[논문]목천료의 RAW264.7과 BV2 세포주에서의 일산화질소 생성 억제효과 트리테르펜

리소군; 김관우; 고원민; 김동철; 윤치수; 유향전; 오현철; 김윤철

목천료의 RAW264.7과 BV2 세포주에서의 일산화질소 생성 억제효과 트리테르펜
Triterpenes with Inhibitory Effects of Nitric Oxide Production from the Fruit Galls of Actinidia polygama on LPS-Induced RAW264.7 and BV2 Cells 원문보기

생약학회지, v.48 no.2, 2017년, pp.108 - 112

리소군 (원광대학교 약학대학 약품연구소) , 김관우 (원광대학교 약학대학 약품연구소) , 고원민 (원광대학교 약학대학 약품연구소) , 김동철 (원광대학교 약학대학 약품연구소) , 윤치수 (원광대학교 약학대학 약품연구소) , 유향전 (후난중의약대학) , 오현철 (원광대학교 약학대학 약품연구소) , 김윤철 (원광대학교 약학대학 약품연구소)

Abstract ▼ AI-Helper

To isolate and identify the constituents of the fruit galls of Actinidium polygama as well as evaluate the anti-inflammatory effects of the isolated compounds, a total of five triterpenes were isolated including $2{\alpha},3{\alpha},24$-trihydroxy-12-ursene-23-al-28-oic acid (1), corosolic acid (2), $2{\alpha},3{\alpha},24$-trihydroxyurs-12,20(30)-dien-28-oic acid (3), $2{\alpha},3{\alpha},24$-trihydroxyolean-12-en-28-oic acid (4), and $2{\alpha},3{\alpha},24$-trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (pygenic acid B) (5). Compounds 1, 3, and 4 were isolated from the fruit galls of A. polygama for the first time. Compound 3 decreased NO production in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages and mouse microglia BV2 cells in a concentration-dependent manner.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

²⁾ 이것을 목천료(木天蓼)라 부르며, 민간에서 류마티스 관절염과 통풍의 치료에 사용되고 있다.³⁾ 저자들은 목천료의 민간요법에 착안하여 항염증작용과 밀접한 관계가 있는 일산화질소 생성억제효과를 나타내는 성분을 발견하고자 본 연구를 수행하였다.
연구에서는 민간에서 통풍치료에 사용되고 있는 목천 료 대하여 LPS로 유발시킨 RAW264.7 세포와 BV2 미세아 교세포에 있어서의 NO생성 억제물질을 탐색하고자 하였다. 목천료 메탄올 추출물에 대하여 용매분배법을 적용하여 분 획물을 제조하고, 각각의 분획물에 대한 NO생성억제 효과 를 검토한 결과, CHCl₃ 분획물과 EtOAc 분획물이 유의한 NO생성억제 효과를 나타냄을 확인하였다(자세한 결과는 생략함).
저자 등은 목천료가 민간에서 염증과 관련이 있다고 알려진 통풍의 치료에 사용되고 있는 점에 착안하여 LPS로 염증반응을 유발시킨 RAW264.7과 BV2 미세아교세포에 있어서 NO 생성억제 효과를 가지는 성분분리 연구를 수행하여 그 결과를 보고하고자 한다.

제안 방법

흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader를 이용하여 측정하였다. NMR 스펙트럼은 JEOL JNM ECP-400 spectrometer(400 MHz for ¹H and 100MHz for ¹³C)기기를 사용하여 측정하였다
3 g을 얻었다. 메탄올 추출물을 증류수 500 mL에 현탁 시킨 후 n-hexane, CHCl₃, EtOAc 순서로 분획한 후 각 분획들을 감압 농축하여 각각의 용매분획물을 얻었다. 이 중 EtOAc 분획물(8.
목천료 메탄올 추출물로부터 4개의 ursane골격과 1개의 oleanane골격 화합물을 분리하였으며, 이들의 구조는 NMR 스펙트럼 결과를 문헌에 게재된 것들과 비교하여 2α,3α,24-trihydroxy-12-ursene-23-al-28-oic acid (1), corosolic acid (2), 2α,3α,24-trihydroxyurs-12,20(30)-dien-28-oic acid (3), 2α,3α,24-trihydroxyolean-12-en-28-oic acid (4), 2α,3α,24- trihydroxyurs-12-en-28-oic acid (pygenic acid B) (5)로 동정하였다.
목천료 메탄올 추출물로부터 분리한 5개의 트리테르펜계 화합물 중 화합물 3 (2,3,24-trihydroxyurs-12,20(30)-dien-28- oic acid)은 80 µM까지의 농도에서 세포독성을 나타내지 않 았기 때문에 세포독성이 없는 농도 범위에서 LPS로 자극한 RAW264.7과 BV2 세포에 대한 NO생성 억제효과를 검토 하였다(Fig. 2).
세포 배양 − RAW264.7 세포와 BV2 미세아교세포(5×105 cells/well)는 10% heat-inactivated FBS, penicillin G (100 IU/mL), streptomycin (100 µg/mL), L-glutamine (2 mM)을 함유한 DMEM 배지에 분주하고 5% CO2 배양기 내에서 37℃의 온도로 배양하였다.
목천료 메탄올 추출물에 대하여 용매분배법을 적용하여 분 획물을 제조하고, 각각의 분획물에 대한 NO생성억제 효과 를 검토한 결과, CHCl₃ 분획물과 EtOAc 분획물이 유의한 NO생성억제 효과를 나타냄을 확인하였다(자세한 결과는 생략함). 이들 분획물에 대하여 Sephadex LH-20, 실리카 젤 컬럼크로마토그래피 및 HPLC를 실시하여 5개의 화합물(화합물 1~5)을 분리하였다. 분리된 물질들의 구조는 NMR spectra의 결과를 문헌과 비교하여 동정하였으며, 화합물 1~5 의 구조는 각각 2α,3α,24-trihydroxy-12-ursene-23-al-28-oic acid (1),¹¹⁾ corosolic acid (2),¹²⁾ 2α,3α,24-trihydroxyurs12,20(30)-dien-28-oic acid (3),¹³⁾ 2α,3α,24-trihydroxyolean12-en-28-oic acid (4),¹⁴⁾ 2α,3α,24-trihydroxyurs-12-en-28- oic acid (pygenic acid B) (5)¹⁴⁾로 확인되었으며(Fig.
¹⁵⁾ 이와 같은 사실에 입각하여 NO생성을 억제하는 물질의 발견연구는 여러 가지 염증성 질환의 치료제 개발을 위한 접근법 중의 하나로 인식되고 있다. 저자들은 식물 유래의 NO생성 억제물질을 탐색할 목적으로 LPS로 자극한 RAW264.7 대식세포와 BV2 미세아교세포를 이용한 NO생성 억제 검정방법을 이용하여 연구를 수행하였다.
96-Well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader를 이용하여 측정하였다. NMR 스펙트럼은 JEOL JNM ECP-400 spectrometer(400 MHz for ¹H and 100MHz for ¹³C)기기를 사용하여 측정하였다

대상 데이터

LPS와 3'-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)는 Sigma사에서 구입하였다. 96-Well tissue culture plates와 기타 tissue culture dishes는 Nunc사 제품을 이용하였다. 흡광도는 BioRad사의 Microplate Reader를 이용하여 측정하였다.
LPS와 3'-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)는 Sigma사에서 구입하였다.
시약 및 기기 − DMEM 배지, trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA), fetal bovine serum(FBS)는 Gibco Laboratorie사에서 구입하였다.
실험재료 − 본 실험에 사용한 목천료는 2015년 8월 충청남도 예산군에서 채집하였으며, 교신저자가 형태학적 평가를 통하여 동정하였고 표본시료(WK-2015-029)는 원광대학교 생약천연물학연구실에 보관하고 있다.

데이터처리

, San Diego, CA, USA)을 사용하였다. 각 실험군 간의 결과는 평균치와 표준오차로 나타내 었으며, 각 실험군 간의 결과는 ANOVA test를 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다.
통계처리 − 통계처리는 GraphPad Prism, version 3.03 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하였다.

이론/모형

Nitrite Assay − 배양된 RAW264.7 세포와 BV2세포에서 medium으로 분비되어 나온NO의 양을 Griess시약을 사용하여 측정 하였으며, 자세한 방법은 저자 등이 보고한 논문10) 에 따라 실시하였다.
세포 독성 − 연구시료의 실험 농도를 결정하기 위하여 MTT assay를 이용하여 RAW264.7 세포와 BV2 미세아교세포에 대한 독성을 확인하였으며, 자세한 방법은 저자 등 이 보고한 논문10)에 따라 실시하였다.

성능/효과

]는 다래나무과(Actinidiaceae)에 속하는 낙엽덩굴로서 꽃이 필 무렵에 잎의 일부 또는 전체가 흰색으로 변하는 특성이 있다.¹⁾ 이 식물의 열매는 종종 개다래나무 진딧물(Asphidylia matatabi)이 산란한 알이 부화하여 자람에 따라 불규칙한 벌레주머니 모양을 보인다.²⁾ 이것을 목천료(木天蓼)라 부르며, 민간에서 류마티스 관절염과 통풍의 치료에 사용되고 있다.
0007 w/w%)를 분리하였다. CHCl₃ 분획물 (2.47 g)은 CHCl₃-MeOH 용매계를 사용한 실리카젤 컬럼크 로마토그래피를 반복하여 정제하였으며, 최종적으로 HPLC (MeOH-H₂O = 4:1, 0.1% formic acid; 5 mL/min)를 사용하여 화합물 3 (3.0 mg, t_R = 22.5 min, 0.0005 w/w%), 4 (8.0 mg, t_R = 25.5 min, 0.0012 w/w%) 및 5 (20 mg, t_R = 27.0 min, 0.0031 w/w%)를 얻었다.
7 세포와 BV2 미세아 교세포에 있어서의 NO생성 억제물질을 탐색하고자 하였다. 목천료 메탄올 추출물에 대하여 용매분배법을 적용하여 분 획물을 제조하고, 각각의 분획물에 대한 NO생성억제 효과 를 검토한 결과, CHCl₃ 분획물과 EtOAc 분획물이 유의한 NO생성억제 효과를 나타냄을 확인하였다(자세한 결과는 생략함). 이들 분획물에 대하여 Sephadex LH-20, 실리카 젤 컬럼크로마토그래피 및 HPLC를 실시하여 5개의 화합물(화합물 1~5)을 분리하였다.
분리된 물질들의 구조는 NMR spectra의 결과를 문헌과 비교하여 동정하였으며, 화합물 1~5 의 구조는 각각 2α,3α,24-trihydroxy-12-ursene-23-al-28-oic acid (1),11) corosolic acid (2),12) 2α,3α,24-trihydroxyurs12,20(30)-dien-28-oic acid (3),13) 2α,3α,24-trihydroxyolean12-en-28-oic acid (4),14) 2α,3α,24-trihydroxyurs-12-en-28- oic acid (pygenic acid B) (5)14)로 확인되었으며(Fig. 1), 이 들 트리테르펜계 화합물 중 화합물 1, 3, 4는 저자들이 아는 한 개다래나무 열매로부터 처음으로 분리된 것으로 생각된다.
화합물 1-3과 5는 ursane 골격을 가지고 있으며, 화합물 4는 oleanane 골격에 속한다. 이들 화합물들이 유사한 구조를 가지고 있기 때문에 저자들은 활성물질인 화합물 3의 구조-활성 상관관계를 검토하였으며, 그 결과 20(30)-dien 부분구조가 NO생성 억제효과 발현에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 추정되었다. 이상의 결과로부터 2,3,24-trihydroxyurs-12,20(30)-dien-28-oic acid (3)은 우수한 항염증 효과를 나타낼 것으로 추정되며, 앞으로 보다 구체적인 항염증 효과와 작용기전에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.
즉, RAW264.7과 BV2 세포에 화합물 3을 20~80 µM의 농도로 처리한 후, 3시간 동안 CO2 incubator 에서 배양하고 LPS (1 µg/mL)를 24시간 동안 처리하였을 때, 화합물 3은 두 가지 세포주 모두에서 농도 의존적으로 NO생성을 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 3).
이들 중 화합물 1, 3, 4는 저자들이 아는 한 개다래나무 열매로부터는 처음으로 분리된 것으로 생각된다. 화합물 3은 LPS로 자극한 RAW264.7 대식세포와 BV2 미세아교세포 두 가지 세포주 모두에서 농도 의존적으로 NO생성을 억제하는 것으로 나타났으며, 20(30)-dien 부분구조가 NO생성 억제효과 발현에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 추정되었다.

후속연구

이들 화합물들이 유사한 구조를 가지고 있기 때문에 저자들은 활성물질인 화합물 3의 구조-활성 상관관계를 검토하였으며, 그 결과 20(30)-dien 부분구조가 NO생성 억제효과 발현에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 추정되었다. 이상의 결과로부터 2,3,24-trihydroxyurs-12,20(30)-dien-28-oic acid (3)은 우수한 항염증 효과를 나타낼 것으로 추정되며, 앞으로 보다 구체적인 항염증 효과와 작용기전에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	개다래나무는 어떠한 특성이 있는가?	) Planch.]는 다래나무과(Actinidiaceae)에 속하는 낙엽덩굴로서 꽃이 필 무렵에 잎의 일부 또는 전체가 흰색으로 변하는 특성이 있다.1) 이 식물의 열매는 종종 개다래나무 진딧물(Asphidylia matatabi)이 산란한 알이 부화하여 자람에 따라 불규칙한 벌레주머니 모양을 보인다.
	L-arginine으로부터 생성되는 일산화질소는 인체내에서 어떠한 영향을 미치는가?	L-arginine으로부터 생성되는 일산화질소(nitric oxide; NO)는 다양한 생체 내 면역반응 등을 중개하는 물질로서, lipopolysaccharide(LPS) 등 유해인자들의 자극에 따라 inducible nitric oxide synthase(iNOS)에 의해 지속적으로 다량 생성되는 경우 염증반응을 유발하는 것으로 알려져 있다.9) 따라서, 대식세포에 있어서 LPS 등의 유해인자에 의하여 증가되는 NO의 생성을 감소시킬 수 있는 연구방법은 항염증 약물의 시험법의 하나로 인정되고 있다.
	목천료란 무엇인가?	개다래나무[Actinidia polygama (Sieb. et Zucc.) Planch.]는 다래나무과(Actinidiaceae)에 속하는 낙엽덩굴로서 꽃이 필 무렵에 잎의 일부 또는 전체가 흰색으로 변하는 특성이 있다.1) 이 식물의 열매는 종종 개다래나무 진딧물(Asphidylia matatabi)이 산란한 알이 부화하여 자람에 따라 불규칙한 벌레주머니 모양을 보인다.2) 이것을 목천료(木天蓼)라 부르며, 민간에서 류마티스 관절염과 통풍의 치료에 사용되고 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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