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문제 정의
- 본 연구는 가축의 생산성 및 사료효율의 증대를 위한 헤미셀룰로오스 분해효소인 xylanase과 mannanase를 산업적으로 생산하기 위하여 효소의 활성이 좋은 균주를 선발할 목적으로 실시하였다.
- 본 연구에서는 xylanase, mannanase를 생산하는 미생물균주를 분리하기 위해 1차로 토양 및 낙엽 등에서 곰팡이균주를 약 50여 주 분리하였으며, 1차 선발된 균주로부터 xylanase, mannanase를 생산하는 미생물 분리를 위해 xylanase 생성균주 선별배지, mannanase 생성균주 선별배지에 single colony를 접종한 후 clear zone이 생기는 15종의 균주를 2차 선발하였다. 2차 선발된 균주를 개별적으로 배양하여, DNS 방법을 활용하여 xylanase, mannanase 효소활성을 측정하여 6종의 균주를 선발하였다.
가설 설정
- 1) All the screened strains were cultured on czapek broth at 30℃ for 7 days.
제안 방법
- , USA)을 수행하였다. 0.8% agarose gel 전기영동을 통하여 band를 확인하고 AccuPrep PCR Purification kit (Bioneer Corp., Daejon, Korea)로 정제하였다. 정제된 PCR product를 Automatic DNA sequencer (ABI3700, Applied Biosystems Inc.
- 1차 선별된 균주로부터 xylanase, mannanase를 생산하는 미생물분리를 위해 xylanase 생성균주 선별배지 (xylanase screening medium : Xylan 10g/L, Yeast extract 5 g/L, Bactopeptone 5 g/L, K2HPO4 1 g/L, Agar 15 g/L; pH 5.0)에서 30℃에서 72시간 배양한 후 oat spelt xylan의 분해능을 가진 균주를 선별하였으며, mannanase 생성균주 선별배지[mannanase screening medium : Locust bean gum (LBG) 10 g/L, Yeast extract 3 g/L, Peptone 5 g/L, KH2PO4 1 g/L, Agar 20 g/L; pH 5.0]에 colony를 도말하여, 30℃에서 72시간 이상 배양하여 clear zone이 생기는 균주를 2차 선별하였다.
- 본 연구에서는 xylanase, mannanase를 생산하는 미생물균주를 분리하기 위해 1차로 토양 및 낙엽 등에서 곰팡이균주를 약 50여 주 분리하였으며, 1차 선발된 균주로부터 xylanase, mannanase를 생산하는 미생물 분리를 위해 xylanase 생성균주 선별배지, mannanase 생성균주 선별배지에 single colony를 접종한 후 clear zone이 생기는 15종의 균주를 2차 선발하였다. 2차 선발된 균주를 개별적으로 배양하여, DNS 방법을 활용하여 xylanase, mannanase 효소활성을 측정하여 6종의 균주를 선발하였다. 선별된 균주는 액상배양에서 생산한 xylanase, mannanase 효소활성이 각각 0.
- 2차 선별된 15종의 균주를 개별적으로 배양하여, DNS 방법을 활용하여 xylanase, mannanase의 효소활성을 측정하여 6종의 균주를 선발하였고 재검증을 위하여 효소활성을 가지고 있는 6종의 균주를 500 mL 용량의 erlenmeyer flask로 배양하여 원심분리 후 배양상등액을 취하여 효소활성을 측정한 결과를 Table 2에 나타내었다. 대체로 2가지 효소활성을 모두 가지고 있으나, C-8 균주가 1.
- 2차 선별된 균주를 500 mL 용량의 erlenmeyer flask에 czapek broth (pH 5.0)로 30℃, 150rpm, 72시간 이상 배양하여 그 배양액을 5,000 rpm, 10분간 원심분리 후 상등액을 취하여, xylanase와 mannanase의 효소활성을 측정하였다.
- 3차 선발 과정을 통하여 최종 선발되어진 E-3 균주에 대한 균 동정의 일환으로 18S와 28S rDNA의 염기서열을 분석하였다. 분석 결과 582 bp 크기의 18S rDNA 사이의 internal space region의 염기서열을 얻었으며, Genbank 염기서열을 분석한 결과 Aspergillus niger와 99% 일치하는 결과를 나타내었다 (Fig.
- Mannanase 활성은 LBG을 기질로 하여 효소 반응 후에 유리된 환원당을 DNS 방법으로 다음과 같이 정량함으로써 측정하였다. 증류수에 현탁시킨 1% (w/v) LBG 용액 1 mL와 50 mM sodium citrate buffer (pH 5.
- DNS 용액 2 mL을 첨가하여 반응을 정지시키고 끊는 물에서 5분 동안 방치하여 발색시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Mannose를 표준시료로 사용하여 농도별 용액을 만든 후 동일 조건으로 발색시켜 조사한 흡광도와 비교함으로써 유리된 환원당의 양을 결정하였다. 효소 활성도 1.
- Xylanase와 mannanase 효소활성이 우수한 균주를 분리하기 위하여 토양 및 낙엽 등에서 수집한 시료 각 15g을 멸균된 증류수에 연속희석한 후 2% agar가 함유된 czapek agar (NaNO3 1g/L, K2HPO4 1 g/L, MgSO4•7H2O 0.5 g/L, KCl 0.5 g/L, FeSO4•7H2O 0.0004 g/L, Peptone 5 g/L, Glucose 30 g/L; pH 5.0) plate에 도말하고 30℃에서 72시간이상 배양하여 고체배양에 가장 유리한 생장조건을 가진 곰팡이 위주로 1차 선별하였다.
- DNS 용액 2 mL을 첨가하여 반응을 정지시키고 끊는 물에서 5분 동안 방치하여 발색시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Xylose를 표준시료로 사용하여 농도별 용액을 만든 후 동일 조건으로 발색시켜 조사한 흡광도와 비교함으로써 유리된 환원당의 양을 결정하였다. 효소 활성도 1.
- gov/)에서 제공하는 Advanced Blast Search 프로그램을 통하여 GenBank의 염기서열과 비교함으로써 진균의 유전자동정을 하였다. 선발된 균주들의 분자생물학적 동정을 통하여 사료첨가제로서의 안전성을 확인하였다.
- 선발된 균주를 czapek broth에서 배양하여 원심분리한 후 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 동결건조하여 동결건조된 균체를 액체질소를 이용하여 마쇄하고 25 mg을 취하여 500 μL lysis buffer [400 mM Tris-HCl (pH 8.
- 선발된 우수 균주인 E-3를 대상으로 형태학적 동정을 실시하였다. Czapek agar medium에 30℃/3일 배양한 결과, colony의 색깔은 흰색에서 갈색, 검은색으로 변화하였으며, conidia는 대체로 둥근 형태에 3.
- 선발된 우수균주를 대상으로 형태학적 동정을 실시하였다. 0.
- 액상배양에서 우수한 효소활성을 가지고 있는 균주를 wheat bran 기본배지 (wheat bran 50%, water 50%)에 30℃, 150 rpm, 72시간 이상 고상배양하여 효소활성을 측정하여 상대적으로 우수한 균주를 최종 선별하였다.
- 이 상등액으로부터 Wizard Genomic DNA Purification Kit (Progmega Corp., USA)를 사용하여 genomic DNA를 추출한 다음 primer ITS1 (5‘-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)과 LR5 (5‘-TCCT- GAGGGAAACTTCG-3’)를 사용하여 denaturation 95℃/1분, annealing 52℃/1분, extension 72℃/1분, termination extension 72℃/10분의 조건으로 30 cycle 동안 PCR (GeneAmp PCR System 9600, Perkin-Elmer Co., USA)을 수행하였다.
- 염기서열 분석 시에는 primer ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG)와 ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC)를 사용하였다. 이 후 Clustal X (ver.1.83) 프로그램을 이용하여 염기서열을 조합하여 The National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www. ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 Advanced Blast Search 프로그램을 통하여 GenBank의 염기서열과 비교함으로써 진균의 유전자동정을 하였다. 선발된 균주들의 분자생물학적 동정을 통하여 사료첨가제로서의 안전성을 확인하였다.
- , Daejon, Korea)로 정제하였다. 정제된 PCR product를 Automatic DNA sequencer (ABI3700, Applied Biosystems Inc., Foster, CA, USA)로 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석 시에는 primer ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG)와 ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC)를 사용하였다.
대상 데이터
- , Foster, CA, USA)로 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석 시에는 primer ITS1 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG)와 ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC)를 사용하였다. 이 후 Clustal X (ver.
- 토양 및 낙엽 등을 수집하여 균 분리를 위한 시료로 사용하였고, 미생물을 선발할 때 고상 배양에 용이한 곰팡이 위주로 선발하였다. 곰팡이 균주의 선발은 czapek agar plate상에 형성된 colony의 형태와 크기에 따라 선발하였다.
이론/모형
- 선발된 우수균주를 대상으로 형태학적 동정을 실시하였다. 0.6% agar이 첨가된 czapek agar medium (pH 5.0)에 30℃에서 3일간 배양하여, colony, conidia, conidiophore, conidial heads, sterigmata, vesicles의 형태와 색깔, 특징을 microscope photogram으로 측정하여 그 결과를 Barron (1968)과 Arx (1970)의 방법에 따라 확인하였다.
- Xylanase 활성은 oat spelt xylan을 기질로 하여 효소 반응 후에 유리된 환원당을 3, 5-dinitrosalicylic acid (DNS) 방법 (Miller, 1959)으로 다음과 같이 정량함으로써 측정하였다. 증류수에 현탁시킨 1% (w/v) oat spelt xylan 용액 1 mL와 50 mM sodium citrate buffer (pH 5.
성능/효과
- 1차 선발된 균주로부터 xylanase, mannanase를 생산하는 미생물분리를 위해 xylanase 생성균주 선별배지, mannanase 생성균주 선별배지에 single colony를 접종한 후 30℃에서 72시간 배양하여 clear zone이 생기는 균주를 2차 선발한결과, 15종의 균주가 2차 선별되었다 (Table 1).
- Czapek agar medium에 30℃/3일 배양한 결과, colony의 색깔은 흰색에서 갈색, 검은색으로 변화하였으며, conidia는 대체로 둥근 형태에 3.0~5.0 μm이며, conidiophore는 엷은 갈색에 길이는 1.0~1.5 mm, 직경은 2.0~20.0 μm이고, conidial head는 검거나 검은 갈색에 직경은 200~300 μm 이며, sterigmata는 두 가지 형태이며, 첫 번째는 직경 5.5~10.0 μm, 두 번째는 3.0~4.0 μm이었다.
- 액상배양에서 가장 우수한 효소활성을 가지고 있는 3균주를 선발하여 고상배양 효소활성을 측정한 결과를 Table 3에 나타내었다. 고상배양에서도 xylanase activity는 C-8 균주 (220.0 unit/g)가, mannanase activity는 C-5 균주 (40.3 unit/g)가 가장 우수하였으나, E-3 균주는 xylanase, mannanase activity가 각각 197.3 unit/g, 39.9 unit/g으로 모두 우수한 결과를 나타내어 최종적으로 E-3 균주를 선발하였다.
- 곰팡이 균주의 선발은 czapek agar plate상에 형성된 colony의 형태와 크기에 따라 선발하였다. 그 결과 약 50여주의 균주를 분리 선발하였다.
- 2차 선별된 15종의 균주를 개별적으로 배양하여, DNS 방법을 활용하여 xylanase, mannanase의 효소활성을 측정하여 6종의 균주를 선발하였고 재검증을 위하여 효소활성을 가지고 있는 6종의 균주를 500 mL 용량의 erlenmeyer flask로 배양하여 원심분리 후 배양상등액을 취하여 효소활성을 측정한 결과를 Table 2에 나타내었다. 대체로 2가지 효소활성을 모두 가지고 있으나, C-8 균주가 1.6 unit/mL의 가장 높은 xylanase activity을 보였으며, C-5 균주가 0.4 unit/mL의 높은 mannanase activity를 보였고, E-3 균주는 xylanase, mannanase activity가 각각 1.3unit/mL, 0.3unit/mL으로 모두 우수하게 나타났다.
- 3차 선발 과정을 통하여 최종 선발되어진 E-3 균주에 대한 균 동정의 일환으로 18S와 28S rDNA의 염기서열을 분석하였다. 분석 결과 582 bp 크기의 18S rDNA 사이의 internal space region의 염기서열을 얻었으며, Genbank 염기서열을 분석한 결과 Aspergillus niger와 99% 일치하는 결과를 나타내었다 (Fig. 2).
- 3 unit/g으로 분석되었다. 선별된 3종의 균주 중 xylanase, mannanase 효소활성이 각각 197.3 unit/g, 39.9 unit/g으로 가장 높은 E-3 균주를 최종적으로 선발하였다. 최종으로 분리한 E-3 균주는 형태학적 특징과 DNA 염기서열을 비교한 결과 Aspergillus niger와 99% 일치하였다.
- 2차 선발된 균주를 개별적으로 배양하여, DNS 방법을 활용하여 xylanase, mannanase 효소활성을 측정하여 6종의 균주를 선발하였다. 선별된 균주는 액상배양에서 생산한 xylanase, mannanase 효소활성이 각각 0.9~1.6 unit/mL, 0.2~0.4 unit/mL 범위로 나타났다. 이 중 결과가 좋은 3종을 선정하여 고상배양으로 배양한 균주의 xylanase, mannanase 효소활성은 각각 103.
- 4 unit/mL 범위로 나타났다. 이 중 결과가 좋은 3종을 선정하여 고상배양으로 배양한 균주의 xylanase, mannanase 효소활성은 각각 103.7~220.0 unit/g, 20.1~40.3 unit/g으로 분석되었다. 선별된 3종의 균주 중 xylanase, mannanase 효소활성이 각각 197.
- 0 μm이었다. 이러한 특징을 고려한 결과 분리된 균주는 Aspergillus niger로 동정되었다 (Fig. 1, Table 4).
- 9 unit/g으로 가장 높은 E-3 균주를 최종적으로 선발하였다. 최종으로 분리한 E-3 균주는 형태학적 특징과 DNA 염기서열을 비교한 결과 Aspergillus niger와 99% 일치하였다.
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