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문제 정의
- 본 연구는 Zeng과 Ruckenstein[12]이 제안한 제막법 을 사용하여 본 연구진이 1단계 논문[13]을 통해 최적의 제막조건에서 제조된 다공성 키토산 및 키틴 막을 사용하여 반응성 염료인 Cibacron Blue 3GA를 결합시킨 키토산 친화 막과 키틴 친화 막을 대상으로 단백질 (BSA)과 효소(lysozyme)의 친화 막 여과 크로마토그래 피 기법에 의한 분리 특성을 평가하였다.
- 친화 막 여과 크로마토그래피에 의한 BSA 단백질과 lysozyme 효소의 분리 실험은 다음의 절차로 수행하였다. 먼저 Fig.
제안 방법
- , 일본)를 사용하여 250)im의 일정한 두께로 캐스팅하여 후드 내에서 하루 동안 자연건조 시킨다. 건조된 필름을 유리판에서 떼어낸 후 80℃ 온도의 5 wt% NaOH 용액에 2시간 동안 침지시켜 실리카 입자를 녹 여낸 다음 다량의 물로 수차례 세척하여 잔존하는 NaOH를 제거하여 다공성 키토산 막을 제조하였다. 이 단계에서 얻어진 다공성 키토산 막의 물리적 강도를 향상시 키기 위해 0.
- 다공성 키토산 막의 제조절차는 본 연구진의 1단계 논문[13]에 제시된 방법에 따라 수행되었으며, 그 제조 절차를 Fig. 1에 나타내었다; 먼저 1 vol% acetic acid 용액 50 mL에 키토산 0.5 g을 용해시킨 용액에 키토 산에 대한 실리카 입자의 함유량 질량비(ratio of silica to chitosan; S/C)가 1.5가 되도록 평균 입자경 5 |xm인 실리카 입자를 첨가하여 격렬히 교반하면서 현탁시켰 다. 이 실리카 입자 함유 키토산 용액을 깨끗한 유리판 위에 붓고 Film Applicator (YBA-3 type, Yoshimitsu Co.
- 02 M epichlorohydrin 용액에 침지시켜 2시간 동안 가교시킨 다음 과량의 순수로 세척하여 최종의 가교 결합된 다공성 키토산 막 을 제조하였다. 다공성 키틴막은 가교시키기 전 단계 에서 얻어진 다공성 키토산 막을 acetic anhydride가 5 vol% 농도로 용해되어 있는 메탄올 용액 중에 침지시 켜 50℃ 온도에서 1시간 동안 아세틸화시킨 후 메탄올, 순수, 5 wt% NaOH 용액으로 순차적으로 세척시켜 제조하였다.
- 1 M phosphate buffer + 1 M NaCl, pH 8)을 일정한 유량으로 연속적으로 보내주어 막 module을 안정화시킨다. 다음으로 BSA 또는 lysozyme 용액을 주입시켜 파과 곡선(breakthrough curve)이 얻어질 때까지 친화 막에 BSA 또는 lysozyme을 loading시킨 후 완충용액으로 친화 막과 약하게 결합된 단백질을 washing시키고, eluent 용액(BSA 분리 실험의 경우 0.05 M Tris-HCl buffer + 0.5 N NaSCN, lysozyme 분리 실험의 경우 0.1 M acetic acid)을 주입시켜 친화 막에 결합된 BSA 또는 lysozyme을 용출시키는 과정을 통해 배출 흐름의 흡광도를 US/Vis 분광광도계로 280 nm에서 연속적으로 측정하여 loading/washing/elution으로 구성된 일련의 크로마토그램을 얻고, 이로부터 친화 막의 BSA 및 lysozyme 결합량을 계산하였다. 여과 크로마토그래피 실험의 조작조건으로는 BSA 및 lysozyme loading 용액의 유량을 1~10 mL/min, loading 용액의 주입량을 2~16 mL, loading 용액의 BSA 및 lysozyme 농도를 0.
- 이들은 알칼리에 실리카 입자는 용해되나 키토산은 용해되지 않는 특성을 이용해 먼저 키토산 용액에 실리카 입자를 첨가시켜 필름을 형성시킨 후 이를 NaOH 용액에 침지시켜 실리카 입자를 제거함으로써 다공성의 키토산 막을 제조 하였으며, 이때 실리카 입자의 크기 및 함유량을 달리 함으로써 키토산 막의 세공특성 조절이 가능하다. 또한 이들은 제조된 키토산 막을 아세틸화시킴으로써 적절한 가용성 용매가 없어 필름형성이 불가능한 것으로 알려진 키틴의 다공 막 제조법도 제시하였다.
- 1 M acetic acid)을 주입시켜 친화 막에 결합된 BSA 또는 lysozyme을 용출시키는 과정을 통해 배출 흐름의 흡광도를 US/Vis 분광광도계로 280 nm에서 연속적으로 측정하여 loading/washing/elution으로 구성된 일련의 크로마토그램을 얻고, 이로부터 친화 막의 BSA 및 lysozyme 결합량을 계산하였다. 여과 크로마토그래피 실험의 조작조건으로는 BSA 및 lysozyme loading 용액의 유량을 1~10 mL/min, loading 용액의 주입량을 2~16 mL, loading 용액의 BSA 및 lysozyme 농도를 0.1 ~ 1.5 mg/mL로 변화시켜 실험하였다. Washing 및 elution 단계에서의 유량은 5 mL/min로 일정하게 유지 시켰다.
- 건조된 필름을 유리판에서 떼어낸 후 80℃ 온도의 5 wt% NaOH 용액에 2시간 동안 침지시켜 실리카 입자를 녹 여낸 다음 다량의 물로 수차례 세척하여 잔존하는 NaOH를 제거하여 다공성 키토산 막을 제조하였다. 이 단계에서 얻어진 다공성 키토산 막의 물리적 강도를 향상시 키기 위해 0.067 M NaOH 용액을 사용하여 pH가 10으로 조절된 50℃ 온도의 0.02 M epichlorohydrin 용액에 침지시켜 2시간 동안 가교시킨 다음 과량의 순수로 세척하여 최종의 가교 결합된 다공성 키토산 막 을 제조하였다. 다공성 키틴막은 가교시키기 전 단계 에서 얻어진 다공성 키토산 막을 acetic anhydride가 5 vol% 농도로 용해되어 있는 메탄올 용액 중에 침지시 켜 50℃ 온도에서 1시간 동안 아세틸화시킨 후 메탄올, 순수, 5 wt% NaOH 용액으로 순차적으로 세척시켜 제조하였다.
- 키토산을 기초로 하여 실리카 입자를 기공형성제로 사용하여 다공성 키토산 및 키틴 친화 막을 제조하였으며, 이들 친화 막을 사용하여 BSA 및 lysozyme 단백질의 여과 크로마토그래피 분리 실험을 수행한 결과 다음의 결론을 얻었다.
대상 데이터
- 다공 막의 소재로는 평균 분자량이 750, 000인 키토 산(Fluka Chemi AG, 스위스)을 사용하였다. 기공형성 제로는 평균 입자경 5 um1인 (주)보광화학(한국)의 실리카입자를 사용하였다. 키토산 막의 가교제로는 epi- chlorohydrine (Aldrich Co.
- 다공 막의 소재로는 평균 분자량이 750, 000인 키토 산(Fluka Chemi AG, 스위스)을 사용하였다. 기공형성 제로는 평균 입자경 5 um1인 (주)보광화학(한국)의 실리카입자를 사용하였다.
- 다공성 키토산 및 키틴 친화 막에 의한 BSA 단백질과 lysozyme 효소의 여과 크로마토그래피 분리실험에 사용된 장치의 구성은 Fig. 2에 나타낸 바와 같이 저장 조, 친화 막 module, 정량 펌프(Peristaltic pump, Fluid Metering Co., Model QSY, 미국), 석영재질의 flow cell이 장착된 UV/Vis 분광광도계로 구성되어 있으며, 장치의 배관재로는 Teflon 튜브를 사용하였다. 친화 막 modulee 정사면체 형태로서 perspex 판(재질 PMMA) 으로 자체 제작하였다.
- 친화 막 modulee 정사면체 형태로서 perspex 판(재질 PMMA) 으로 자체 제작하였다. 막의 지지체로는 폴리프로필렌 다공판을 사용하였다. 친화 막 module에서 실제로 여과가 행해지는 부분의 유효 막면적은 10 cn?이다.
- , Model QSY, 미국), 석영재질의 flow cell이 장착된 UV/Vis 분광광도계로 구성되어 있으며, 장치의 배관재로는 Teflon 튜브를 사용하였다. 친화 막 modulee 정사면체 형태로서 perspex 판(재질 PMMA) 으로 자체 제작하였다. 막의 지지체로는 폴리프로필렌 다공판을 사용하였다.
- , 미국) 효소를 사용하였다. 친화성 막 여과 크로마토그래피에 의한 단백질 분리 실험 시, BSA의 경우에는 이동상으로서 0.05 M Tris-HCV 0.05 M NaCl (pH 8) buffer와 eluent로서 0.05 M Tris-HCV0.5 N NaSCN 용액을 사용하였고, lysozyme의 경우에는 이동 상으로서 0.1 M phosphate/1 M NaCl (pH 8) buf如와 eluent로서 0.1 M acetic acid 용액을 사용하였다.
- 키토산 막에 결합시킬 친화성 리간드로는 Cibacron Blue 3GA (CB3GA, 염료 함량 55%, Sigma Co., 미국) 를 사용하였다. CB3GA는 직물 염색에 사용되는 triazine 염료의한 부류인 Procion H 계열의 반응성 염료로서 그 구조가 NAD (nicotinamide adenine dinu- cleotide)와 흡사하여, 'dinucleotide fbld'를 갖고 있는 단백질(serum albumin, dehydrogenase류, kinase류, nucleotide-binding 효소류 등)과의 친화력이 우수한 물질 이다 [14].
- 기공형성 제로는 평균 입자경 5 um1인 (주)보광화학(한국)의 실리카입자를 사용하였다. 키토산 막의 가교제로는 epi- chlorohydrine (Aldrich Co., 미국)을 사용하였으며, 키토산 막을 아세틸화시켜 키틴 막으로 전환하기 위해 acetic anhydride (Mallinckrodt Baker Co., 네덜란드)를 사용하였다.
- 키토산 친화 막 크로마토그래피의 분리대상 물질로는 BSA (Fraction V5 96~99% albumin, Mw 느 69, 000, Sigma Co., 미국) 단백질을, 키틴 친화 막 크로마토그 래피의 분리대상 물질로는 lysozyme (EC 3.2.1.17, 3 times crystallized, dialyzed and lyophilized from hen egg white, Sigma Co., 미국) 효소를 사용하였다. 친화성 막 여과 크로마토그래피에 의한 단백질 분리 실험 시, BSA의 경우에는 이동상으로서 0.
- 키토산 친화 막의 제조는 epichlorohydrin으로 가교 시켜 얻어진 다공성 키토산 막에 반응성 염료인 CB3GA를 고정화시켜 제조하였다. 제조절차는 다음과 같다[1 이; 먼저 가교 결합시킨 다공성 키토산 막을 60℃ 온도의 40 mL 염료용액(10 mg dye/mL)에 30분 동안 침지시킨다.
성능/효과
- 1) 다공성 키토산 친화 막의 BSA 단백질 결합용량 은 최대 21.8 mg/mL이었으며, 키틴 친화 막의 lysozyme 효소 결합용량은 최대 26.1 mg/mL이었다.
- 2) 키토산 및 키틴 친화 막을 사용하여 BSA와 lysozyme 용액의 loading 유량, loading 양 및 농도 변화에 따른 BSA와 lysozyme의 친화 막 여과 크로마토그래 피 분리 실험을 수행한 결과 BSA와 lysozyme 단백질의 결합량과 결합수율은 loading 용액의 유량이 작을수록, 주입량 및 농도가 클수록 증가하였다.
- 3) 실리카 입자를 기공 형성제로 사용하여 제조된다공성 키토산 및 키틴막은 단백질의 대규모 여과 크 로마토그래피 분리를 위한 친화 막으로서 효과적인 활용이 가능함을 확인하였다.
- 3에 나타내었으며, 키토산 및 키틴 친화 막의 특성 값 들을 Table 1에 나타내었다. Fig. 3과 Table 1에 나타낸 것과 같이 기공 형성제인 실리카 입자를 사용함으 로써 다공도가 잘 조절된 막의 제조가 가능하였으며, 키토산 막과 키틴 막 모두 5 vol% 아세트산 용액(pH 2.5)에 불용으로서 충분한 정도의 산안정성을 나타내었다. 또한 단백질 용액의 흡착 실험을 통해 얻어진 키토산 친화 막의 BSA 단백질에 대한 평형 결합용량 은 최대 21.
- 5)에 불용으로서 충분한 정도의 산안정성을 나타내었다. 또한 단백질 용액의 흡착 실험을 통해 얻어진 키토산 친화 막의 BSA 단백질에 대한 평형 결합용량 은 최대 21.8 mg/mL membrane이었으며, 키틴 친화 막 의 lysozyme 효소에 대한 평형 결합용량은 최대 26.1 mg/mL membrane이었다.
- 0272 cm x 유효 막면적 10 cn?)으 로 나눈 값이다. 이 결과 BSA loading 용액의 유량이 1.5 mL/min에서 10 mL/min로 증가함에 따라 크로마 토그램 에서 용출피 크가 감소하였고, 결합수율은 80% 에서 20%로 급격히 감소하였다. 이는 loading 용액의 유량이 증가함에 따라 BSA가 리간드인 CB3GA와 결합할 수 있는 접촉시간이 감소하기 때문으로 사료된다.
- 0133 cm x 유효 막면적 10 cn?)으 로 나눈 값이다. 이 결과 키틴 친화 막에의 lysozyme 효소의 결합량과 결합수율은 loading 용액의 유량이감소할수록, 주입량 및 농도가 클수록 증가하였다.
후속연구
- 이상의 결과를 종합하면 실리카 입자를 기공 형성제 로 사용하여 제조된 다공성 키토산 및 키틴막은 산에 안정한 물리·화학적 특성을 갖추었으며, 향후 단백질의 여과 크로마토그래피 분리를 위한 친화 막으로서의 효과적인 활용이 기대된다.
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