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문제 정의
- 따라서, 이들 미생물은 앞으로 특수한 환경에서의 산업적 이용에 적극활용 될 수 있을 것으로 판단된다. 따라서, 본 연구에서는 국내의 폐광산 및 제주 곶자왈 지역 산성토양환경으로부터 미생물을 발굴하고, 자생 미생물의 생리적, 분자계통학적 특징 분석에 필요한 기초 정보를 제공하고자 한다.
- 극한환경에서 배양되는 미생물의 경우, 그 산업적 응용성에 있어 국외적으로 미생물 배양 및 특징분석에 많은 관심을 두고 있다. 본 연구에서는 국내에서는 보고 되지 않은 미생물들을 포함하여, 최종적으로 19종의 내산성미생물들을 폐광산 및 곶자왈 인근 토양시료로부터 분리 하여 이들의 특성을 분석하였다. 본 연구를 통해서, 자생 내산성미생물의 다양성, 생리적 결과와 이들 미생물의 분리 기술들은 자생미생물의 자원화에 기초적인 정보를 제공할 수 있을 것으로 판단된다.
제안 방법
- 10-1으로 희석한 R2A 액체배지를 이용하여, 폐광산과 제주도 대섭이굴에서부터 채취한 토양시료를 연속희석법(serial dilution)을 이용하여 희석하였으며, 10-3~10-5 희석액을 100 µl씩 고형배지에 도말한 후 30°C 배양기에서 1주일간 배양하였다.
- 10-1으로 희석한 R2A 액체배지를 이용하여, 폐광산과 제주도 대섭이굴에서부터 채취한 토양시료를 연속희석법(serial dilution)을 이용하여 희석하였으며, 10-3~10-5 희석액을 100 µl씩 고형배지에 도말한 후 30°C 배양기에서 1주일간 배양하였다. 1주일 배양 후, 배양한 단일 군집들 중 육안으로 비교하였을 때 형태, 색상 그리고 크기 등의 형태학적 특징을 비교하여 선별하고, 동일한배지와 조건에서 획선평판법(streaking)을 사용하여 순수분리를 시도하였다. 순수분리를 통해 획득한 미생물들은 아래에 기술한 분자생물학적 방법과 계통 분류학적 분석을 실시하고, 생리학적 실험을 통하여 분리한 미생물의 동정을 실시하였다.
- PCR 수행방법으로, 95°C에서 7분 동안 변성(denaturation) 과정을 거친 후 95°C에서 30초, 55°C에서 30초, 72°C에서 90초를 1회로 하여, 총 35회 반복 수행을 한 후 마지막으로 72°C에서 7분간 최종 신장(extension) 과정을 수행하였다.
- R2A와 TSA배지의 조성은 다음과 같다. R2A는 D.W. 1 L 당 yeast extract 0.5 g, proteose peptone 0.5 g,casamino acid 0.5 g, dextrose 0.5 g, soluble starch 0.5 g,sodium pyruvate 0.3 g, dipotassium phosphate 0.3 g 그리고 magnesium sulfate 0.05 g을 각각 넣어 제작하였고, TSA 배지는 증류수 1 L당 tryptone 15 g, soytone 5 g 그리고 sodium chloride 5 g을 각각 넣어 제작하였다. pH는 6 N HCl을 사용하여 4.
- 5% (w/v) agarose gel 전기영동법을 이용하여 크기를 확인하였다. 그 이후에 증폭된 유전자는 PCR purification kit (Cosmo Genetech)를 이용하여 정제하였으며, 정제된 산물은 Macrogen에서 염기서열 분석을 진행하였다. 분석 결과로 얻은 염기서열 정보는 SeqMan software (DNAStar)를 이용하여 편집하였고, 편집된 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)와 Ez-biocloud (http://www.
- 5 간격)으로 진행하였다. 기질 사용 특성 실험은 GEN III MicroPlate (Biolog)를 이용하여 진행하였다.
- 순수분리를 통해 획득한 미생물들은 아래에 기술한 분자생물학적 방법과 계통 분류학적 분석을 실시하고, 생리학적 실험을 통하여 분리한 미생물의 동정을 실시하였다. 배양된 미생물 세포모양은 광학현미경(CX23, Olympus)과 투과전자현미경(Technai G2 Sprite twin)을 이용하여 결정하였다.
- 생장온도 실험은 TSA 혹은 R2A 고형배지를 이용하여 4, 10, 15, 20, 25, 30, 37, 40, 45, 50 그리고 60°C에서 진행하였고, 생장 pH 실험은 TSB 혹은 R2A 액체배지를 Homo-PIPES, MES와 bis-tris propane 버퍼를 이용하여(Koh et al., 2015b), pH 3.0~10.0 (pH 0.5 간격)으로 진행하였다.
- 순수 분리된 미생물의 분자계통학적 분석을 위하여 genomic DNA extraction kit (GeneAll)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였으며, 16S rRNA 유전자를 증폭하기 위하여 세균 16S rRNA 유전자 primer 세트인 forward primer 27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)와 reverse primer 1492R (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′) (Weisburg et al., 1991)를 사용하였다.
- 1): Gammaproteobacteria강에 속하는 6종, Actinobacteria강에 속하는 5종, Betaproteobacteria 강에 속하는 4종, Alphaproteobacteria 강에 속하는 2종, Bacilli 강에 속하는 2종이며, 이들의 다양한 생리 및 대사적 특징들은 Supplementary data Table S1에 표시하였다. 순수분리가 확인된 미생물의 생리학적 실험은 일반적으로 TSA 혹은 R2A 배지에서 이루어졌으며, Gram stain kit (BD)를 사용하여 그람염색을 실시 한 후 광학현미경(CX23, Olympus)을 통하여 염색결과를 관찰하였다. 생장온도 실험은 TSA 혹은 R2A 고형배지를 이용하여 4, 10, 15, 20, 25, 30, 37, 40, 45, 50 그리고 60°C에서 진행하였고, 생장 pH 실험은 TSB 혹은 R2A 액체배지를 Homo-PIPES, MES와 bis-tris propane 버퍼를 이용하여(Koh et al.
- 1주일 배양 후, 배양한 단일 군집들 중 육안으로 비교하였을 때 형태, 색상 그리고 크기 등의 형태학적 특징을 비교하여 선별하고, 동일한배지와 조건에서 획선평판법(streaking)을 사용하여 순수분리를 시도하였다. 순수분리를 통해 획득한 미생물들은 아래에 기술한 분자생물학적 방법과 계통 분류학적 분석을 실시하고, 생리학적 실험을 통하여 분리한 미생물의 동정을 실시하였다. 배양된 미생물 세포모양은 광학현미경(CX23, Olympus)과 투과전자현미경(Technai G2 Sprite twin)을 이용하여 결정하였다.
- 이를 위하여, Dr. Max Master Mix (2×, MGMed) 10 µl 와 3차 증류수 7 µl, forward primer (10 pmol)와 reverse primer (10 pmol)를 각각 1 µl씩 넣고, genomic DNA를 1 µl 넣어, 총 20 µl의 PCR 반응액을 만들었다.
- 제작된 배지는 고압증기멸균기를 이용하여 1.5기압, 121°C에서 20분간 멸균하였다.
- PCR 수행방법으로, 95°C에서 7분 동안 변성(denaturation) 과정을 거친 후 95°C에서 30초, 55°C에서 30초, 72°C에서 90초를 1회로 하여, 총 35회 반복 수행을 한 후 마지막으로 72°C에서 7분간 최종 신장(extension) 과정을 수행하였다. 증폭된 유전자는 1.5% (w/v) agarose gel 전기영동법을 이용하여 크기를 확인하였다. 그 이후에 증폭된 유전자는 PCR purification kit (Cosmo Genetech)를 이용하여 정제하였으며, 정제된 산물은 Macrogen에서 염기서열 분석을 진행하였다.
대상 데이터
- 달성군의 폐광산과 제주도 대섭이굴에서부터 채취한 토양시료들로부터 미생물을 배양하기 위해서 10-1으로 희석한 Reasoner’s2A agar (R2A, Difco) 배지와 Tryptic Soy Agar (TSA, Difco) 배지를 이용하였다.
- 본 실험을 위하여 폐광산 및 제주 곶자왈 지역의 토양을 채취하였다. 시료는 대구광역시 달성군 가창면 상원리(35°46'52.
- 시료는 대구광역시 달성군 가창면 상원리(35°46'52.5"N,128°40'18.6"E)에 있는 폐광산과 제주특별자치도 제주시 조천읍 선흘리(33°30'24.8"N, 126°43'43.9"E)에 있는 대섭이 굴에서 채취하였으며, 표층과 심층의 토양을 멸균된 50 ml 유리 시험관에 채취하였다.
데이터처리
- 그 이후에 증폭된 유전자는 PCR purification kit (Cosmo Genetech)를 이용하여 정제하였으며, 정제된 산물은 Macrogen에서 염기서열 분석을 진행하였다. 분석 결과로 얻은 염기서열 정보는 SeqMan software (DNAStar)를 이용하여 편집하였고, 편집된 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)와 Ez-biocloud (http://www.ezbiocloud.net/eztaxon) (Kim etal., 2012)를 사용하여 연관성이 높은 유전자 서열을 획득, 비교 및 분석을 진행하였다. 그 이후에 BioEdit program (Hall,1999)을 사용하여 염기서열들을 정렬하고, 계통수는 MEGA6program (Tamura et al.
이론/모형
- 순수 분리된 미생물의 16S rRNA 유전자의 상동성은 Ez-BioCloud를 통해 계산하였다. G+C content 분석은 열변성(thermal denaturation temperature) 방법을 이용하였다 (Gonzalez and Saiz-Jimenez, 2002). 본 연구를 통해 순수 분리한 미생물의 16S rRNA 유전자 염기서열은 NCBI GenBank에등록하고 균주를 국립생물자원관에 기탁하였다.
- , 2012)를 사용하여 연관성이 높은 유전자 서열을 획득, 비교 및 분석을 진행하였다. 그 이후에 BioEdit program (Hall,1999)을 사용하여 염기서열들을 정렬하고, 계통수는 MEGA6program (Tamura et al., 2013)에서 제공하는 neighbor-joining(Saitou and Nei, 1987), maximum-likelihood (Felsenstein,1981), 그리고 maximum-parsimony (Fitch, 1971) 방법들을 이용하여 그렸다. 순수 분리된 미생물의 16S rRNA 유전자의 상동성은 Ez-BioCloud를 통해 계산하였다.
- , 2013)에서 제공하는 neighbor-joining(Saitou and Nei, 1987), maximum-likelihood (Felsenstein,1981), 그리고 maximum-parsimony (Fitch, 1971) 방법들을 이용하여 그렸다. 순수 분리된 미생물의 16S rRNA 유전자의 상동성은 Ez-BioCloud를 통해 계산하였다. G+C content 분석은 열변성(thermal denaturation temperature) 방법을 이용하였다 (Gonzalez and Saiz-Jimenez, 2002).
성능/효과
- 이에 따라, 발굴된 미생물들은 산성환경에 내성을 지닌 내산성미생물(acid-tolerant bacteria)로 판단하였다. 내산성미생물의 배양은, 본 연구에서 사용된 배양조성이 호산성미생물이 성장할 수 없는 비적절한 조건으로 판단된다. 따라서, 호산성미생물의 분리를 위하여, 초기배양에 있어 pH 2 부근 혹은 그 이하의 배양배지 조성이 필요하며, 추후 연구에서는 낮은 pH 배양조건이 보다 많은 수의 호산성미생물 발굴에 유용할 것이다.
- 발굴된 미생물들의 16S rRNA 유전자 서열 분석 결과, 기존에 국외에서 배양되어 보고된 미생물들과 평균 99.6%의 유전자 상동성이 관찰되었다. 계통학적 분석을 통한 각각의 미생물의 유연관계는 Supplementary data Fig.
- 본 연구를 통하여, 제주특별자치도 제주시와 대구광역시 달성군에서 채취한 토양시료로부터 약 50개의 형태학적으로 구별된 미생물 단일 군집을 획득 할 수 있었으며, 계통학적 분석을 통하여 중복되는 종을 최대한 제외하여 총 19종의 서로 다른 미생물들을 분리하였다(Table 1 and Fig. 1): Gammaproteobacteria강에 속하는 6종, Actinobacteria강에 속하는 5종, Betaproteobacteria 강에 속하는 4종, Alphaproteobacteria 강에 속하는 2종, Bacilli 강에 속하는 2종이며, 이들의 다양한 생리 및 대사적 특징들은 Supplementary data Table S1에 표시하였다. 순수분리가 확인된 미생물의 생리학적 실험은 일반적으로 TSA 혹은 R2A 배지에서 이루어졌으며, Gram stain kit (BD)를 사용하여 그람염색을 실시 한 후 광학현미경(CX23, Olympus)을 통하여 염색결과를 관찰하였다.
- 호산성미생물은 pH가 낮은 환경에서 살아가는 미생물로서 산화, 환원 반응을 통하여, 금속을 포함한 물질들의 순환에 영향을 미친다. 본 연구에서는, 국내의 폐광산 및 제주 곶자왈 지역의 산성토양으로부터 배양을 통해 50여 종 이상의 미생물을 분리하였으며, 분자계통학적 분석을 통하여 최종, Gammaproteobacteria 강에 속하는 미생물 6종, Actinobacteria 강에 속하는 미생물 5종,Betaproteobacteria 강에 속하는 미생물 4종, Alphaproteobacteria 강에 속하는 미생물 2종, Bacilli 강에 속하는 미생물 2종을 얻을 수 있었다. 이들은 공통적으로 낮은 pH의 조건에서 살아가는 미생물임을 확인 할 수 있었다.
- 채취한 시료는 약산성(pH 4.0~6.0정도)으로 확인되었으며, 실험 전까지 4°C에서 냉장 보관하였다.
후속연구
- , 2015). 따라서, 이들 미생물은 앞으로 특수한 환경에서의 산업적 이용에 적극활용 될 수 있을 것으로 판단된다. 따라서, 본 연구에서는 국내의 폐광산 및 제주 곶자왈 지역 산성토양환경으로부터 미생물을 발굴하고, 자생 미생물의 생리적, 분자계통학적 특징 분석에 필요한 기초 정보를 제공하고자 한다.
- 내산성미생물의 배양은, 본 연구에서 사용된 배양조성이 호산성미생물이 성장할 수 없는 비적절한 조건으로 판단된다. 따라서, 호산성미생물의 분리를 위하여, 초기배양에 있어 pH 2 부근 혹은 그 이하의 배양배지 조성이 필요하며, 추후 연구에서는 낮은 pH 배양조건이 보다 많은 수의 호산성미생물 발굴에 유용할 것이다.
- 이들은 공통적으로 낮은 pH의 조건에서 살아가는 미생물임을 확인 할 수 있었다. 본 연구를 통하여 확보한 산성토양내의 미생물들의 생리적 특징은 앞으로의 다양한 국내 미생물 자원의 활용에 기초적인 지식을 제공할 것으로 기대된다.
- 본 연구에서는 국내에서는 보고 되지 않은 미생물들을 포함하여, 최종적으로 19종의 내산성미생물들을 폐광산 및 곶자왈 인근 토양시료로부터 분리 하여 이들의 특성을 분석하였다. 본 연구를 통해서, 자생 내산성미생물의 다양성, 생리적 결과와 이들 미생물의 분리 기술들은 자생미생물의 자원화에 기초적인 정보를 제공할 수 있을 것으로 판단된다.
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