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문제 정의
- 본 연구에서는 한국재래돼지 MC1R 유전자 염기서열을 증폭하여 Fang (2009) 등의 분류 기준에 따라 정의하고, 대한양돈협회 산하 검정소에 입식되어 사육되고 있는 종돈의 품종 별 유전자형을 분석하였는데, 국내 F1 교잡 모계 라인에서의 비유암퇘지 (Duroc 교잡) 혼입이 있을 수 있는 지를 분석하였다. 그리고 소비자에게 육질이 우수하다고 알려져 있는 재래돼지의 유전자형을 분석하여 흑모색을 야기하는 변이가 육질과 실제 어떤 상관관계가 있는지 한국재래돼지와 Yorkshire F2 교잡집단에서 분석함으로써 밝히고자 하였다.
- 따라서 본 연구에서는 돼지 MC1R 염기서열의 상이성을 재정립하여 MC1R을 이용한 국내돼지품종식별 및 국내산 돈육제품의 경우 흑돈 브랜드제품 식별에 이용하고자 본실험을 수행하였다. 특히 흑모색을 지배하는 돼지 MC1R 유전자형이 돈육의 육질특성에 영향을 미치는지를 조사하여 우수한 육질의 흑돈 생산에 MC1R 유전자가 DNA 마커로써 활용될 수 있는지 그 가치를 평가하였다.
- 본 연구는 한국재래돼지의 MC1R 유전자형을 결정하고 MC1R 유전자의 변이와 육질과의 연관성을 규명하기 위하여 실시하였다. 재래돼지의 MC1R 유전자형을 분석한 결과 중국재래돼지품종이 속하는 ED1내에서도 0201형에 속하는 것으로 나타났으며 몇몇의 재래돼지에서는 EP 유전 자형이 출현하였는데 이는 Berkshire 품종의 혼입으로 인한 것으로 사료된다.
- 따라서 본 연구에서는 돼지 MC1R 염기서열의 상이성을 재정립하여 MC1R을 이용한 국내돼지품종식별 및 국내산 돈육제품의 경우 흑돈 브랜드제품 식별에 이용하고자 본실험을 수행하였다. 특히 흑모색을 지배하는 돼지 MC1R 유전자형이 돈육의 육질특성에 영향을 미치는지를 조사하여 우수한 육질의 흑돈 생산에 MC1R 유전자가 DNA 마커로써 활용될 수 있는지 그 가치를 평가하였다.
제안 방법
- 6 Anarbor, MI, USA) 프로그램을 이용하여 Genbank No. AF326520 염기서열정보와 비교하여 돼지MC1R유전자 변이를 조사하였다.
- MC1R 유전자형이 육질에 미치는 영향을 분석하기 위한 실험은 재래돼지와 Yorkshire의 F2 기초축군을 이용하였으며, Cho 등 (2004)이보고한 1쌍의 oligonucleotide를 이용하여 유전자 증폭을 하고 ED1 형 구분의 기준이 되는 Leu102Pro (T1132C) 변이를 인식하는 MspA1Ⅰ 제한효소를 처리하여 결정된 유전 자형을 이용하였다. Ala243Thr(G1554A)과 Leu102Pro (T1132C) 변이에 대한 유전자형 판정은 제한효소 최적반응 조건하 에서 4시간 이상 반응을 통해 절단된 단편들은 2.5% agrose gel에서 90mV 전압으로 40분간의 전기영동을 통해 수행하였다 (Fig. 1).
- DNA 증폭을 위해 사용된 PCR 기계는 ‘PTC-200 thermocycler’ (MJ Research, Watertown MA, USA)이며, hTaq polymerase (Solgent, Korea) 중합효소를 이용하였다.
- MC1R 유전자형이 육질에 미치는 영향을 분석하기 위한 실험은 재래돼지와 Yorkshire의 F2 기초축군을 이용하였으며, Cho 등 (2004)이보고한 1쌍의 oligonucleotide를 이용하여 유전자 증폭을 하고 ED1 형 구분의 기준이 되는 Leu102Pro (T1132C) 변이를 인식하는 MspA1Ⅰ 제한효소를 처리하여 결정된 유전 자형을 이용하였다.
- DNA 증폭을 위해 사용된 PCR 기계는 ‘PTC-200 thermocycler’ (MJ Research, Watertown MA, USA)이며, hTaq polymerase (Solgent, Korea) 중합효소를 이용하였다. PCR 반응조건은 먼저 95℃에서 15분 denaturation을 실시 하고, 95℃ 20초, 각 프라이머에 최적화된 온도에서 (Table 1.) 40초, 72℃ 30초씩 총 40 cycles를 수행하였고 그 후 72℃에서 5분간 최종반응을 실시한 후 종료하였다. PCR 증폭산물은 모두 1.
- ) 40초, 72℃ 30초씩 총 40 cycles를 수행하였고 그 후 72℃에서 5분간 최종반응을 실시한 후 종료하였다. PCR 증폭산물은 모두 1.5% agarose gel의 100mV 전압에서 30 분간의 전기영동을 통해 확인한 후 염기서열 분석 및 유전자형 분석을 위한 제한효소처리에 이용하였다.
- 육질형질은 등심에서 pH, 보수력, 가열감량, 전단력 및 일반성분 분석을 실시하였다. pH는 도체 후 24시간에 측정하였으며 육즙손실량은 등심시료를 진공포장을 한 뒤에 24시간후에 손실량을 측정하였다. 가열감량은 70℃에서 40분간 처리한 후 가열전후의 무게를 측정하였다.
- 기초축군으로 활용된 한국재래돼지와 Yorkshire의 F2 집단의 연관성분석을 위해 도체형질 및 육질형질에 대하여 조사하였다. 도체형질은 도축 직후 온도체중을 측정하였 으며 등지방두께는 10번째와 11번째 늑골에서 측정하였다.
- 기초축군으로 활용된 한국재래돼지와 Yorkshire의 F2 집단의 연관성분석을 위해 도체형질 및 육질형질에 대하여 조사하였다. 도체형질은 도축 직후 온도체중을 측정하였 으며 등지방두께는 10번째와 11번째 늑골에서 측정하였다. 체지방은 복강지방과 부분육으로부터 손질되어서 나온 지방 무게를 측정하였다.
- 돼지 MC1R의 유전자형은 Fang 등 (2009)이 새롭게 분류 하였는데 총 14개의 polymorphism을 가지고 기존에 보고 되었던 5 종류의 유전자형을 보다 세분화하였다. 이 분류 기준에 따라 재래돼지의 유전자형을 확인하기 위해 염기 서열 분석을 실시하여 Fang 등 (2009)이 보고한 다른 품종과 비교 하였다.
- 모든 육질형질에 대하여 유의적인 효과를 나타내지 않았으며 이로써 돼지의 흑색모색과 육질과는 연관성이 없으며 다른 육질관련 유전자에 의해 영향을 받는다는 근거를 제공하였다. 또한 Duroc 품종에서 AA으로 고정되어 있어 다른 품종과의 구분 기준이 되는 Ala243Thr (G1554A) 변이를 이용하여 종돈검정소에서 출하된 Landrace, Yorkshire, Duroc, Berkshire 순종집단에 대한 유전자형 빈도를 조사하였으며 Berkshire를 제외한 나머지 품종에서 이형접합체가 일부 출현하였다.
- 본 연구에서는 한국재래돼지 MC1R 유전자 염기서열을 증폭하여 Fang (2009) 등의 분류 기준에 따라 정의하고, 대한양돈협회 산하 검정소에 입식되어 사육되고 있는 종돈의 품종 별 유전자형을 분석하였는데, 국내 F1 교잡 모계 라인에서의 비유암퇘지 (Duroc 교잡) 혼입이 있을 수 있는 지를 분석하였다. 그리고 소비자에게 육질이 우수하다고 알려져 있는 재래돼지의 유전자형을 분석하여 흑모색을 야기하는 변이가 육질과 실제 어떤 상관관계가 있는지 한국재래돼지와 Yorkshire F2 교잡집단에서 분석함으로써 밝히고자 하였다.
- 전단력은 도축 24시간 후 12번 늑골부위의 등심부위를 3cm 정도 두께의 스테이크 모양으로 절단하여 70℃에서 40분간 가열하여 전단력측정기 (Warner-Bratzler shear force meter)로 측정하였다. 육색은 도축 후 24시간에 등심부위의 절개단면을 공기중에 30분간 노출시킨 후에 CIE (Commision International de Leclairage) 값을 사용하여 Hunt L, a, b 값을 각각 측정하였다.
- 체지방은 복강지방과 부분육으로부터 손질되어서 나온 지방 무게를 측정하였다. 육질형질은 등심에서 pH, 보수력, 가열감량, 전단력 및 일반성분 분석을 실시하였다. pH는 도체 후 24시간에 측정하였으며 육즙손실량은 등심시료를 진공포장을 한 뒤에 24시간후에 손실량을 측정하였다.
- Dun 등 (2007)은 Landrace와 Yorkshire에서는 각각 668GG, 1318CC 그리고 1554GG의 동형접합체인 반면에 Duroc에서는 668CC, 1318TT 그리고 1554AA 동형접합체인 Duroc 특이적인 변이를 보고하였다. 이 자료를 근거로 하여 MC1R-5F/R 프라이머를 제작하고 대한양돈협회 산하 종돈 검정소에 출하된 순종집단 (Landrace, Yorkshire, Berkshire, Duroc) 각각 48, 46, 48, 39두에 대하여 Ala에서 Thr으로의 아미노산 치환을 일으키는G1554A 변이를 PCR- RFLP 분석을 수행하였다 (Fig. 1).
- 재래돼지 12두를 혼합한 4개의 DNA 샘플에서 염기서열 분석을 통해 얻어진 1451bp의 재래돼지 염기서열은 Genbank에 등록되어있는 database (AF326520)와 비교한 후 Fang 등 (2009)이 보고한 14개의 SNPs와 유전자형을 분류 기준으로 삼아 분석하였다 (Table 2).
- 가열감량은 70℃에서 40분간 처리한 후 가열전후의 무게를 측정하였다. 전단력은 도축 24시간 후 12번 늑골부위의 등심부위를 3cm 정도 두께의 스테이크 모양으로 절단하여 70℃에서 40분간 가열하여 전단력측정기 (Warner-Bratzler shear force meter)로 측정하였다. 육색은 도축 후 24시간에 등심부위의 절개단면을 공기중에 30분간 노출시킨 후에 CIE (Commision International de Leclairage) 값을 사용하여 Hunt L, a, b 값을 각각 측정하였다.
- 조사된 MC1R 유전자 변이의 빈도에 대한 품종별 분석은 Landrace, Yorkshire, Duroc, Berkshire 4품종에 대해서 Dun 등 (2007)의 MC1R-5F/R 프라이머를 이용하여 증폭한 PCR 산물에서 Ala243Thr (G1554A) 변이를 인식하는 제한 효소 BstUⅠ 처리하여 수행하였다. MC1R 유전자형이 육질에 미치는 영향을 분석하기 위한 실험은 재래돼지와 Yorkshire의 F2 기초축군을 이용하였으며, Cho 등 (2004)이보고한 1쌍의 oligonucleotide를 이용하여 유전자 증폭을 하고 ED1 형 구분의 기준이 되는 Leu102Pro (T1132C) 변이를 인식하는 MspA1Ⅰ 제한효소를 처리하여 결정된 유전 자형을 이용하였다.
- 도체형질은 도축 직후 온도체중을 측정하였 으며 등지방두께는 10번째와 11번째 늑골에서 측정하였다. 체지방은 복강지방과 부분육으로부터 손질되어서 나온 지방 무게를 측정하였다. 육질형질은 등심에서 pH, 보수력, 가열감량, 전단력 및 일반성분 분석을 실시하였다.
- 한편, 우리나라에서 비육돈 생산에 이용되고 있는 4개의 주요 품종에 대하여 MC1R-Ala243Thr (G1554A) 유전자 형을 결정하여 종돈의 유전적 순수성을 검정하였다. MC1R-Ala243Thr (G1554A) polymorphism은 Duroc 품종을 구별해 낼 수 있는 특이적인 SNP로 Duroc은 AA로, Duroc 을 제외한 나머지 품종에서는 GG형으로 고정되어 있어야 하지만 Berkshire 품종을 제외한 Landrace, Duroc, Yorkshire 품종에서 이형접합체가 출현하였다.
- 흑모색과 관련이 있다고 보고된 MC1R-Leu102Pro(T1132C) 변이가 육질 및 도체형질에 미치는 영향을 알아보기 위하여 한국재래돼지와 Yorkshire를 교잡하여 조성한 F2 집단에서 MspA1I PCR-RFLP 분석방법을 이용하여 유전자형을 결정하여 표현형간의 연관성 분석을 실시하였다 (Table 4). 총 171개의 DNA 샘플을 대상으로 분석되었으며 두 가지 동형접합자와 이들의 이형접합자가 모두 출현 하였고 각각의 빈도는 TT 0.
- 재래돼지의 MC1R 유전자형을 분석한 결과 중국재래돼지품종이 속하는 ED1내에서도 0201형에 속하는 것으로 나타났으며 몇몇의 재래돼지에서는 EP 유전 자형이 출현하였는데 이는 Berkshire 품종의 혼입으로 인한 것으로 사료된다. 흑색의 모색과 관련되어 있다고 보고된 Leu102Pro (T1132C) 변이를 재래돼지와 Yorkshire의양방향 교배로 생산된 F2 집단의 171 두를 대상으로 분석 하고 육질형질과의 연관성을 분석하였다. 모든 육질형질에 대하여 유의적인 효과를 나타내지 않았으며 이로써 돼지의 흑색모색과 육질과는 연관성이 없으며 다른 육질관련 유전자에 의해 영향을 받는다는 근거를 제공하였다.
대상 데이터
- MC1R 유전자 변이와 육질과의 연관성을 분석하기 위해 이용된 공시재료로는 충북 청원군에 위치한 샘터농장에서 한국재래돼지와 Yorkshire 품종의 양방향교배로 생산된 171두의 F2 개체의 혈액에서 분리된 DNA가 이용되었다.
- 돼지 MC1R 유전자를 증폭하기 위하여 이용된 프라이머는 Dun 등 (2007)이 보고한 4쌍의 oligonucleotides와 Cho 등 (2004)이 보고한 1쌍의 oligonucleotide를 사용하였다 (Table 1).
- 본 연구에 사용한 공시재료는 국립축산과학원의 한국재 래돼지 12두와 대한양돈협회 산하 종돈검정소에 종돈능력 평가에 이용된 Landrace (48두), Yorkshire (46두), Duroc (39 두) 및 Berkshire (48두)의 혈액으로부터 genomic DNA를 분리하여 이용하였다.
데이터처리
- 경제형질 측정치에 대한 MC1R-Leu102Pro (T1132C) 변이의 유전자형 효과를 추정하기 위해 SAS 9.1 Package/PC를 이용하여 일반선형모형 (GLM) 분석을 하였으며, 유전자형의 효과가 유의한 형질들에 대해 최소유의차 검정으로 평균간 차이에 대한 유의성을 조사하였다. 통계분석에 이용한 모형은 다음과 같다.
성능/효과
- 02로 확인 되었다. 주요 ``도체형질인 생시체중, 수분, 단백질, 지방, 보수력, 콜레스테롤, 근내지방도, 조직감, 연도, 다즙성, 명도, 적색도에 대하여 MC1R 유전자 Leu102Pro 비교를 수행한 결과 모든 형질에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다 (Table 4).
- 그리고 Wild boar 와 중국재래종에서만 나타나는 3개의 synonymous substitution도 발견되었다. ED1의 유전자형은 3가지 (0201~0203)로 다시 나뉘게 되는데 재래돼지가 이들 중 어디에 속하는지 비교해 보면 0202와 0203형을 각각 구분하는 기준이 되는 122번과 124번 코돈의 변이가 발견되지 않았고 이러한 결과로 봤을 때 한국 재래돼지의 유전자형은 ED1형 중에서도 0201에 속하는 것으로 추정할 수 있다. 그런데 일부 재래돼지에서는 MC1R*3에 속하는 ED2유전자형이 발견되었다.
- (Dominant black)은 3개의 형태 (0201~0203)로 분류되었다. ED2(Dominant black)와 e (Recessive red)는 한 가지 (0301, 0401)로 고정되었으며, 흑백반(black spotting)은 3개의 형태 (0501~0503)로 품종 별로 정확하게 재분류되었다.
- 그 결과 한국재래돼지 MC1R 대립유전자형은 모두 ED1형으로, MC1R ED1을 결정짓는 코돈 Val95Met과 Leu102Pro의 polymorphism을 가지고 있었으며 이 그룹에는 몸 전체가 흑모색인 중국재래종이 다수 포함되는 것으로 알려져 있다. 또한 중국야생종(E + )과 중국재래종에서 나타난 코돈 17 (G→ A)번의 A 대립유전자가 한국재래돼지에서도 동일하게 A 대립유전자로 고정된 것으로 관찰되었다.
- 또한 중국야생종(E + )과 중국재래종에서 나타난 코돈 17 (G→ A)번의 A 대립유전자가 한국재래돼지에서도 동일하게 A 대립유전자로 고정된 것으로 관찰되었다.
- 흑색의 모색과 관련되어 있다고 보고된 Leu102Pro (T1132C) 변이를 재래돼지와 Yorkshire의양방향 교배로 생산된 F2 집단의 171 두를 대상으로 분석 하고 육질형질과의 연관성을 분석하였다. 모든 육질형질에 대하여 유의적인 효과를 나타내지 않았으며 이로써 돼지의 흑색모색과 육질과는 연관성이 없으며 다른 육질관련 유전자에 의해 영향을 받는다는 근거를 제공하였다. 또한 Duroc 품종에서 AA으로 고정되어 있어 다른 품종과의 구분 기준이 되는 Ala243Thr (G1554A) 변이를 이용하여 종돈검정소에서 출하된 Landrace, Yorkshire, Duroc, Berkshire 순종집단에 대한 유전자형 빈도를 조사하였으며 Berkshire를 제외한 나머지 품종에서 이형접합체가 일부 출현하였다.
- 그리고 Cho 등(2004)도 MC1R*3으로 보고하였다. 본 실험의 결과에 따르면 MC1R*1과 연관되어 있으며 유럽과 중국의 Wild boar 품종들에게 고정된 E + 의 대립유전자형은 공시된 재래돼지에서는 나타나지 않았다. MC1R*2 (Dominant black)은 중국의 많은 재래종에서 나타난 유전자형이며 ED1형과 연관되어 있는데 ED1형의 검은색 모색 발현을 야기시키는 변이로 알려진 두 개의 missense mutation (V95M, L102P)이 모든 재래돼지의 샘플에서 발견되었다 (Kerong 등, 2004).
- 그리고 Berkshire는 E D2 으로, G1554A 변이는 Duroc 개체만을 식별 할 수 있는 인지부 위로써 Duroc에서 AA형으로 고정되어 있어야 한다. 실험 결과 본 실험에 사용된 Duroc에서 GG형은 출현하지 않았으나 GA 이형접합체가 충 39마리 중 8마리가 출현함 으로써 이형접합체의 비율은 0.2로 나타났다. 그리고 Landrace와 Yorkshire의 대립유전자형은 GG 형으로 고정 되어 있어야 하지만 Landrace는 48마리 중 5마리, Yorkshire는 46마리 중 5마리가 이형접합체로 출현하였다.
- MC1R*3은 Hampshire와 Berkshire 같은 유럽의 흑백혼합모색품종이 속하는 ED2와 Landrace, Yorkshire와 같은 백색모색을 가진 품종이 속하는 E P 형이 있다. 이 중 백색품종에서만 확연하게 나타나는 22번 코돈의 CC insertion이 한국재래돼지에서는 없는 것으로 보아 발견된 이형접합체는 EP보다는 ED2에서 기인한 것으로 추정되며 개량과정 중 특히 Berkshire 품종의 영향을 받는 것으로 사료된다. 과거 많은 유럽 품종이 국내로 들어오면서 재래돼지의 개량에 교잡이 되었다가 재래돼지를 복원하는 과정에서 모색이나 체형 등의 외모심사에 의해 수집되어 보존되어온 실정을 고려하면 이 같은 결과를 예측을 가능하며, 이는 또한 재래돼지 유전자형을 MC1R*3으로 보고한 Lee 등 (2001)과 Cho 등 (2002, 2004)의 결과와 일치한다.
- Table 4는 검은색 모색 발현과 관련되어 있는 MC1R‐Leu102Pro (T1132C) 변이를 분석함으로써 MC1R 유전자형과 도체형질간의 연관성을 나타낸 것으로 MC1R 유전자형은 모든 도체형질에 대하여 유의적인 상관관계를 나타내지 않았다. 이로써 MC1R의유전자형은 육질형질과 연관되지 않은 것을 확인할 수 있으며 나아가 검은색 모색은 육질에 영향을 미치지 않는다는 사실을 보여주고 있다.
- 본 연구는 한국재래돼지의 MC1R 유전자형을 결정하고 MC1R 유전자의 변이와 육질과의 연관성을 규명하기 위하여 실시하였다. 재래돼지의 MC1R 유전자형을 분석한 결과 중국재래돼지품종이 속하는 ED1내에서도 0201형에 속하는 것으로 나타났으며 몇몇의 재래돼지에서는 EP 유전 자형이 출현하였는데 이는 Berkshire 품종의 혼입으로 인한 것으로 사료된다. 흑색의 모색과 관련되어 있다고 보고된 Leu102Pro (T1132C) 변이를 재래돼지와 Yorkshire의양방향 교배로 생산된 F2 집단의 171 두를 대상으로 분석 하고 육질형질과의 연관성을 분석하였다.
- 흑모색과 관련이 있다고 보고된 MC1R-Leu102Pro(T1132C) 변이가 육질 및 도체형질에 미치는 영향을 알아보기 위하여 한국재래돼지와 Yorkshire를 교잡하여 조성한 F2 집단에서 MspA1I PCR-RFLP 분석방법을 이용하여 유전자형을 결정하여 표현형간의 연관성 분석을 실시하였다 (Table 4). 총 171개의 DNA 샘플을 대상으로 분석되었으며 두 가지 동형접합자와 이들의 이형접합자가 모두 출현 하였고 각각의 빈도는 TT 0.68, TC 0.29, CC 0.02로 확인 되었다. 주요 ``도체형질인 생시체중, 수분, 단백질, 지방, 보수력, 콜레스테롤, 근내지방도, 조직감, 연도, 다즙성, 명도, 적색도에 대하여 MC1R 유전자 Leu102Pro 비교를 수행한 결과 모든 형질에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다 (Table 4).
후속연구
- 재래돼지는 전신흑모색으로 등지방 두께가 두껍고 성장률 및 사료효율이 낮으나 조단백질과 조지방 함량이 높고 단단한 지방조직과 붉은 육색과 백색의 지방을 가지며 풍부한 육즙으로 육질이 우수하다고 알려져 있다. 그러나 이는 모색과는 연관되지 않은 재래돼지 품종의 자체의 특성으로 다른 육질 연관 유전자가 관여하고 있을 것으로 사료되며 이에 대한 연구가 필요할 것으로 보인다.
- 이렇게 외형만을 기준으로 품종을 구분할 때 비육돈이 종돈으로 선발되어 쓰이는 경우 모계 능력의 저하를 초래하게 되거나 고급육제품에 이용되는 좋은 육질의 비육돈을 생산하는데 문제를 초래하게 되면서 농장생산력의 저하를 가져올 수도 있다. 유전자형 빈도만을 가지고 교잡의 정도를 정확하게 판단하는 것은 무리가 있으나 우수한 비육돈 생산라인을 구축하고 유지하기 위해서는 정확한 혈통을 바탕으로 순수한 혈통을 유지 하고 관리 되어야 하며, 따라서 종돈 선발 시 표현형에 의존하여 발생할 수 있는 문제를 보완할 수 있는 품종 특이적인 DNA 마커 연구의 필요성이 대두된다.
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