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문제 정의
- 2) 자원에는 saponin, epifriedelin, friedelin, shionone, astersaponin 등이 함유되어 있다.3-6) 본 연구실에서는 국내 자생식물로부터 생리활성 물질 탐색에 대한 연구를 계속해왔으며 생리활성검색 결과 자원의 에틸아세테이트 분획물이 항산화 활성 및 IL-6 방출에 영향을 미치는 것이 관찰되어 이들 분획으로부터 활성물질의 정제를 시도하고자 본 연구에 착수하였다. Human interlukin (hIL)-6는 cytokine의 일종으로 일부는 림프구 계통의 세포가 생성하며 면역조정 역할을 하고 조혈 작용을 조절하는 것으로 알려져 있다.
제안 방법
- −융점측정기는 Fisher Scientific (Model 307N0043, Canada)를 사용하였고 선광도는 AUTOPOL® automatic polarometer (Rudolph Research Flangers, NJ 07836)를 사용하였으며 IR 스펙트럼은 JASCO FT/IR-300E (JASCO Co., Japan)를 사용하였다.
- 7-8) 세포는 TNF-α에 의해서 damage를 받게 되고 이때 IL-6가 세포 밖으로 방출되게 되는데 본 실험에서는 MG-63세포를 이용하여 자원으로부터 분리한 화합물들이 Il-6의 유리에 어떠한 영향을 미치는 가를 측정하였다.
- Cytotoxicity Assay −본 실험에서는 SRB 검색법을 이용하여 세포독성을 측정하였으며 사용한 세포주는 MG-63으로 세포주는 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하고, 10회 이상 계대한후 tripsinization (trypsin-EDTA)하여 single cell suspension 을 확보한 뒤, 세포의 성장속도를 고려하여 적정수의 세포(3×104)를 96-well plate에 200 μl씩 접종하였다.
- IL-6의 저해활성은 Inhibition (%) = (A-B)/A × 100 [Where A is the IL-6 concentration when the TNFa only was treated, and B is the IL-6 concentration when the compounds were treated] 로 하였다.
- NBT Superoxide Scavenging Assay − NBT superoxide scavenging assay는 조금 수정된 방법을 사용하였다.
- 두 개의 anomeric proton이 각각 δ 4.22(1H, d, J=8.0 Hz, H-1')와 5.02 (1H, d, J= 2.5 Hz, H-1") 로 coupling constant가 나타났고 문헌치와의 비교를 통해 두개의 당이 각각 β로 결합한 것으로 추정하였다.
- 1에서 관찰되었다. 또한 1H-1H COSY와 HSQC spectrum을 통하여 각각의 carbon과 proton을 귀속시킨 후 HMBC spectrum에서 C-8과 glucose의 1번 수소, glucose 6번 탄소와 apiose 1번 탄소 사이의 correlation peak를 확인하여 각 결합위치를 확인하였다. 이상의 분광학적인 결과 및 문헌상의 data와의 비교를 통해 화합물 4는 shionoside A로 동정하였다.
- 0)으로 염색된 세포를 부유시켜, micro plate reader를 사용하여 540 nm에서 OD(optical density)를 측정하였다. 세포주에 대해 대조군의 평균 OD값과 실험군의 평균 OD값을 비교하여 세포독성(%)을 구하였다.11-13)
- 시료는 DMSO에 10 mg/ml 되도록 용해시키고, 실험 농도에 따라 serial dilution하여 DMSO의 최종 농도가 1% 이하가 되도록 100 μl 씩 각 well에 첨가 하였다.
- 여기에 TNF (tumor necrosis factor)-α와 세포독성이 없는 농도의 sample을 처리한 후 37℃ incubator에서 배양한 후 24시간과 48시간 뒤 각각 70 μl씩 배지를 채취하여 냉동 보관하였다.
- 0 g의 분획물을 얻었다. 항산화활성을 나타낸 EtOAc 분획 7 g을 silica gel을 이용하여 컬럼 크로마토그라피를 실시하였다. 용매는 CH2Cl2 : EtOAc : MeOH = 20: 1 : 1을 이용하여 용출시키고 각각의 분획들은 TLC pattern에 따라 유사한 것들을 합쳐 8개의 sub-fraction을 얻었다.
대상 데이터
- −본 실험에 사용한 자원(Aster tataricus L.)은 광주 시내의 약재상에서 구입하여 감정한 후 사용하였으며 자료의 일부는 표준품(CU-958)으로 조선대학교 약학대학 표본실에 보관하고 있다.
- , Japan)를 사용하였다. FAB-MS는 JMS 700 (JEOL, Japan)을 사용하였고 1H-NMR과 13C-NMR은 VARIAN Unity Inova 500 및 JEOL JNM-LA 300을 사용하였다. 분취용 컬럼 크로마토그라피의 packing material로는 Kieselgel 60 (230-400 mesh, ASTM, Art.
- Thin layer chromatography용 plate는 precoated silica gel 60 F254 plate (layer thickness 0.25 mm, 20×20 cm, Art. 5715, Merck)와 precoated RP-18 F254 S plate (layer thickness 0.25 mm, 20×20 cm, Art. 15423, Merck)를 사용하였으며 추출 및 컬럼 크로마토그라피용 용매는 1급 시약을 기타시약은 1급 또는 특급을 각각 사용하였으며 발색시약으로는 10% H2SO4를 사용하였다.
- 분취용 컬럼 크로마토그라피의 packing material로는 Kieselgel 60 (230-400 mesh, ASTM, Art. 9385, Merck), Kieselgel 60 (40-60 μm, Art. 9385, Merck), LiChroprep RP-18 (40-63μm, Merck), Lipophilic Sephadex LH-20 (Bead size 25-100 μm, Sigma)을 사용하였다.
- 여기에 xanthine oxidase (1 unit in 10 ml buffer)용액 50 μl를 넣은 후 25℃ incubator 안에서 30분 동안 산화가 일어나도록 반응을 시킨 다음 570 nm microplate reader를 통해 흡광도를 측정하였다. 시료를 녹였던 5% DMSO in buffer 용액을 control로 하였으며 실험의 표준물질로는 allopurinol을 사용하였다. 항산화 활성(%)은 control에 대한 상대적인 퍼센트 즉, [(rate of control - rate of sample reaction)/rate of control]×100으로 표시하였다.
성능/효과
- 13C-NMR spectrum에서는 C-3가 δ136.1로 이동되어 나타나므로 hydroxyl기로 치환되어 있음을 알 수 있었고, δ 176.4 에서 C-4의 carbonyl기를 관찰할 수 있었으며 δ 159.7의 피크로 C-4'위의 수소가 hydroxyl기로 치환되어 있음을 알 수 있었다.
- 1H-NMR spectrum의 aromatic 영역에서 화합물 1과 아주 흡사한 스펙트럼을 나타냈으며 δ 5.23 (1H, d, J=7.5 Hz)의 피크 및 δ3.56-3.09에 당의 수소 피크가 관찰되어 화합물 3은 kaempferol glycoside로 추정할 수 있었다.
- 이상의 결과들은 13C-NMR spectrum에서도 확인할 수 있었다. 분광학적인 결과 및 문헌상의 data와의 비교를 통해 화합물 3은 astragalin으로 동정하였으며 이 식물로부터는 처음으로 분리된 화합물이었다.16-19)
- 09에 당의 수소 피크가 관찰되어 화합물 3은 kaempferol glycoside로 추정할 수 있었다. 산가수분해 결과 비당체 부분 kaempferol로 확인되었고 당 부분은 TLC 결과 표준품인 D-glucose와 일치하였다. 당의 결합형태는 anomeric 수소의 결합상수가 7.
- 이들 결과로부터 화합물 1-4의 IL-6 유리(%)는 69.2±6.01, 80.4±3.25, 67.8±4.13, 100±10.67%로 각각 나타나 화합물 4는 전혀 활성이 없으며 화합물 1-3은 약한 IL-6 유리 저해활성을 나타내는 것으로 관찰되었다.
- 5 Hz로 나타나 β-결합을 하고 있는 것으로 추정되었다. 이상의 결과들은 13C-NMR spectrum에서도 확인할 수 있었다. 분광학적인 결과 및 문헌상의 data와의 비교를 통해 화합물 3은 astragalin으로 동정하였으며 이 식물로부터는 처음으로 분리된 화합물이었다.
- 7의 피크로 C-4'위의 수소가 hydroxyl기로 치환되어 있음을 알 수 있었다. 이상의 분광학적인 결과 및 문헌상의 data와의 비교를 통해 화합물 1은 kaempferol로 동정하였다.16-19)
- 7에서 관찰되었다. 이상의 분광학적인 결과 및 문헌상의 data와의 비교를 통해 화합물 2는 quercetin으로 동정하였다.16-19)
- 또한 1H-1H COSY와 HSQC spectrum을 통하여 각각의 carbon과 proton을 귀속시킨 후 HMBC spectrum에서 C-8과 glucose의 1번 수소, glucose 6번 탄소와 apiose 1번 탄소 사이의 correlation peak를 확인하여 각 결합위치를 확인하였다. 이상의 분광학적인 결과 및 문헌상의 data와의 비교를 통해 화합물 4는 shionoside A로 동정하였다.20)(Fig.
- 자원 EtOAc의 분획으로부터 분리한 화합물 1-4에 대해서 NBT superoxide scavenging assay에 의한 항산화 활성을 검토한 결과(Table 1 참조) quercetin의 IC50 값이 19.3 μg/ml로 가장 강력한 활성을 나타냈고 이와 같은 활성은 화합물 구조에 있어서 ortho-dihydroxy (catechol)에 기인한 것으로 판단되었다.
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