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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 전기자극을 통하여 실험동물에게 스트레스를 가한 후, 녹차 추출물과 테아닌을 복합 경구투여하였을 때실험동물의 혈액 및 뇌조직으로부터 스트레스 관련 신경전달물질 및 호르몬(dopamine, noradrenaline, serotonin, corticosterone)이증가 또는 감소는지 여부, 특히 두 물질의 복합 투여 시에 시너지 효과를 보이는지 여부를 확인하여 건강기능식품소재로서의 발굴가능성을 확인하였다.
제안 방법
- 녹차추출물 및 테아닌을 단독 또는 복합으로 4주간 경구투여하 고 electric foot shock으로 스트레스를 유도한 후 혈청 및 뇌 주요 조직의 dopamine함량 변화를 측정하였다. 스트레스 유도 전후의 도파민 함량을 비교하였을때 스트레스 유도 대조군의 혈장, 대뇌피질 및 해마에서는 유의한 변화를 보이지 않았으며(Fig.
- 실험기간 중의 실험동물은 격리용 마우스 케이지당 3마리씩 수용하였고, 사육실 환경조건은 실내온도 23±3oC, 상대습도 55±10%, 조명시간 12시간(오전 7시~ 오후 7시), 조도 150~200 lux로 조절되었다. 물과 실험동물용 사료는 자유로이 섭취할수 있도록 하였고, 녹차추출물 및 테아닌을 물에 녹여 투여하기 위해 1일 평균 물 섭취량을 측정하였다.
- 분리/적출된 혈액 및 뇌조직내 dopamine(DA), noradrenaline (NE), serotonin(5-HT), corticosterone(CS)의 함량을 ELISA로측정하였는데, dopamine과 noradrenaline은 Norepinephrine/ Dopamine ELISA(Cat# BA-10-5500, LND GmbH & Co. KG, Nordhom, Germany), serotonin은 Serotonin Ultra Sensitive ELISA(Cat# BA-10-5900, LND GmbH & Co. KG, Nordhom, Germany), corticosterone은 Corticosterone EIA kit(cat# 900-097, Assay Designs, Inc. Ann Arbor, MI, USA)을 사용하였고제조사에서 제공한 실험방법에 따라 분석하였다.
- 실험동물에 스트레스를 유도하는 방법으로서 electric foot shock 방법을 이용하였다. 시험물질 투여 종료 후 electric foot shock을 30분간 5초 간격으로 1초간 0.6 mA의 전기 충격을 가하여 스트 레스를 유도한 후 마우스를 부검, 혈액 및 뇌를 적출하였다.
- 실험기간 중의 실험동물은 격리용 마우스 케이지당 3마리씩 수용하였고, 사육실 환경조건은 실내온도 23±3oC, 상대습도 55±10%, 조명시간 12시간(오전 7시~ 오후 7시), 조도 150~200 lux로 조절되었다.
- 실험동물은 평균 체중과 분산이 균질하도록 군을 분리하고 각군당 12마리로 하였으며 1일 물 섭취량을 고려하여 물에 녹차추출물 24 mg/kg과 테아닌 4 mg/kg 을 각각 단독 또는 혼합하여 물에 녹여서 4주간 투여하였다. 양성대조군으로 diazepam을 2 mg/ kg의 용량으로 스트레스 유도 30분 전에 1회 복강 투여(i.
- 실험동물은 평균 체중과 분산이 균질하도록 군을 분리하고 각군당 12마리로 하였으며 1일 물 섭취량을 고려하여 물에 녹차추출물 24 mg/kg과 테아닌 4 mg/kg 을 각각 단독 또는 혼합하여 물에 녹여서 4주간 투여하였다. 양성대조군으로 diazepam을 2 mg/ kg의 용량으로 스트레스 유도 30분 전에 1회 복강 투여(i.p.)하였다.
- 전기자극에 의한 스트레스 유도시 corticosterone의 함량 변화를 측정하였다. 스트레스 유도 대조군의 corticosterone 함량은 혈장 및 뇌의 세 영역 모두에서 스트레스 비유도 정상군(혈장: 9.
- 전기자극에 의한 스트레스를 유도했을 때 noradrenaline 함량 변화를 측정하였다. 스트레스 유도 대조군의 noradrenaline 함량은 혈청 및 뇌의 세 영역 모두에서 스트레스 비유도 정상군(혈장: 38.
- 전기자극에 의한 스트레스를 유도했을때 serotonin의 함량 변화를 측정하였다. 혈장 및 뇌의 세 영역 모두에서 스트레스 유도 대조군의 serotonin 함량이 스트레스 비유도 정상군(혈장: 19.
- 혈액이 제거된 마우스로부터 brain을 적출하여 -20oC에서 얼린 후 대뇌피질(cortex)과 해마(hippocampus), 줄무늬체(striatum) 부분을 분리하였다. 여기에 200~500 µl의 extraction buffer (0.
대상 데이터
- 본 시험에 사용된 녹차추출물(Tiantai ming yuan tea products, China)과 L-테아닌(Taiyo Kagaku, Japan)은 (주)LG 생활건강에서 공급받아 사용하였다. 본 시험에서 사용한 녹차추출물은 Camellia sinensis의 건조잎을 열수 추출한 것으로 총 카테킨 함량이 20% 이상이며 카페인 함량이 5% 이하인 건강기능식품공 전에서 규정한 규격에 합당한 원료를 사용하였다.
- 본 시험에 사용된 녹차추출물(Tiantai ming yuan tea products, China)과 L-테아닌(Taiyo Kagaku, Japan)은 (주)LG 생활건강에서 공급받아 사용하였다. 본 시험에서 사용한 녹차추출물은 Camellia sinensis의 건조잎을 열수 추출한 것으로 총 카테킨 함량이 20% 이상이며 카페인 함량이 5% 이하인 건강기능식품공 전에서 규정한 규격에 합당한 원료를 사용하였다.
- 생후 8주 된 수컷 ICR mouse를 중앙실험동물(주)로부터 구입 하여, 1주간 순화시키면서 일반증상을 관찰하였고, 체중을 측정하여 건강한 것만을 선별하여 사용하였다. 실험동물은 충북대학교 실험동물연구지원센타에서 GLP 수준의 관리기준에 따라 수용하고, 관리, 투여, 실험을 실시하였다.
- 생후 8주 된 수컷 ICR mouse를 중앙실험동물(주)로부터 구입 하여, 1주간 순화시키면서 일반증상을 관찰하였고, 체중을 측정하여 건강한 것만을 선별하여 사용하였다. 실험동물은 충북대학교 실험동물연구지원센타에서 GLP 수준의 관리기준에 따라 수용하고, 관리, 투여, 실험을 실시하였다. 실험기간 중의 실험동물은 격리용 마우스 케이지당 3마리씩 수용하였고, 사육실 환경조건은 실내온도 23±3oC, 상대습도 55±10%, 조명시간 12시간(오전 7시~ 오후 7시), 조도 150~200 lux로 조절되었다.
데이터처리
- 각각의 단독투여에 대한 복합물의 상승효과는 Bonferroni's multiple comparison test를 이용하여 통계적 유의성 검정을 실시하였다.
- 연구 결과치는 one-way ANOVA 로 분석하여 투여군의 유의성 여부를 판결하고 그 결과를 통한 군간의 유의성은 post hoc test로 Dunnett's test 를 선택하여 분석하였다.
이론/모형
- 실험동물에 스트레스를 유도하는 방법으로서 electric foot shock 방법을 이용하였다. 시험물질 투여 종료 후 electric foot shock을 30분간 5초 간격으로 1초간 0.
성능/효과
- Cold stress 를 통하여 스트레스 상태를 실험동물에 유도할 경우 norepinephrine 유리를 증가시키고, basolateral amygdala 의 neuronal activity 를 활성화시킨다고 보고되어 있으며, 10) Saito 등이 발표한 연구에도 급성 cold stress 상태에서 noradrenaline의 분비가 증가하여 medial preoptic area 를 조절하여 체온을 유지한다고 알려졌다. 11) Serotonin의 경우 간헐적 cold stress 를 유도하였을 경우 serotonin의 level 이감소되며, serotonin 결핍이 학습능력과 주의력을 떨어뜨린다는 연구결과가 보고되어 있으며, 12) 선천적으로 수면시간이 긴 마우 스와 짧은 마우스를 이용하여 구속 스트레스(restraint stress)를유도하여 corticosterone의 level과 ethanol의 안정작용(sedative) 이 미치는 영향을 연구한 결과에서도 급성 및 반복 구속 실험에서 corticosterone 의 level 이 상승한 것을 확인할 수 있었다. 13) 그리고 현재 임상적으로 흔히 사용되는 항불안 약물인 benzodiazepine 류의 약물들을 사용하여 본 실험에서 측정한 신경전달 물질들의 level을 측정해 본 연구결과들에 의하면, electric foot shock 과 microdialysis 를 이용, 뇌내에 CRF를 주입할 경우 비처리군인 대조군에 비하여 norepinephrine이 300% 이상 수치가상승하였으며, 대표적인 benzodiazepine 계통 약물인 chlordiazepoxide를 5 mg/kg 복강주사로 처리하였을 경우 상승된 norepinephrine 수치를 유의적으로 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
- 11) Serotonin의 경우 간헐적 cold stress 를 유도하였을 경우 serotonin의 level 이감소되며, serotonin 결핍이 학습능력과 주의력을 떨어뜨린다는 연구결과가 보고되어 있으며, 12) 선천적으로 수면시간이 긴 마우 스와 짧은 마우스를 이용하여 구속 스트레스(restraint stress)를유도하여 corticosterone의 level과 ethanol의 안정작용(sedative) 이 미치는 영향을 연구한 결과에서도 급성 및 반복 구속 실험에서 corticosterone 의 level 이 상승한 것을 확인할 수 있었다. 13) 그리고 현재 임상적으로 흔히 사용되는 항불안 약물인 benzodiazepine 류의 약물들을 사용하여 본 실험에서 측정한 신경전달 물질들의 level을 측정해 본 연구결과들에 의하면, electric foot shock 과 microdialysis 를 이용, 뇌내에 CRF를 주입할 경우 비처리군인 대조군에 비하여 norepinephrine이 300% 이상 수치가상승하였으며, 대표적인 benzodiazepine 계통 약물인 chlordiazepoxide를 5 mg/kg 복강주사로 처리하였을 경우 상승된 norepinephrine 수치를 유의적으로 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 14) 그러나 이러한 약물들은 지나친 안정효과(sedative effect), 근이완,
- 6 mA 유도)을 가해 스트 레스를 유도했을 때, 스트레스 유도 대조군에 비해 noradrenaline 과 corticosterone의 수치가 혈장 및 뇌의 피질(cortex), 해마 (hippocampus), 줄무늬체(striatum) 영역에서 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었으며, serotonin 수치는 혈장(plasma) 및 피질(cortex), 해마(hippocampus), 줄무늬체(striatum) 전 영역에서 농도 의존적으로 유의적인 증가를 확인할 수 있었다. Dopamine 은 뇌의 줄무늬체(striatum) 영역에서만 유의적인 변화가 있었고 스트레스 유도시 30% 정도 증가되는 것이 확인되었으며, 녹차 추출물과 테아닌의 단독 투여에 의해서는 유의차가 없었으나 두물질의 복합투여시에는 스트레스 유도 대조군 대비 69.5% 수준 으로 감소하여 두 물질의 혼합에 의한 상승효과를 나타내었다. Noradrenalin, corticosterone 및 serotonin의 함량변화에서도 혈장 및 뇌조직의 각각의 특정부위에서 녹차추출물과 테아닌 복합 물은 각각 단일물질 보다 더 큰 저해효과를 확인하였다.
- 5% 수준 으로 감소하여 두 물질의 혼합에 의한 상승효과를 나타내었다. Noradrenalin, corticosterone 및 serotonin의 함량변화에서도 혈장 및 뇌조직의 각각의 특정부위에서 녹차추출물과 테아닌 복합 물은 각각 단일물질 보다 더 큰 저해효과를 확인하였다.
- 결과는 평균 ±standard error(S.E)로 나타내었고 p<0.05 이하를 유의적 차이로 보았다(* p<0.05, ** p<0.01).
- 뇌의 대뇌피질에 서도 녹차추출물과 테아닌 복합투여 시에 스트레스 유도 대조군대비 51.6%(814.2±167.2 pg/mg protein, p<0.01, ) 수준으로 감소하여 더 우수한 효과를 보였다.
- 뇌의 해마에서는 녹차추출물 24 mg/kg(96.2±2.5 ng/mg protein, p<0.05, 스트레스 대조군 대비 89.2%), 테아닌 4 mg/kg(67.0±0.8 ng/mg protein, p<0.05, 스트레스 유도 대조군 대비 62.1%)을단독으로 투여했을 때 보다 두 물질을 함께 투여했을 때(47.4±1.6 ng/mg protein, p<0.01, 스트레스 유도 대조군 대비 44%) 더 큰 감소효과가 나타났으며, 스트레스 유도 대조군의 44% 수준으로 유의하게 감소하였다.
- 뇌의 해마와 피질에서는 녹차추출물(24 mg/kg)과 테아닌(4 mg/kg) 단독 및 복합투여시 모두 유의적으로 증가하였으며, 특히 복합투여시에는 스트레스 유도 대조군 대비 각각 해마에서 171.3%(34.6±0.2 ng/mg protein, p<0.01), 대뇌피질에서 461.5% (12.0±0.1 ng/mg protein, p<0.01)의 수준을 보였다.
- 대뇌피질에서도 녹차추출물 24 mg/kg(67.2± 1.4 ng/mg protein, p<0.01, 스트레스 유도 대조군 대비 72.3%) 과 테아닌 4 mg/kg(63.3±1.0 ng/mg protein, p<0.01, 스트레스 유도 대조군 대비 68.1%)을 단독 및 복합투여시 모두 유의한 감소를 보였고, 특히 복합투여했을때 스트레스 유도 대조군의 56.1% (60.4±0.6 ng/mg protein, p<0.01) 수준으로 감소하였다.
- 현재 임상에서는 정신치료와 함께 약물치료를 병행하고 있는데 중추신경을 억제함으로써 긴장된 중추신경을 완화시키고, 진정을 시켜 증상의 완화 및 치료를 목적으로 하는 약물들이 주로 사용 되고 있다. 본 연구에서는 항스트레스 효능 평가를 위하여 녹차 추출물 및 테아닌을 단독 또는 복합 투여한 후 electric foot shock(30분 동안 5초 간격으로 1초간 0.6 mA 유도)을 가해 스트 레스를 유도했을 때, 스트레스 유도 대조군에 비해 noradrenaline 과 corticosterone의 수치가 혈장 및 뇌의 피질(cortex), 해마 (hippocampus), 줄무늬체(striatum) 영역에서 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었으며, serotonin 수치는 혈장(plasma) 및 피질(cortex), 해마(hippocampus), 줄무늬체(striatum) 전 영역에서 농도 의존적으로 유의적인 증가를 확인할 수 있었다. Dopamine 은 뇌의 줄무늬체(striatum) 영역에서만 유의적인 변화가 있었고 스트레스 유도시 30% 정도 증가되는 것이 확인되었으며, 녹차 추출물과 테아닌의 단독 투여에 의해서는 유의차가 없었으나 두물질의 복합투여시에는 스트레스 유도 대조군 대비 69.
- 스트레스 유도 대조군의 corticosterone 함량은 혈장 및 뇌의 세 영역 모두에서 스트레스 비유도 정상군(혈장: 9.0±0.8 ng/ml plasma, 피질: 164.4±26.1 pg/mg protein, 해마: 161.4±32.3 pg/mg protein, 줄무늬체: 227.1±45.5 pg/mg protein) 에 비해 유의하게 증가하였다(혈장: 31.7±0.7 ng/ml plasma, 대뇌피질: 1579.4±176.4 pg/mg protein, 해마: 1774.5±248.5 pg/ mg protein, 줄무늬체: 2514.4±450 pg/mg protein).
- 스트레스 유도 대조군의 noradrenaline 함량은 혈청 및 뇌의 세 영역 모두에서 스트레스 비유도 정상군(혈장: 38.2±0.9 ng/ml plasma, 피질: 46.6±2.8 ng/mg protein, 해마: 38.2±0.3 ng/mg protein, 줄무늬체: 6.9±1.2 ng/mg protein) 에 비해 유의적으로 증가하였다(혈장: 79.0±1.6 ng/ml, 피질:92.9±1.5 ng/mg protein, 해마: 107.8±0.7 ng/mg protein, 줄무늬체: 27.2±1.0 ng/mg protein).
- 스트레스 유도 전후의 도파민 함량을 비교하였을때 스트레스 유도 대조군의 혈장, 대뇌피질 및 해마에서는 유의한 변화를 보이지 않았으며(Fig. 1a, b) 뇌의 줄무늬체(striatum)에서만 스트레스 비유도 정상군(60.4± 1.8 ng/mg protein)보다 dopamine 함량이 유의하게 증가하였다 (90.4±2.9 ng/mg protein).
- 시험 물질을 투여한 실험군에서의 corticosterone 함량 변화를 보면, 혈장에서는 녹차 추출물과 테아닌을 단독 투여하였을 때및 복합 투여하였을 때 모두 스트레스 유도 대조군과 대비하여 유의적으로 감소하였으나, 특히 복합 투여하였을 때 상승 효과를 나타내어 스트레스 유도 대조군 대비 24.9% 수준(7.9±0.3 ng/ ml plasma, p<0.01)으로 감소하였다(Fig. 4a).
- 시험물질을 투여한 실험군에서의 noradrenaline 함량 변화를 보면, 혈장에서는 녹차 추출물 24 mg/kg(61.2±4 ng/ml plasma, p<0.01, 스트레스 유도 대조군 대비 77.5%)과 테아닌 4 mg/kg (65.0±2.3 ng/ml plasma, p<0.01, 스트레스 유도 대조군 대비 82.3%) 단독투여의 경우보다 두 물질을 함께 투여했을 때(49.2± 4.8 ng/ml plasma, p<0.01, 스트레스 유도 대조군 대비 62.3%) 더 큰 감소효과가 나타나 상승효과를 나타내었다(Fig. 2a).
- 시험물질을 투여한 실험군에서의 serotonin 함량변화를 보면, 혈장에서는 녹차 추출물 단독투여시에만 스트레스 유도군에 대비하여 유의적으로 증가하였다(18.2±2.1 ng/ml plasma, p<0.05) (Fig. 3a).
- Komiya 등은 lemon oil 향을 이용한 anti-stress 효능을 마우스의 serotonin과 dopamine 활성 측정를 통하여 측정한 결과, lemon oil 향이 dopamine의 활성을 억제하며, serotonergic neuron 활성을 증가시켜 항스트레스 효능이 있음을 보였으며, 15) Oh 16) 등은 Magnolia obovata 추출물에서 GABA/benzodiazepine receptor가 연관된 항불안 효능을 보고한 바 있다. 이와 같은 연구결과들을 비교할 때 스트레스/ 불안 유도 시 dopamine, noradrenaline 및 corticosterone의 level이 증가하고, serotonin 의 level 이 감소하는 것을 알 수 있으며, 본 시험 물질이 실제 임상에서 사용되고 있는 약물들과 유사하게 신경전달물질 및 호르몬과 같은 인자들의 변화를 줄여주는 것으로 보아 녹차추출물/테아닌 복합물이 항불안/항스트레스 효능을 보인다고 판단된다.
- 줄무늬체에 서는 녹차추출물(24 mg/kg) 단독투여시에는 유의한 증가를 보이지 않았으나, 테아닌 단독 투여시와 복합투여시 스트레스 유도 대조군 대비 각각 193.5%(32.5±0.5 ng/mg protein) 및 225% (37.8±0.7 ng/mg protein)수준으로 증가하는 상승효과를 보였다.
- 5배 이상 증가하는것으로 나타났으며, 18) 또한 serotonin의 농도도 해마(hippocampus) 및 줄무늬체 (striatum), 시상하부(hypothalamus)에서 유의적으로 증가하였다. 테아닌의 주입방법과 용량, 스트레스 부가여부 등 본 실험과 차이점에 따라서 신경전달물질 및 호르몬의 변화양상에도 차이가 있는 것으로 보이나 본 실험에서와 마찬가지로 테아닌이 불안 및스트레스와 관련된 신경전달물질 및 호르몬을 조절하는 역할을 하는 것에서는 본 시험과 일치한다고 판단된다. 특히 본 연구에 서는 녹차추출물과의 병용투여에 의해서 호르몬의 조절작용에 있어서 시너지효과가 나타남을 확인하였는데 이는 녹차추출물내의 테아닌 함량이 불과 1~2% 인것에 비해서 큰 상승효과를 확인하였고 그 원인으로는 녹차추출물내의 카테킨과 같은 기타 항산화물질과 연관될것으로 추측되나 그 기전에 대해서는 후행연 구가 필요할것으로 보인다.
- 한편, 녹차 추출물(24 mg/kg)과 테아닌 (4 mg/kg)을 각각 단독으로 투여하였을때는 스트레스 유도 대조군 대비하여 유의한 변화가 없었으나, 동일 용량으로 복합투여하 였을때 뇌의 줄무늬체에서 스트레스 유도 대조군(90.4±2.9 ng/mgprotein)대비 69.5%(62.8±2.2 ng/mg protein, p< 0.01) 수준으로 유의하게 감소하였으며, 양성대조군으로 사용한 diazepam (63.8±1.3 ng/mg protein)과 동등한 수준을 보였다(Fig. 1b).
- 해마와 줄무늬체의 경우, 테아닌 단독 투여 시 및 녹차추출물과 테아닌 복합 투여 시에 유의한 감소 효과를 보였으며, 특히 복합 투여 시 해마와 줄무늬체에서 각각 스트레스 유도 대조군 대비 25.6%(454.2±87.0 pg/mg protein) 및 20.2%(508.5±83.7 pg/mg protein) 수준으로 감소하 였다.
- 혈장 및 뇌의 세 영역 모두에서 스트레스 유도 대조군의 serotonin 함량이 스트레스 비유도 정상군(혈장: 19.5± 0.6 ng/ml plasma, 대뇌피질: 14.8±0.2 ng/mg protein, 해마:48.1±0.9 ng/mg protein, 줄무늬체: 47.6±0.7 ng/mg protein)에 비해 유의적으로 감소하였다(혈장: 9.9±0.7 ng/ml plasma, 대뇌 피질: 2.6±0.1 ng/mg protein, 해마: 20.2±2.7 ng/mg protein, 줄무늬체: 16.8±0.4 ng/mg protein).
후속연구
- 본 연구결과는 녹차추출물과 테아닌은 복합물이 불안증 및 스트레스로 인해 생체내에 발현되는 신경전달물질 및 호르몬 조절 작용을 통하여 그 유발 원인을 억제시킴으로서 우수한 항불안/ 항스트레스 기능성 물질로 개발이 가능하리라 판단된다.
- 테아닌의 주입방법과 용량, 스트레스 부가여부 등 본 실험과 차이점에 따라서 신경전달물질 및 호르몬의 변화양상에도 차이가 있는 것으로 보이나 본 실험에서와 마찬가지로 테아닌이 불안 및스트레스와 관련된 신경전달물질 및 호르몬을 조절하는 역할을 하는 것에서는 본 시험과 일치한다고 판단된다. 특히 본 연구에 서는 녹차추출물과의 병용투여에 의해서 호르몬의 조절작용에 있어서 시너지효과가 나타남을 확인하였는데 이는 녹차추출물내의 테아닌 함량이 불과 1~2% 인것에 비해서 큰 상승효과를 확인하였고 그 원인으로는 녹차추출물내의 카테킨과 같은 기타 항산화물질과 연관될것으로 추측되나 그 기전에 대해서는 후행연 구가 필요할것으로 보인다.
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