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문제 정의
- 이러한 관점에서 허혈-재관류에 의해 유도된 급성 폐손상의 기전을 알아보기 위하여 기존에 연구결과가 많이 알려진 phospholipase A2 (PLA2) 억제제인 mepacrine과 비특이성COX 억제제인 아스피린의 효과를 동물모델에서 비교해보고, 급성 폐손상에 관여할 것으로 여겨지는 대식세포 RAW264.7 과 급성 폐손상시 염증성 반응이 직접 일어나는 기도 상피세포인 A549 세포에서 COX-2의 발현을 알아보고자 본 연구를시행하였다.
제안 방법
- 정상군은 허혈-재관류 처치군과동일하게 수술하되 복부절개만 시행하였고, 나머지군은 허혈-재관류 처치군과 동일하게 처리하였다. Mepacrine (60 mg/ kg) 및 아스피 린(10 mg/kg)은 허혈-재관류 처치 30분 전에 복강 내로 주사하였다
- 급성 폐손상시 아스피린이 나타내는 염증 억제작용의 기전 을 이해하기 위하여 쥐에서 장 허혈-재관류에 의한 급성 폐손 상을 유발하여 phospholipase A2 억제제인 mepacrine과 아스 피린의 효과를 비교하였다. 내독소 처치시 A549 세포와 RAW264.
- 세포는 10% FBS와 1% penicillin/stereptomydn을 첨가한 DMEM-low glucose 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 24시간 동안 배 양하였으며 2~3일 간격으로 계대 배양하여 실험에 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 씻은 다음 각 세포를 2X105 cells/ml로 분주한 뒤 세포의 염증반응을 유발하는 LPS에 의한 COX-2 단백질의 발현을 보기위하여 0, 0.1, 1 및 2 ug/ml 농도의 LPS를 12시간 동안 처리하여 배양하였다. 배양 후 배양액을 제거하고 세포를 scraper로 긁어모아 4℃, 12, 000 rpm으로 5분간 원심분리 하여 상둥액을 제거하고 IPH lysis buffer [50 nm Tris (pH 8.
- 횐쥐를 사용하였다. 실험군은 각각 정상군(Sham), 허혈-재관류 처치군(I/R), mepacrine을 전처치한 허혈-재관류 처치군 (Mepa+1/R) 및 아스피린을 전처치한 허혈-재관류 처치군 (ASA+I/R)으로 분류하였다. 정상군은 허혈-재관류 처치군과동일하게 수술하되 복부절개만 시행하였고, 나머지군은 허혈-재관류 처치군과 동일하게 처리하였다.
- 장관 및 폐장 조직의 손상을 확인하기 위하여 실험동물을 충분히 마취한 뒤, 양측 폐장 및 소장 일부를 절제하고 10% 포르말린 용액에 담근 다음 조직을 박절하고 hematoxyline-eosin 용액으로 염색 후 검경하였다.
- 장의 허혈-재관류에 따른 조직내 염증성 호중구의 침윤정도를 알아보기 위하여 MPO 활성도를 측정하였다. 허혈-재관류 처치군의 폐장(26.
- 장의 허혈-재관류에 의한 급성 폐손상을 유도하기 위하여 ketamine (80 mg/kg)과 xylazine (16 mg/kg)을 복강 내로 주 사하여 마취한 후 개복술을 시행하여 btdldog 클램프를 이용 하여 1시 간 동안 상장간막동맥 (superior mesenteric artery)의 혈류를 차단하였다. 그 후 클램프를 풀고 4시간 동안 재관류 (reperfusion)시켜 급성 폐손상을 유발하였다.
대상 데이터
- 7 세포는 American Type Culture Collection에서 구입하였다. 세포는 10% FBS와 1% penicillin/stereptomydn을 첨가한 DMEM-low glucose 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 24시간 동안 배 양하였으며 2~3일 간격으로 계대 배양하여 실험에 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 씻은 다음 각 세포를 2X105 cells/ml로 분주한 뒤 세포의 염증반응을 유발하는 LPS에 의한 COX-2 단백질의 발현을 보기위하여 0, 0.
- 세포배 양에 사용된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)-low glucose 배지, fetal bovine serum (FBS) 및 pen- icillin/stereptomycin은 GIBCO-BRL (Grand Island, NY, USA)에서, p38 MAPK 억제제인 SB203580은 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서, COX-2 일차항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고, 기타실험 재료는 Sigma (St Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 실험동물은 체중 260~300 g 정도의 Sprague-Dawley 종 수컷 횐쥐를 사용하였다. 실험군은 각각 정상군(Sham), 허혈-재관류 처치군(I/R), mepacrine을 전처치한 허혈-재관류 처치군 (Mepa+1/R) 및 아스피린을 전처치한 허혈-재관류 처치군 (ASA+I/R)으로 분류하였다.
- 실험동물의 마취제로 사용한 Enflurane은 일성신약주식회사, Xylazine은 Haver (New Yark NY, USA) 제품을 이용하였다. 세포배 양에 사용된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)-low glucose 배지, fetal bovine serum (FBS) 및 pen- icillin/stereptomycin은 GIBCO-BRL (Grand Island, NY, USA)에서, p38 MAPK 억제제인 SB203580은 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서, COX-2 일차항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였고, 기타실험 재료는 Sigma (St Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 실험에 사용한 A549 세포와 RAW264.7 세포는 American Type Culture Collection에서 구입하였다. 세포는 10% FBS와 1% penicillin/stereptomydn을 첨가한 DMEM-low glucose 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 24시간 동안 배 양하였으며 2~3일 간격으로 계대 배양하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 성적은 평균±표준오차로 표시하였고, 각 성적의 유의 성은 ANOVA test 후에 Student-Newman-Keuls multiple comparison test를 이용하여 p 값이 0.05보다 작은 경우를 통 계적으로 유의하다고 판정하였다.
이론/모형
- Membrane은 COX-2 일차항체와 반응시키고 anti-rabbit 이차항체와 반응시켰다. 항체들에 대한 발현분석은 Horseradish Peroxidase- linked 이차항체 에 의해 발현되는 ECL Western Blot Analysis 시스템을 이용하여 결과를 얻었다.
- 호중구의 장관 및 폐장 조직 내 침윤 정도를 알아보기 위하 여 Goldblum 둥[11]의 방법 에 따라 myeloperoxidase (MPO) 활성도를 측정하였다.
성능/효과
- LPS 처리 농도가 증가할수록 COX-2의 발현이 증가하였는데, 염증성 세포인 RAW264.7 세포에서 더 많이 증가하였다 (Fig. 1). LPS 처리 시간에 따른 변화도 상피세포인 A549 세포가 RAW264.
- NADPH oxidase 억제작용이 있는 apocynin과 p38 MAPK 억제제인 SB203580은 A549 세포와 RAW264.7 세포의 LPS에 의한 COX-2 발현을 억제시켰으며 RAW264.7 세포에서 더 크 게 억제되었다.
- 염증 반응시 COX-27} 증가하는 것은 산 흡입[8] 이나급성 염증 시[2디에 볼 수 있는 현상과 일치하는 것으로 초기염증 반응에 COX-2가 중요한 요인이 되며 이를 차단하는 약제가 치료에 도움이 될 것이라는 것을 시사한다. 더불어 A549 세포보다 RAW264.7 세포에서의 COX-2 발현이 빠르고, 더 크게 나타나는 것으로 보아 두 세포간의 조절기전이나 작용시간이 다르며, 대식세포가 상피세포보다 염증반응 조절에 더 깊게 관여할 것이라고 생각된다.
- 염증세포는 호중구 외 에도 여 러 종류가 있으나 MPO의현저한 증가는 호중구가 조직에 많이 침윤되었다는 것을 의미한다. 본 실험에서도 내장 허혈-재관류를 시행한 실험군에서폐장의 MPO 활성도가 유의하게 증가하여 급성 폐손상이 염증반응에 의해 일어났음을 보여주었다. 허혈-재관류 실험 모델에서 장관조직의 MPO 활성도가 증가한다는 보고[14, 38]들이 있는데, 본 실험에서도 동일한 결과를 얻었다.
- 3). 소장 조직의 MPO 활성도도 폐장 조직의 MPO 결과와 비슷한 양상을 나타내었는데, 허혈-재관류 처치군의 소장 조직(3.46±0.81)은 정상군(0.93±0.06 U/g of wet intestine)에 비해 유의하게 증가하였다. 폐장 조직의 결과와는 달 리 mepacrine 전처치 시에는 2.
- 이상의 결과를 통해서 아스피린이 급성 폐손상의 예방목적 으로 사용될 수 있다고 보여지며, RAW264.7 세포와 A549 세 포에서 COX-2 발현은 다른 특성을 보여서 다른 조절기전이 있을 것으로 생각된다.
- 이와 같은 결과를 토대로 살펴보면 허혈-재관류에 따른 급성 폐손상은 일련의 염증성 반응으로 유발되며, 염증반응에의한 COX-2의 발현은 상피세포보다는 대식세포 같은 염증세포에서의 발현이 더 크게 나타나서 다른 조절기전이 존재하는것으로 생각된다. 급성 심근경색의 예방 및 재발 목적으로 널리 사용되고 있는 아스피린이 일반적인 항혈전 용량으로도이와 같은 효과를 나타낼 수 있다고 하므로[23], 아스피린이허혈-재관류에 의한 급성 폐손상의 예방목적으로 사용 될 수있을 것으로 생각된다.
- 7 세포의 반응이 더 크게 나타났다. 장의 허혈-재관류에 의해 장관 및 폐장조직에서 myeloperoxidase 활성도가 증가하여 염증성 호중구의 침윤이 증가했음을 보여 주었다. 조직 소견상에서도 조직 손상과 염증세포의 침윤이 관찰되 었으며, 이는 아스피 린 또는 mepacrine 전처치 시 억제 되었다.
- 조직의 손상정도를 확인하기 위하여 광학현미경으로 검경 한 결과 폐장 및 소장조직은 허혈-재관류에 의한 조직 손상과 염증세포의 침윤이 관찰되었으며/ mepacrine과 아스피린 전 처치한 군에서는 조직 손상정도가 줄어든 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 5, 6)
- 06 U/g of wet intestine)에 비해 유의하게 증가하였다. 폐장 조직의 결과와는 달 리 mepacrine 전처치 시에는 2.78±0.75, 아스피린 처치 시에는 2.38+0.30(U/g of wet intestine)로 통계 적 인 유의 성은 없으나 MPO 활성도가 감소하는 경향을 보였다(Fig. 4).
- 알아보기 위하여 MPO 활성도를 측정하였다. 허혈-재관류 처치군의 폐장(26.34±2.69)은 정상군(12.75±0.10 U/g of wet lung) 에 비해 유의하게 증가하였으며/mepacrine(18.90± 0.69) 및 아스피 린 전처치 시 (17.41 ±1.23 U/g of wet lung) 허 혈-재관류 처치군의 폐장에 비해 MPO 활성도가 현저히 둔화 되었다(Fig. 3). 소장 조직의 MPO 활성도도 폐장 조직의 MPO 결과와 비슷한 양상을 나타내었는데, 허혈-재관류 처치군의 소장 조직(3.
- 허혈-재관류 실험 모델에서 장관조직의 MPO 활성도가 증가한다는 보고[14, 38]들이 있는데, 본 실험에서도 동일한 결과를 얻었다. 허혈-재관류를 시행하기 전 mepacrine 또는 아스피린을 전처치한 경우에서 MPO 활성도는 크게 억제되었다. 이와 같은 MTO 활성도의감소는 이들 약물에 의한 염증작용의 억제 효과로 호중구 침윤이 차단되어 나타난 결과라고 볼 수 있다.
- Zou 둥[38]은 허혈 -재관류 시 장관 조직에서 상피세포 손상, 염증세포 침착 둥을보고하였는데, 본 실험 결과에서도 장 융모(villi)의 탈락과 염증세포 침착을 전반적으로 관찰 할 수 있었다. 허혈-재관류에의한 이상의 조직 손상 소견은 mepacrine이나 아스피린을 전처치 한 군에서 현저히 감소한 것을 볼 수 있었다. 그러므로심한 출혈 및 장 허혈-재관류에 의한 급성 폐손상에 PLA2와 COX-27} 주된 요인이 되며 이를 적절히 차단 또는 조절하는것이 치료에 도움이 될 것이라는 사실을 보여준다.
후속연구
- 급성 심근경색의 예방 및 재발 목적으로 널리 사용되고 있는 아스피린이 일반적인 항혈전 용량으로도이와 같은 효과를 나타낼 수 있다고 하므로[23], 아스피린이허혈-재관류에 의한 급성 폐손상의 예방목적으로 사용 될 수있을 것으로 생각된다. 그러나 예방목적이 아닌 치료목적의아스피린이 효과를 나타낼 수 있을지를 알아보기 위해서는 COX-2의 조절과 연관된 다른 조절기전에 미치는 영향도 고려해야 하므로 더 많은 연구결과가 필요할 것으로 생각된다.
- 최근 많은 연구가되고 있는 COX-2 억제제를 아스피린 대신 사용할 경우에는 COX-27} 초기 에는(2시 간) 염증반응을 유발하지만, 나중에는 (48시간) 염증을 억제하고 회복에 관여한다는 보고[8-1이를 고려해야 될 것 같다. 그러므로 COX-2를 단순히 억제하는 것은중요한 문제를 유발할 수 있으므로 COX-2 억제를 통한 항염증작용에 대하여 더 많은 연구가 이루어져야 할 것으로 생각된다.
- 그리고 p38 MAPK 억제제인 SB203580도 COX-2 발현과 cytokine 생성을억제하지만[34], 허혈-재관류시의 보호기전을 차단해서 세포손상을 유발한다는 보고도 있다[26]. 본 실험에서도 apocynin 과 SB203580에 의해서 LPS에 의한 COX-2 증가가 둔화된 것으로 나타났는데, 급성염증의 치료목적으로 시용할 수 있는지알아보기 위해서는 추가적인 실험이 절실하다고 생각된다.
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