB, YM, MSM 배지등 영양물질의 함량이 서로 다른 배지를 사용하여 biofilm 생성량을 측정하였으며 부영양 상태의 LB 배지에서 biofilm이 가장 많이 생성되는 것으로 나타났다. 0.
- 1996). 균주 CZ6의 biofilm 생성특성을 관찰하기 위하여 영양물질의 함량이 다른 LB, YM, MSM 배지를 사용하여 실험한 결과, 24시간 내에 LB 배지에서 부착된 biofilm이 가장 많이 생성되는 것으로 나타났다 (Fig. 6). Davey and O'Toole(2000)은 biofilm이 형성되는 여러 가지 조건에서 배지에 따른 영양물질의 흡수상태에 따라 biofilm의 생성이 달라진다고 보고하였다.
- 미생물이 세포벽 주위에 협막을 형성하거나 점액성 물질로서 생산하는 EPS(extracellular polymeric substance)는 환경에 대한 미생물 적응의 한 현상으로 세포외 다당류는 미생물이 항체, 독성물질, 중금속, 원생동물 및 박테리오파지로부터 보호막의 역할을 하며 미량원소를 흡수하고 건조지역에서 수분을 유지시키는 등의 역할을 하여 극한 환경에서도 미생물의 환경적응을 가능하게 한다. 나프탈렌 분해 미생물인 CZ6도 MSM 배지에서 고농도의 나프탈렌의 환경에 노출되고 나프탈렌을 분해 할 때 나프탈렌 결정 주변에 EPS를 생성하여 결정상태의 나프탈렌에 부착되는 것이 관찰되었다(Fig. 4). 또한, CZ6는 서로 뭉쳐서 biofilm cell를 형성하고 결정상태의 나프탈렌 표면에 직접 감싸는 상태로 나프탈렌에 부착되어 있는 것이 관찰되었다(Fig.
- 1%의 나프탈렌을 유일한 탄소원으로 하여 30℃, 150 rpm의 조건에서 배양하였다. 며칠 후 현탁액을 접종액으로 사용하고 육안으로 미생물 성장을 확인한 후 같은 조건으로 계대배양을 최소 10회 이상 반복하였다. 미생물의 순수분리는 LB(Luria-bertani) 고체배지에서 도말한 후 우점종으로 성장한 단일 colony를 취하 였다.
- 2에 나타냈다. 배양 온도 30℃와 40℃에서 초기 대수증식기로 들어서 빠른 성장속도로 비슷하게 성장하나 25 h 후 부터는 배양 온도의 영향을 받아 유지기로 들어섰고 20℃에서는 기타 배양 조건보다 유도기가 길어서 20 h부터 대수증식기에 들어서서 30℃ 조건에서 배양 할 때와 비슷한 성장경향을 보이는 것으로 나타났다. 최적 배양온도 조건은 30℃에서 배양할 때 가장 좋음을 알 수 있었다.
- 일반적으로 물에 용해되어 있는 오염물질의 농도가 생분해에 있어서 아주 중요한 인자로 작용하는데 이는 미생물이 물에 용해된 기질을 우선적으로 이용하기 때문이다. 본 실험에서 배양액 중의 용해되어 있는 나프탈렌은 미생물의 성장증식에 의하여 고갈되고 미생물의 성장률은 점차 감소하기 때문에 낮은 농도의 기질 조건에서 먼저 대수증식기가 종료되었다. 반면에 0.
- 이는 TOC농도가 낮은 장성 토양에서 오염물질의 탈착이 흑음지 토양에 비하여 빠르게 진행되었기 때문이다. 세 가지 배지에서 4시간 이내에 액상의 나프탈렌은 모두 제거가 되고 토양에 잔류한 나프탈렌은 MSM 배지에서 제일 적은 량을 보이고 있어두 가지 토양에서 모두 초기단계에서 영양물질이 있는 조건에서는 무기배지 조건에서보다 나프탈렌의 분해가 느려진다는 것을 알 수 있다. 그러나 8시간 이후부터 LB 배지에서 잔류나프탈렌이 가장 빨리 감소하는데 Rice et al.
- 배양 온도 30℃와 40℃에서 초기 대수증식기로 들어서 빠른 성장속도로 비슷하게 성장하나 25 h 후 부터는 배양 온도의 영향을 받아 유지기로 들어섰고 20℃에서는 기타 배양 조건보다 유도기가 길어서 20 h부터 대수증식기에 들어서서 30℃ 조건에서 배양 할 때와 비슷한 성장경향을 보이는 것으로 나타났다. 최적 배양온도 조건은 30℃에서 배양할 때 가장 좋음을 알 수 있었다.
- 8에서는 흑음지 토양에서의 나프탈렌의 분해특성을 나타내었다. 흑음지 토양에 흡착되어 잔류한 나프탈렌은 초기에 MSM 배지를 사용한 토양슬러리에서 가장 적은 량을 나타내고, YM, LB 배지를 사용한 토양 슬러리 순으로 나타났다. 이는 일반적으로 알고 있는 현상으로 영양물질이 풍부한 조건 혹은 분해하기 쉬운 물질과 분해하기 어려운 유기오염물질이 동시에 존재할 경우에는 탄소원과 질소원이 풍부하게 포함되어 있는 LB 배지에서 미생물이 분해하기 쉬운 물질 혹은 영양물질을 직접적으로 흡수하고 오염물질은 나중에 탄소원으로 사용하고 무기배지인 MSM 배지에서 나프탈렌은 유일한 탄소원으로 나프탈렌의 분해가 가장 빨리 일어났기 때문이다(안영희 외, 2003).
후속연구
- 그러나 pH 6부터 pH 9인 넓은 pH 조건에서 모두 높은 성장활성을 보이고 있다. 그러므로 토양오염 복원에서 pH에 대한 완충능력이 우수하여 여러 가지 pH 조건의 오염토양에 적용가능 할 것으로 사료된다.
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