[논문]마이크로어레이 자료분석에서 모수적 방법을 이용한 유전자군의 유의성 검정

이선호; 이승규; 이광현

doi:10.5351/ckss.2009.16.3.397

마이크로어레이 자료분석에서 모수적 방법을 이용한 유전자군의 유의성 검정
Developing a Parametric Method for Testing the Significance of Gene Sets in Microarray Data Analysis 원문보기

한국통계학회 논문집 = Communications of the Korean Statistical Society, v.16 no.3, 2009년, pp.397 - 408

이선호 (세종대학교 응용통계학) , 이승규 (세종대학교 응용통계학) , 이광현 (세종대학교 응용통계학)

초록
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마이크로어레이 기술은 수만 개 유전자의 발현 패턴을 동시에 관찰하는 것을 가능하게 하였고, 이들을 하나씩 검정하여 찾아낸 특이발현 현상을 보이는 유전자를 중심으로 질병의 진단, 치료법 정립과 신약 개발을 위한 기본 정보를 확립하였다. 그러나 개별 유전자분석의 여러 문제점이 발견되면서 유전자들을 생물학적 대사경로나 염색체 위치가 같은 것끼리 묶은 집단을 분석하여 질병의 발생이나 생존에 영향을 미치는 집단을 찾는 방법이 제시되었다. 이러한 유전자 집단의 유의성에 대한 연구는 2002년에 MIT에서 비롯되어 GSEA, SAM-GS와 중심극한 정리의 개념을 이용한 모수적 방법인 PAGE 등이 사용되고 있다. 본 논문에서는 이들 통계량의 구조적 한계를 극복하고 계산이 간단한 새로운 모수적 방법을 제안하고 자료 분석을 통하여 효율성을 보였다.

Abstract ▼ AI-Helper

The development of microarray technology makes possible to analyse many thousands of genes simultaneously. While it is important to test each gene whether it shows changes in expression associated with a phenotype, human diseases are thought to occur through the interactions of multiple genes within a same functional cafe-gory. Recent research interests aims to directly test the behavior of sets of functionally related genes, instead of focusing on single genes. Gene set enrichment analysis(GSEA), significance analysis of microarray to gene-set analysis(SAM-GS) and parametric analysis of gene set enrichment(PAGE) have been applied widely as a tool for gene-set analyses. We describe their problems and propose an alternative method using a parametric analysis by adopting normal score transformation of gene expression values. Performance of the newly derived method is compared with previous methods on three real microarray datasets.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

실제 마이크로어레이 자료를 이용하여 새로 제안한 통계량 MTS의 모수적 가정 이 올바른지, 또한 기존의 다른 분석법들과 비교하여 유의한 유전자군을 잘 찾아내는지 알아보았다.
이러한 문제점을 보완하기 위해 유전자들을 개별적으로 분석하는 대신 기능이나 대사작용이 비슷한 것끼리 묶어 집합 단위로 분석(gene set analysis)하는 것으로 관심이 옮겨졌는데 유전자군 분석은 수만 개 유전자를 대상으로 개별분석을 하였을 때 생기는 다중검정의 문제를 완화시키는 장점도 있다. 유전자군 분석 방법으로 GSEA(Gene Set Enrichment Analysis) (Mootha 등, 2003; Subramanian 등, 2005), GSA(Gene Set Analysis) (Efron과 Tibshirani, 2007), PAGE(Parametric Analysis of Gene set Enrichment) (Kim과 Volsky, 2005)와 SAM- GS(Significance Analysis of Microarrays to Gene-Set analysis) (Dinu 등, 2007) 등이 개발되어 사용되고있는데 본 논문에서는 이러한 분석방법을 연구하여 단점을 보완하고 더 정확하고 빠른 방법으로 표현형 사이에 발현 차이를 보이는 유전자군을 찾는 방법을 개발하는 것이 목적이다.

가설 설정

분석 대상 유전자군이 표현형에 따라 유의한 차이를 나타낸다면 유전자군에 속한 유전자들 중 특이 발현 유전자가 많아 MTS의 값이 커질 것이다. 이 방법은 표현형에 따라 나타나는 각 유전자들의 발현 차이의 평균을 통계량으로 사용한 PAGE의 문제점을 보완하였고 모수적 방법으로 p-value를 구할 수 있어 permutation에 의존하는 GSEA와 SAM-GS 보다 훨씬 빠르고 간단히 분석을 할 수 있게 되었다.

제안 방법

그러나 합으로 과다발현 유전자와 발현이 억제된 유전자들이 공존하는 유전자군의 유의성을 판단할 경우 그들의 특이발현성 이 서로 상쇄되어 유전자군의 유의성을 찾아내지 못하는 문제가 생긴다. 그러므로 대표값의 합보다는 모수적 분포를 가정할 수 있는 대표값의 제곱합으로 이루어진 통계량을 찾는 시도를 하였다.
거치면 표준정규분포와 흡사한 분포를 따른다. 그러므로 아래의 절차에 따라 통계량을 약간 수정하여 표준정규분포를 만족하는 새로운 통계량을 제안하게 되었다.
더 자세한 비교를 위하여 P53 자료를 분석하였을 때 GSEA와 SAM-GS의 결과 사이에 큰 차이(GSEA FDR0.49, SAM-GS FDR0.01)가 있는 31개 pathway (Dinu 등 (2007)의 Table 4)를 대상으로 MTS를 이용하여 유의성 검정을 하였다(표3). MTS는 전체의 75%정도에 대하여 GSEA 보다는 검정통계량의 맥 락이 같은 SAM-GS와 같은 결론을 보였으나 Cytokine, Gl, GPCRs Class A Rhodopsin-like, ST Interleukin 4와 같은 pathway에 대하여는 SAM-GS와 뚜렷한 차이를 보였다.
더 자세한 비교를 위하여 p53 자료를 분석하였을 때 GSEA와 SAM-GS의 결과 사이에 큰 차이 (GSEA FDR ≥ 0.49, SAM-GS FDR ≤ 0.01)가 있는 31개 pathway (Dinu 등 (2007)의 Table 4)를대상으로 MTS를 이용하여 유의성 검정을 하였다(표 3). MTS는 전체의 75%정도에 대하여 GSEA 보다는 검정통계량의 맥락이 같은 SAM-GS와 같은 결론을 보였으나 Cytokine, Gl, GPCRs Class A Rhodopsin-like, ST Interleukin 4와 같은 pathway에 대하여는 SAM-GS와 뚜렷한 차이를 보였다.
유전자군의 유의성을 분석하는 기존의 방법들을 분석한 결과, 효과적인 통계량을 이용한 모수적 방법 개발의 필요성을 발견하고 다음의 세 단계로 나누어 접근하였다.
카이제곱분포로부터 계산한 MTS의 p-value와, permutation을 이용하여 구한 MTS의 근간이 되는 Σ(tS)2의 p-value를 비교하기 위하여 다음과 같은 모의실험을 하였다.
크기 k인 유전자군의 유의성검정을 하는 통계량 MTS = #에 대한 카이제곱분포의 가정이 맞는지 검증하기 위하여 각 유전자의 대표값 tM이 정규분포를 따르는지 먼저 알아보고, 그들의 제곱합이 카이제곱분포를 따르는지 확인하였다.
통계량 MTS가 유전자군의 유의성 분석에 적당한지 알아보기 위하여 GSEA, SAM-GS, PAGE의 결과와 비교하여 보았다(표 2). 각 방법마다 '유의한 유전자군'에 대한 정의에 조금씩 차이가 있기 때문에 분석 결과가 다른 것은 당연하며, 생물학적 검증없이 통계적 결론만으로 어떤 방법이 좋다고 단정할 수 없지만 MTS의 결과는 다른 방법들에 비하여 무난하다고 보인다.

대상 데이터

GSEA의 홈페이지(www.broad.mit.edu/gsea/)에 공개되어 대표적으로 인용되는 다음의 세 가지 마이크로어레이 실험 자료를 사용하였다.
NCI-60 collection of cancer cell lines으로부터 세포 자극의 신호에 반응하는 유전자 발현을 제어하는 p53 전사인자의 표적을 찾아내는 실험에 사용된 33예의 돌연변이군(MUT)과 17예의 정상군(NORM)의 자료로서 12625개의 유전자와 440개의 pathway 정보로 구성되어 있다. Subramanian 등(2005)과 Dinu 등 (2007) 등에서 분석 결과를 찾아볼 수 있다.
마이크로어레이 자료 분석에서, 어떤 기능, 또는 어떤 대사경로를 수행하는 유전자군이 가장 중요한가?'라는 문제에 제일 먼저 접근한 사람들은 미국 Columbia 대학교의 연구진들이었다. 그들은 기능이 같거나 생물학적 정보를 공유하는 유전자들로 class를 구성한 후 class에 속한 유전자를 대상으로 모든 짝진 유전자들의 상관계수 평균이나, 유전자별 분산분석에서 얻은 p-value를 이용하는 방법으로 class의 점수를 매기고 permutation을 사용하여 유의한 class를 선택하는 functional class scoring 방법을 제시하였다 (Pavlidis 등, 2002).

데이터처리

ⅱ) 전체 유전자로부터 크기가 k(40, 80, 120)인 유전자군을 임의로 구성하여 MTS 값을 계산하고 자유도 k인 카이제곱분포를 이용하여 p-value를 구한다. 또한 k개 유전자의 tS의 제곱합을 구한 후 phenotype에 대한 permutation을 1000번 실시하여 p-value를 구한다.

성능/효과

그림 1의 (a), (b)와 Kolmogorov-Smirnov의 정규성 검 정 결과를 보면 DM2는 정규점수를 사용하여 보정하기 전에도 이미 tS가 표준정규분포를 따르지만 p53과 Leukemia는 보정의 영향으로 tM이 표준정규분포를 만족한다는 것을 알 수 있다. 또한 그림 1(c)에서는 특이발현과 무관한 |tS|<0.
MTS는 전체의 75%정도에 대하여 GSEA 보다는 검정통계량의 맥락이 같은 SAM-GS와 같은 결론을 보였으나 Cytokine, Gl, GPCRs Class A Rhodopsin-like, ST Interleukin 4와 같은 pathway에 대하여는 SAM-GS와 뚜렷한 차이를 보였다. 31개 pathway가 돌연변이군과 정상군의 차이를 얼마나 잘 반영하는지 알아보기 위하여 p53의 50예 자료를 대상으로 leave one out cross validation(LOOCV)을 실시하여 잘못 분류된 sample의 수를 조사하였더 니평균 18.19개의 오류를 보였다. 그러나 MTS의 결과를 FDR = 0.
MTS는 전체의 75%정도에 대하여 GSEA 보다는 검정통계량의 맥락이 같은 SAM-GS와 같은 결론을 보였으나 Cytokine, Gl, GPCRs Class A Rhodopsin-like, ST Interleukin 4와 같은 pathway에 대하여는 SAM-GS와 뚜렷한 차이를 보였다. 31개 pathway가 돌연변이군과 정상군의 차이를 얼마나 잘 반영하는지 알아보기 위하여 p53의 50예 자료를 대상으로 leave one out cross validation(LOOCV)을 실시하여 잘못 분류된 sample의 수를 조사하였더 니평균 18.19개의 오류를 보였다. 그러나 MTS의 결과를 FDR = 0.
01)가 있는 31개 pathway (Dinu 등 (2007)의 Table 4)를대상으로 MTS를 이용하여 유의성 검정을 하였다(표 3). MTS는 전체의 75%정도에 대하여 GSEA 보다는 검정통계량의 맥락이 같은 SAM-GS와 같은 결론을 보였으나 Cytokine, Gl, GPCRs Class A Rhodopsin-like, ST Interleukin 4와 같은 pathway에 대하여는 SAM-GS와 뚜렷한 차이를 보였다. 31개 pathway가 돌연변이군과 정상군의 차이를 얼마나 잘 반영하는지 알아보기 위하여 p53의 50예 자료를 대상으로 leave one out cross validation(LOOCV)을 실시하여 잘못 분류된 sample의 수를 조사하였더 니평균 18.
01)가 있는 31개 pathway (Dinu 등 (2007)의 Table 4)를대상으로 MTS를 이용하여 유의성 검정을 하였다(표 3). MTS는 전체의 75%정도에 대하여 GSEA 보다는 검정통계량의 맥락이 같은 SAM-GS와 같은 결론을 보였으나 Cytokine, Gl, GPCRs Class A Rhodopsin-like, ST Interleukin 4와 같은 pathway에 대하여는 SAM-GS와 뚜렷한 차이를 보였다. 31개 pathway가 돌연변이군과 정상군의 차이를 얼마나 잘 반영하는지 알아보기 위하여 p53의 50예 자료를 대상으로 leave one out cross validation(LOOCV)을 실시하여 잘못 분류된 sample의 수를 조사하였더 니평균 18.
각 유전자들의 특성을 나타내는 대표값으로는 개별유전자분석에서 쓰이는 로그발현비, t-통계량, SAM의 보정된 t-통계량 등이 있고 개별 유전자의 대표값을 종합하는 방법으로 합을 이용하는 것을 고려할 수 있다. 그러나 합으로 과다발현 유전자와 발현이 억제된 유전자들이 공존하는 유전자군의 유의성을 판단할 경우 그들의 특이발현성 이 서로 상쇄되어 유전자군의 유의성을 찾아내지 못하는 문제가 생긴다.
유도되었다. 그러나 MTS와 비교한 값은 유전자간의 종속적인 관계를 고려하여 유전자 대신 sample 간의 permutation을 실시하여 얻은 결과이며 두 값이 서로 일관된 양상을 띠우고 있음을 보였다.
19개의 오류를 보였다. 그러나 MTS의 결과를 FDR = 0.01 기준으로 20개와 11 개의 두 군으로 나누어 비교한 결과 각각 평균 15.95개와 22.27개로 두 군 사이에 분명한 차이가 있었다(p-value < 0.01).
위의 세 가지 자료집합을 대상으로 개별 유전자분석을 한 결과 (표 1), p53과 DM2는 특이발현 유전자가 거의 존재하지 않는 반면 Leumekia는 FDR(false discovery rate) 기준 0.25 이하인 특이 발현 유전자가 전체의 92%나 차지하는 특별한 자료임을 보였다.
유전자가 많아 MTS의 값이 커질 것이다. 이 방법은 표현형에 따라 나타나는 각 유전자들의 발현 차이의 평균을 통계량으로 사용한 PAGE의 문제점을 보완하였고 모수적 방법으로 p-value를 구할 수 있어 permutation에 의존하는 GSEA와 SAM-GS 보다 훨씬 빠르고 간단히 분석을 할 수 있게 되었다.
그러나 그림 2에서 100개 군의 두 p-value를 비교한 결과 각 군의 순위 나 유의성 정도에는 거의 차이를 주지 않음을 알 수 있다. 이러한 결과는 마이크로어레이 실험의 특성인 대용량자료의 permutation을 위한 장시간의 컴퓨터 작업 대신 순간에 답을 얻을 수 있는 간편한 MTS의 활용가능성을 충분히 보여주고 있다.
등 (2005)은 이를 발전시켜 GSEA-P라는 software tool을 공개하였다. 전체 유전자 중 관심 유전자군에 속한 유전자들의 상대적인 특이 발현 순위를 Kolmogorov-Smimov 통계량을 사용하여 검 정하는 GSEA는 기존의 방법에 비해 알고리즘이 탄탄하여 현재 많이 사용되고 있지만특이발현 유전자가 존재하지 않는 경우에도 상대적으로 높은 순위의 유전자로 구성된 유전자군은 유의하다는 결론이 나오며, 낮은 순위의 특이발현 유전자로 구성된 관심 유전자군이라도 군에 속한 유전자의 수가클 경우 높은 순위의 특이발현 유전자로 구성된 관심 유전자군보다 종양에 더 유의한 영향을 준다는 결론이 나오는 허점 이 있다. (Damian과 Gorfine, 2004).

후속연구

개별유전자분석으로 검색된 특이발현 유전자가 소수일 때는 그들의 기능이나, 어떤 대사경로와 관련 있는지 조사가 가능하다. 그러나 일일이 조사하기에 많은 수의 유전자가 검색되거나 또는 하나도 검색되 지 않은 경우에는 후속 연구에 어려움이 생긴다. 또한 개별 유전자분석에서 동일한 자료라도 분석 방법을 다르게 하거나, 동일 질병에서 다른 자료를 사용하여 분석을 하였을 때 각기 얻어진 결과들 사이에 공통점을 찾기 힘들었다 (Curtis 등, 2005; Subramanian 등, 2005).

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Tusher, V. G., Tibshirani, R. and Chu, G. (2001). Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response, PNAS, 98, 5116-5121

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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