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문제 정의
- 1. Schematic maps of ectopic expression and RNAi vectors generated in this study. (A) Subdomains of intact and modified CaMV 35S promoters.
- 제조 또는 확보하는 것은 필수적이다[18]. 본 연구에서는 식물, 특히 쌍자엽식물에서 유전자의 과발현에 사용할 수 있는 세 종류의 벡터와 대부분의 식물에서 유전자의 발현억제에 사용할 수 있는 RNAi 기본 벡터를 제조하고 그 유용성을 확인하였다. 특히 과발현용 벡터의 제조에 사용된 pPZP211 은 bi nary 벡터들 가운데 크기가 작고 박테리아 내에서 높은 copy 수로 존재하여 본 연구에서 제조된 벡터들은 박테리아 내에서의 조작이 매우 용이하다[13].
- 본 연구에서는, pPZP211 벡터를 골격으로 하고 CaMV 35S 프로모터와 애기장대의 UBQ3, UBQ10 프로모터를 이용하여 쌍자엽 식물에서의 유전자 과발현을 위한 벡터를 제조하여 확인하였고, 아울러 유전자 발현 억제에 사용될 수 있는 RNAi 벡터의 골격을 제조하여 그 효과를 조사하였다.
제안 방법
- 9 kb) [29] 부위를 PCR 로 증폭하여 pPZP211 벡테 13]의 위치에 클로닝하였다. -90-47 부위가 제거된 modified CaMV 35S 프로모터를 제작하기 위해, 46〜+8의 core 부분을 PCR로 증폭하여pBluescrpt II KS (pBSUKS) 벡터 (Stratagene, Netherlands) 의 EaSl-Ps& 위치에 클로닝 하고, 클로닝 된 벡터의 /fedHI- 위치에 CaMV35S 프로모터의 B 도메인(-343〜-91)을 클로닝 하였다. 재조합된 modified CaMV 35S 프로모터 (B-core 도메인)를 pPZP211 벡터의 HindIIII-PsiI 위치에 클로닝 하였다.
- 25 mg/1 kanamydn0] 포함된 MS 배지에서 종자를 발아시켜 형질전환체를 선별하였다.
- 30 mg/1 hygromydn이 포함된 MS 배지에서 종자를 발아시켜 형질전환체를 선별하였다.
- 분리하였다. 5 昭 RNA에 2 unit RNase-free DNase I (Promega, USA)을 처리한 후, 100 pmole poly-T 프라이머, 10 mM dNTP mixture, 200 unit M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, USA)> 이용하여 cDNA를 합성하였다. RNA의 발현량을 확인하기 위해, 합성한 cDNA를 이용하여 semi- quantitative RT-PCR을 수행하였다.
- GFP 발현 분석은 T2 형질전환체를 대상으로 수행하였으며,fluorescence phase microscope (Zeiss Axioskop, Carl Zeiss co. Jena, Germany)를 이용하여 GFP 형광을 관찰하였다. GFP에 대한 흡수파장은 395 nm, 발광파장은 508 nm에서 측정하였다.
- GUS 활성 분석을 위해, 형질전환 식물체를 X-gluc 용액[2mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-P-D-glucuronic acid, 0.5 mM KaFe(CN)6z 0.5 mM K4Fe(CN)& 50 mM phosphate (pH7.0)]에 담가 10분간 진공 처리를 한 후, 37°C에서 6시간 동안 암조건에서 반응시켰다. 반응이 끝난 식물체는 50 mM phos phate 완충용액(pH 7.
- Modified CaMV 35S 프로모터 활성을 sGFP를 리포터 유전자로 이용하여 조사하였다. 먼저 Ti 형질전환 식물체를 대상으로 GFP의 과발현을 RT-PCR을 수행하여 조사한 결과, 야생 형에서는 sGFP 발현이 관찰되지 않았지만, 서로 다른 5개 Ti 식물체에서는 sGFP의 전사체를 많이 관찰할 수 있었다(Fig.
- 쌍자엽식물 과발현용 벡터를 제조하기 위한 binary 벡터로 pPZP211 벡터가 사용되었는데, 이 벡터는 크기가 작고 MCS에 많은 수의 제한효소 부위를 가지고 있으며, 박테리아 내에 copy 수가 많다는 장점을 가지고 있다[13]. Modified CaMV 35S 프로모터, UBQ3 프로모터, UBQ10 프로모터 각각을 Nos terminator와 함께 pPZP211 벡터 에 클로닝 하였으며, 프로모터와 terminator 사이 에는 5개 또는 7개 제한효소 부위를 가지는 MCS를 두어 과발현 하고자 하는 유전자를 손쉽게 클로닝 할 수 있게끔 하였다(Fig. IB). Modified CaMV 35S 프로모터, UBQ3 프로모터, UBQ10 프로모터에 대한 제작된 각각의 벡터들을 pFGL571, pFGL846, PFGL847이라 명명하였다(Fig.
- OSDEG10유전자의 역반복 서 열을 pFGL727에 클로닝 한 후, 역반복 서 열 부위를 단자엽식물용 과발현 벡터인 pGA1611 로 클로닝 하였고[23], 이를 벼에 형질전환하여 제조하였다. Ti 형질전환 식물체 5개를 대상으로 RT-PCR을 수행하여 OSDEG10유전자의 발현 정도를 확인하였다.
- RT-PCR에 사용한 각 유전자 一 특이적인 프라이머는 Table 1에 나타내 었다. PCR 반응은 1 应 cDNA, 1 unit F-taq DNA 중합효소(Solgent, Korea), 25 pmole 프라이 머 (정 방향, 역방향), 0.5 mM dNTP mixture, 5 ^110x 완충용액 에서 수행하였다. PCR 반응은 94°C에서 5분간 변성 후, 94°C에 서 45초, 56°C에서 45초, 72°C에 서 45초의 PCR cycles을 25-30회 반복하여 수행하였다.
- 5 mM dNTP mixture, 5 ^110x 완충용액 에서 수행하였다. PCR 반응은 94°C에서 5분간 변성 후, 94°C에 서 45초, 56°C에서 45초, 72°C에 서 45초의 PCR cycles을 25-30회 반복하여 수행하였다.
- PFGL578이 형질전환된 애기장대 Tz, T3 세대 형질 전환 체를 이용하여 modified CaMV 35S 프로모터의 발달단계별 활성을 GUS 발현 분석을 통해 확인하였다. 이때, intact CaMV 35S 프로모터::omega 서열이 포함된 형질전환체를 대조구로 프로모터 활성 분석을 비교하였다.
- PFGL848과 pFGL849 벡터가 각각 형질전환된 애기장대 T2 형질전환 식물체를 대상으로 발달단계별 GUS 활성을 분석하여 UBQ3과 UBQ10 유전자의 프로모터를 각각 포함하는 pFGL846, pFGL847 벡터의 유용성을 조사하였다. 먼저, 서로 다른 최소 4개 Ti 라인에서 유래한 T2 식물체들은 유사한 GUS 발현 양상을 보였으며, UBQ3과 UBQ10 프로모터 형질전환체모두 관찰된 모든 발달단계의 뿌리 에서 강한 GUS 활성을 보였다(Fig.
- RNAi 기본 벡터인 pFGL727이 유전자의 발현 억제에 효과적인지 알아보기 위해, pFGL727을 사용하여 제조한 벼의 OSDEG10 유전자에 대한 RNAi 형질전환 식물체를 분석하였다. OsDEGlO의 RNAi 형질전환 식물체는。 OSDEG10유전자의 역반복 서 열을 pFGL727에 클로닝 한 후, 역반복 서 열 부위를 단자엽식물용 과발현 벡터인 pGA1611 로 클로닝 하였고[23], 이를 벼에 형질전환하여 제조하였다.
- RNAi 벡터의 제조를 위해, 벼의 OsEMFl 유전자 (AF326768)의 세 번째 인트론 부위 중 204 bp를 PCR로 증폭하여 pBSIIKS 벡터의 /findlll-feRI 위치에 클로닝 하여 RNAi 벡터로 사용할 수 있는 pFGL727을 제조하였다. 위 실험의 PCR 과정에 사용된 프라이머는 Table 1에 나타내었다.
- 5 昭 RNA에 2 unit RNase-free DNase I (Promega, USA)을 처리한 후, 100 pmole poly-T 프라이머, 10 mM dNTP mixture, 200 unit M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, USA)> 이용하여 cDNA를 합성하였다. RNA의 발현량을 확인하기 위해, 합성한 cDNA를 이용하여 semi- quantitative RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR에 사용한 각 유전자 一 특이적인 프라이머는 Table 1에 나타내 었다.
- OsDEGlO의 RNAi 형질전환 식물체는。 OSDEG10유전자의 역반복 서 열을 pFGL727에 클로닝 한 후, 역반복 서 열 부위를 단자엽식물용 과발현 벡터인 pGA1611 로 클로닝 하였고[23], 이를 벼에 형질전환하여 제조하였다. Ti 형질전환 식물체 5개를 대상으로 RT-PCR을 수행하여 OSDEG10유전자의 발현 정도를 확인하였다. 그 결과 1번, 2번과 5번 세 개식물체에서 OSDEG10 발현이 야생형에 비해 현저히 감소한 것을 확인하였다(Fig.
- Trizol reagent (Invitrogen, USA)를 사용하여 식물체에서 RNA를 분리하였다. 5 昭 RNA에 2 unit RNase-free DNase I (Promega, USA)을 처리한 후, 100 pmole poly-T 프라이머, 10 mM dNTP mixture, 200 unit M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, USA)> 이용하여 cDNA를 합성하였다.
- 1C). 또한 sGFP의 암호화 부위를 pFGL5기의 modified CaMV 35S 프로모터에 연결시킨 pFGL586 벡터를 제조하였고 (Fig. 1Q, 이를 이용해 GUS 벡터의 결과를 다른 리포터 유전자를 사용하여 재확인하고자 하였다.
- 1A). 또한 애기장대에서 대부분의 조직에서 지속적으로 과량 발현되는 프로모터로 알려진 UBQ3 및 UBQ10 프로모테2이를 포함하는 과발현 벡터를 제작하였다. 쌍자엽식물 과발현용 벡터를 제조하기 위한 binary 벡터로 pPZP211 벡터가 사용되었는데, 이 벡터는 크기가 작고 MCS에 많은 수의 제한효소 부위를 가지고 있으며, 박테리아 내에 copy 수가 많다는 장점을 가지고 있다[13].
- 먼저, CaMV 35S 프로모터, UBQ3 및 UBQ10 프로모터를 대상으로 과발현 벡터를 제조하였다. CaMV 35S 프로모터는 기존에 특정 유전자의 과발현으로 알려져 있으며, 전체 프로모터 는 B 도메 인과 A 도메 인으로 구성 되 어 있다(Fig.
- 먼저, 쌍자엽식물용 과발현 벡터를 제작하기 위해, intact CaMV 35S 프로모터(351 bp) [2], 애기장대 UBQ3 프로모터 (1.25 kb), 애기장대 UBQ10 프로모터(0.9 kb) [29] 부위를 PCR 로 증폭하여 pPZP211 벡테 13]의 위치에 클로닝하였다. -90-47 부위가 제거된 modified CaMV 35S 프로모터를 제작하기 위해, 46〜+8의 core 부분을 PCR로 증폭하여pBluescrpt II KS (pBSUKS) 벡터 (Stratagene, Netherlands) 의 EaSl-Ps& 위치에 클로닝 하고, 클로닝 된 벡터의 /fedHI- 위치에 CaMV35S 프로모터의 B 도메인(-343〜-91)을 클로닝 하였다.
- 성숙 식물체의 꽃에서의 UBQ3과 UBQ10 프로모터 활성을 조사하였다. UBQ3 와 UBQ10 프로모터 모두 수술과 암술에서 강한 발현이 관찰되었으며, UBQ3 프로모터의 경우 일부 꽃의 꽃잎에서 활성이 관찰되었다(Fig.
- 성숙한 형질전환 식물체의 꽃에서 GUS 발현 양상을 조사하였다. Modified CaMV 35S 프로모터 의 경우, 수술, 암술, 꽃잎 둥에서 발현이 관찰된 반면, intact CaMV 35S 프로모터 는수술과 암술에서 GUS 발현이 관찰되었다(Fig.
- 애기장대 종자는 70% ethanol에서 1분, 10% dor ox에서 10분간 소독한 뒤 증류수로 3회 이상 세척하고, 암상태로 4°C에서 2일 동안 두어 춘화처리를 처리한 다음, vitamin B5, 1.5% sucrose, 0.7% microagar가 포함된 MS (Murashige and Skoog) [22] 배지에 발아하였다. 발아된 애기장대 종자는 22°C의 단일 조건(light 8 hr/dark 16 hr)에서 배양하였고, 1012일 후 흙으로 옮겨 장일조건(light 16 hr/dark 8 hr)에서 배양하였다.
- 사용하였다[23]. 이 형질전환체 제조를 위해 OsDEGlg 암호화 부위 일부를 pFGL727 벡터 에 각각 역방향으로 클로닝 한 후 RNAi 벡터를 제조하였다[23]
- 발현 분석을 통해 확인하였다. 이때, intact CaMV 35S 프로모터::omega 서열이 포함된 형질전환체를 대조구로 프로모터 활성 분석을 비교하였다.
- 사용된다. 이를 위해 애기장대의 세 종류 프로모터를 이용한 과발현 형질전환용 벡터 및 RNAi 벡터를 제조하였으며, 이를 이용한 애기장대 및 벼 형질전환체를 분석하였다.
- -90-47 부위가 제거된 modified CaMV 35S 프로모터를 제작하기 위해, 46〜+8의 core 부분을 PCR로 증폭하여pBluescrpt II KS (pBSUKS) 벡터 (Stratagene, Netherlands) 의 EaSl-Ps& 위치에 클로닝 하고, 클로닝 된 벡터의 /fedHI- 위치에 CaMV35S 프로모터의 B 도메인(-343〜-91)을 클로닝 하였다. 재조합된 modified CaMV 35S 프로모터 (B-core 도메인)를 pPZP211 벡터의 HindIIII-PsiI 위치에 클로닝 하였다. pPZPZLl에 각각 클로닝 된 UBQ3, UBQ10 그리고 modified CaMV 35S 프로모터의 뒷 부위의 위치에 Nos termi- nator를 클로닝 하여, 제조된 벡터를 각각 pFGL847, pFGL846, pFGL5기이라 명명하였다.
- Omega 서열은 유전자의 전사에는 영향을 미치지 않으며 해독의 효율을 높이는 기능을 가지는 것으로 보고되어있다[11]. 제조된 벡터의 프로모터 활성을 확인하기 위해, p- glucuronidase (GUS) 유전자의 암호화 부위를 pFGL846, pFGL847, pFGL571, pFGL772 벡터의 BanOrSai 위치에 각각 클로닝 하였으며, 다른 리포터 유전자로 synthetic Green Fluorescence Protein (sGFP) [7] 유전자의 암호화 부위를 pFGL571 벡터의 Ps&-XbA 위치에 클로닝 하였다.
- 1A). 하지만 CaMV 35S 프로모터 의 B 도메 인과 A 도메 인 전체를 이용할 경우에는 일부 기관에서만 대상 유전자의 과발현이 나타나므로[3, 4] A 도메 인의 core 부분만을 B 도메 인과 연결시 켜 modified CaMV 35S 프로모터를 제작하였다(Fig. 1A). 또한 애기장대에서 대부분의 조직에서 지속적으로 과량 발현되는 프로모터로 알려진 UBQ3 및 UBQ10 프로모테2이를 포함하는 과발현 벡터를 제작하였다.
대상 데이터
- Jena, Germany)를 이용하여 GFP 형광을 관찰하였다. GFP에 대한 흡수파장은 395 nm, 발광파장은 508 nm에서 측정하였다.
- 재조합된 modified CaMV 35S 프로모터 (B-core 도메인)를 pPZP211 벡터의 HindIIII-PsiI 위치에 클로닝 하였다. pPZPZLl에 각각 클로닝 된 UBQ3, UBQ10 그리고 modified CaMV 35S 프로모터의 뒷 부위의 위치에 Nos termi- nator를 클로닝 하여, 제조된 벡터를 각각 pFGL847, pFGL846, pFGL5기이라 명명하였다. Modified CaMV 35S 프로모터에 대한 대조구 벡터로 intact CaMV 35S 프로모터::omega 서열::Nos terminator를 pPZP211 벡터에 클로닝 하여 이를 pFGL772라 명명하였다.
- 먼저 쌍자엽식물에서 유전자의 과발현에 사용할 수 있는 pFGL571, pFGL846 그리고 pFGL847을 제조하였으며, 이들 벡터는 각각 modified CaMV 35S, UBQ3, UBQ10 프로모터를 포함하고 있다(Fig. IB). 세 종류의 벡터 모두 MCS에 5개 또는 7개의 제한효소 부위를 가지고 있고, 벡터의 전체 염기서열이 제공되어 원하는 유전자를 쉽게 클로닝 할 수 있는 장점을 가지고 있다(Fig.
- 관련되어 매우 유용한 정보를 제공한다. 본 연구에서는 modified CaMV 35S, UBQ3, UBQ10 프로모터를 pPZP211 벡터에 각각 클로닝 하여 Agrobacterium을 매개로 한 과발현 형질전환 식물체 제작에 유용하게 이용할 수 있는 PFGL571, pFGL846, pFGL847을 제조하였다. 이 벡터들은 크기가 작고, 박테리아 내에 high copy로 존재하며, 다중 클로닝 부위에 다양한 제한효소 부위를 가지고 있고, 전체 서열이 알려져 있는둥의 장점을 가지고 있다.
- 식물에서 특정 유전자의 발현 억제에 사용될 수 있는 RNAi 기본 벡터인 pFGL727 벡터를 제조하였다(Fig. IB). RNAi 방법은 최근에 식물 및 동물 모두에서 특정 유전자의 발현을 억제하는데 매우 효율적인 방법으로 사용되고 있다[20].
- 애 기장대 (Arabidopsoss thaliana)는 Columbia ecotype을 사용하였다. 애기장대 종자는 70% ethanol에서 1분, 10% dor ox에서 10분간 소독한 뒤 증류수로 3회 이상 세척하고, 암상태로 4°C에서 2일 동안 두어 춘화처리를 처리한 다음, vitamin B5, 1.
- 제조된 벡터가 식물체 내에서 유전자를 적절히 과발현 시킬수 있는지 알아보기 위하여 pFGL571, pFGL846, pFGL847의각 프로모터 뒷부분에 리포터 유전자인 GUS를 클로닝 하여pFGL578, pFGL848, pFGL849를 각각 제조하였다(Fig. IQ.
- IQ. 한편 modified CaMV 35S 프로모터 에 대한 대조구 프로모터로 intact CaMV 35S 프로모터 ::omega 서 열을 이용하였으며, 이서 열에 GUS 유전자가 연결된 벡터, pFGL1089를 제조하였다 (Fig. 1C). 또한 sGFP의 암호화 부위를 pFGL5기의 modified CaMV 35S 프로모터에 연결시킨 pFGL586 벡터를 제조하였고 (Fig.
이론/모형
- 벼 형질전환을 위해 제작된 벡터를 freeze-thaw 방법[17]을 이용하여 Aff-dbacteriwn tunefadens 균주 PC2760으로 도입하였고, 벼(Kitake)의 비성숙 embryo로부터 유래된 캘러스에 형질 전환하였다[16]. 30 mg/1 hygromydn이 포함된 MS 배지에서 종자를 발아시켜 형질전환체를 선별하였다.
- 애기장대 형질전환을 위해 제작된 벡터를 freeze-thaw 방법[1 기을 이용하여 Afftbacferium tumefaciens 균주 GV310L로 도입하였고, floral-dipping 방법[9]을 이용하여 애기장대로 형질 전환하였다. 25 mg/1 kanamydn0] 포함된 MS 배지에서 종자를 발아시켜 형질전환체를 선별하였다.
성능/효과
- 이 벡터들은 크기가 작고, 박테리아 내에 high copy로 존재하며, 다중 클로닝 부위에 다양한 제한효소 부위를 가지고 있고, 전체 서열이 알려져 있는둥의 장점을 가지고 있다. GUS 또는 sGFP 리포터 유전자를 포함하는 형질전환 식물체를 제조하여 modified CaMV 35S, UBQ3, UBQ10 프로모터 의 활성을 분석한 결과, 세 프로모터 모두 발아 후 대부분의 발달단계와 성숙한 식물체의 꽃 기관에서 높은 활성을 보였다. 한편, 식물에서 유전자 발현 억제에 이용할 수 있는 RNAi 기본 벡터인 pFGL727을 제조하였고, PFGL727을 이용한 벼 RNAi 형질전환체의 분석을 통해 이 벡터가 유전자의 발현 억제에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다.
- IB). GUS 유전자를 리포터 유전자로 사용하여 세 벡터의 유용성을 형질전환 식물체에서 확인한 결과,modified CaMV 35S, UBQ3, UBQ10의 세 프로모터 모두 애기장대의 여러 발달단계 및 꽃 기관에서 발현됨을 확인하였고(Fig. 2와 4), modified CaMV 35S의 경우 이러한 결과를 sGFP를 리포터 유전자로 사용하여 재확인 하였으며, 전사체 수준에서도 재확인 하였다(Fig. 3). 특히, modified CaMV 35S 프로모터의 경우 intact CaMV 35S::omega 프로모터와 비교했을 때 좀 더 높은 활성을 보였다(Fig.
- 대상 유전자의 암호화 부위의 일부에 대한 역반복 서열만으로도 효과적이어세26], 역반복 서열을 만들기 위해 전체 암호화 부위를 사용할 필요가 없다. PFGL727 벡터의 경우 OSEMF1 유전자의 세 번째 인트론을 spacer로 사용하였고, spacer의 왼쪽 및 오른쪽으로 각각 5개, 8개의 제한효소 부위가 있어 역반복 서열의 클로닝이 매우 용이할 것으로 판단된다(Fig. IB). RNAi 벡터를 제조하기 위해, 발현을 억제시키고자 하는 대상 유전자에 대해 동일한 유전자-특이적 부위를 spacer 양쪽에 역반복이 되도록 클로닝 하면 되는데, pFGL727의 경우 spacer 양쪽에 제한효소 부위가 많아 한 종류의 프라이머만으로도 역반복 서열의 클로닝이 가능하다.
- 조사하였다. UBQ3 와 UBQ10 프로모터 모두 수술과 암술에서 강한 발현이 관찰되었으며, UBQ3 프로모터의 경우 일부 꽃의 꽃잎에서 활성이 관찰되었다(Fig. 4B). 이러한 결과는 본 연구에서 제조된 pFGL846과 pFGL847 모두 꽃 기관에서 유전자의 과발현에 유용하게 이용될 수 있음을 의미한다.
- Ti 형질전환 식물체 5개를 대상으로 RT-PCR을 수행하여 OSDEG10유전자의 발현 정도를 확인하였다. 그 결과 1번, 2번과 5번 세 개식물체에서 OSDEG10 발현이 야생형에 비해 현저히 감소한 것을 확인하였다(Fig. 5). 이러한 결과를 통해 pFGL727이식물 유전자의 발현 억제에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
- Intact CaMV 35S::omega 프로모터 는 변형되지 않은 CaMV 35S 프로모터 에 단백 질 발현량을 높이는 것으로 보고된 omega 서열을 첨가한 것으로 CaMV 35S 프로모터 그 자체에 의한 것 보다 발현량을 더 높여주는 것으로 보고되어 있다[19]. 따라서 본 연구의 결과는 pFGL5기이 유전자 과발현에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다. 특히, CaMV 35S 프로모터는 대부분의 쌍자엽 식물에서 유사한 발현 경향을 보이는 것으로 알려져 있기 때문에 [19, 3035], 본 연구에서 제작한 pFGL571 벡터는 대부분의 쌍자엽 식물에서 유전자의 과발현을 위해 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 이용하여 조사하였다. 먼저 Ti 형질전환 식물체를 대상으로 GFP의 과발현을 RT-PCR을 수행하여 조사한 결과, 야생 형에서는 sGFP 발현이 관찰되지 않았지만, 서로 다른 5개 Ti 식물체에서는 sGFP의 전사체를 많이 관찰할 수 있었다(Fig. 3A). 이들 Ti 라인들의 T2 식물체를 대상으로 sGFP 활성을 형광현미경으로 분석한 결과, 발아한지 8일 및 15일된 유식 물체의 자엽, 하배축, shoot 정단 부위 및 뿌리에서 강한 sGFP signal을 확인할 수 있었다(Fig.
- 먼저, T2와 T3 세대 형질전환 식물체들은 매우 유사한 GUS 발현 양상을 보였다. Modified CaMV 35S 프로모터 의 경우, 발아한지 7일된 유식물체의 자엽에서 GUS가 약하게 관찰되었으며, 11일, 14일, 21일된 유식물체의 자엽 및 잎에서 강한 GUS 발현이 관찰되 었다(Fig.
- pFGL847 벡터의 유용성을 조사하였다. 먼저, 서로 다른 최소 4개 Ti 라인에서 유래한 T2 식물체들은 유사한 GUS 발현 양상을 보였으며, UBQ3과 UBQ10 프로모터 형질전환체모두 관찰된 모든 발달단계의 뿌리 에서 강한 GUS 활성을 보였다(Fig. 4A). UBQ3 프로모터의 경우, 발아 후 4일째와 7일째 유식 물체의 지상부에는 GUS 활성 이 거의 관찰되지 않았으나, 11일된 유식물의 자엽과 14일 및 21일된 식물체의 자엽 및 뿌리에서 GUS 활성이 관찰되었다(Fig.
- 쌍자엽 식물에 형질전환할 경우 본 연구에서 제조된 pFGL571, pFGL846 또는 pFGLS47을 과발현용 벡터로 이용할 수 있을 것이다. 실제로 벼의 OsDEG10 유전자를 대상으로 pFGL727 벡터를 이용하여 제조한 벼의 형질전환 식물체에서 발현 억제 효과를 조사한 결과, 5개의 Ti 식물체 중 3개 라인에서 유전자 발현이 확연하게 감소함을 확인하였다(Fig. 5). 이러한 결과는 pFGL727。] RNAi 라인 제조를 기본 벡터로 유용하게 이용될 수 있음을 의미한다.
- 3A). 이들 Ti 라인들의 T2 식물체를 대상으로 sGFP 활성을 형광현미경으로 분석한 결과, 발아한지 8일 및 15일된 유식 물체의 자엽, 하배축, shoot 정단 부위 및 뿌리에서 강한 sGFP signal을 확인할 수 있었다(Fig. 3B). 이러한 결과는 GUS 활성 결과와 유사하며, 따라서 modified CaMV 35S 프로모터 는 유식물 단계를 포함한 대부분의 발달단계에서의 과발현에 유용하게 사용될 수 있는 것으로 여겨진다.
- 3B). 이러한 결과는 GUS 활성 결과와 유사하며, 따라서 modified CaMV 35S 프로모터 는 유식물 단계를 포함한 대부분의 발달단계에서의 과발현에 유용하게 사용될 수 있는 것으로 여겨진다.
- 2A). 이러한 결과는 modified CaMV 35S 프로모터가 특정 유전자의 과발현에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
- 4B). 이러한 결과는 본 연구에서 제조된 pFGL846과 pFGL847 모두 꽃 기관에서 유전자의 과발현에 유용하게 이용될 수 있음을 의미한다.
- 4A). 이러한 결과를 바탕으로 UBQ3와 UBQ10 프로모터 모두 유전자의 과발현에 유용하게 사용될 수 있으며, 발아 후 초기 단계부터 유전자의 과발현을 원하는 경우 UBQ3 보다는 UBQ10 프로모터가 더 유용함을 알 수 있었다.
- 5). 이러한 결과를 통해 pFGL727이식물 유전자의 발현 억제에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
- 3). 특히, modified CaMV 35S 프로모터의 경우 intact CaMV 35S::omega 프로모터와 비교했을 때 좀 더 높은 활성을 보였다(Fig. 2B). Intact CaMV 35S::omega 프로모터 는 변형되지 않은 CaMV 35S 프로모터 에 단백 질 발현량을 높이는 것으로 보고된 omega 서열을 첨가한 것으로 CaMV 35S 프로모터 그 자체에 의한 것 보다 발현량을 더 높여주는 것으로 보고되어 있다[19].
- GUS 또는 sGFP 리포터 유전자를 포함하는 형질전환 식물체를 제조하여 modified CaMV 35S, UBQ3, UBQ10 프로모터 의 활성을 분석한 결과, 세 프로모터 모두 발아 후 대부분의 발달단계와 성숙한 식물체의 꽃 기관에서 높은 활성을 보였다. 한편, 식물에서 유전자 발현 억제에 이용할 수 있는 RNAi 기본 벡터인 pFGL727을 제조하였고, PFGL727을 이용한 벼 RNAi 형질전환체의 분석을 통해 이 벡터가 유전자의 발현 억제에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다. 연구 결과를 종합해 보면, 본 연구에서 제조한 벡터들은 식물에서 유전자 과발현과 발현 억제에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
후속연구
- 본 연구 결과를 종합할 때, 본 연구에서 제조된 pFGL571, PFGL846 그리고 pFGL847은 쌍자엽식물에서 유전자 과발현에 유용하게 사용될 수 있고, PFGL727은 쌍자엽식물 및 단자엽식물에서 유전자의 발현 억제를 위한 효율적인 RNAi 기본벡터로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
- pFGL727에 클로닝 된 역반복 서열 부위는 쌍자엽식물 또는 단자엽식물 과발현용 벡터에 옮겨 식물체로 형질전환할 수 있다. 쌍자엽 식물에 형질전환할 경우 본 연구에서 제조된 pFGL571, pFGL846 또는 pFGLS47을 과발현용 벡터로 이용할 수 있을 것이다. 실제로 벼의 OsDEG10 유전자를 대상으로 pFGL727 벡터를 이용하여 제조한 벼의 형질전환 식물체에서 발현 억제 효과를 조사한 결과, 5개의 Ti 식물체 중 3개 라인에서 유전자 발현이 확연하게 감소함을 확인하였다(Fig.
- 한편, 식물에서 유전자 발현 억제에 이용할 수 있는 RNAi 기본 벡터인 pFGL727을 제조하였고, PFGL727을 이용한 벼 RNAi 형질전환체의 분석을 통해 이 벡터가 유전자의 발현 억제에 유용하게 이용될 수 있음을 확인하였다. 연구 결과를 종합해 보면, 본 연구에서 제조한 벡터들은 식물에서 유전자 과발현과 발현 억제에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 2B). 이러한 결과는 modified CaMV 35S 프로모터 가 꽃 기관에서의 과발현에도 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다.
- 따라서 본 연구의 결과는 pFGL5기이 유전자 과발현에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 나타낸다. 특히, CaMV 35S 프로모터는 대부분의 쌍자엽 식물에서 유사한 발현 경향을 보이는 것으로 알려져 있기 때문에 [19, 3035], 본 연구에서 제작한 pFGL571 벡터는 대부분의 쌍자엽 식물에서 유전자의 과발현을 위해 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다. 한편, UBQ3 보다 UBQ10 프로모터의 활성이 더 이른 초기 발달단계에서 관찰되었기 때문에(Fig.
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