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제안 방법
- 다공성 키토산 막의 용매 안정성과 물리적 강도를 높이기 위해 epichlorohydrin으로 키토산 막을 가교시켰다. 가교시켜 얻어진 키토산 막 및 키틴 막의 산 안정성은 막을 2 cm X 2 cm의 크기로 절단하여 5 vol% acetic acid 용액(pH 2.5) 내에 24시간 동안 침지시킨 후, 산에 의한 막의 손상 여부로서 판단하였다.
- 물에 대한 팽윤도를 측정하여 평가하였다. 가로 2 cm X 세로 2 cm 크기의 완전히 건조시킨 다공성 키토산 및 키틴 막 시료의 무게(W1)를 측정한 후, 이를 20℃의 수중에서 충분히 팽윤시킨 상태에서의 무게 (W2)를 측정하여 아래의 식으로 다공도(porosity)를 계산하였다.
- , 일본)를 사용하여 360 um의 일정한 두께로 캐스팅하여 후드 내에서 하루 동안 자연건조 시킨다. 건조된 필름을 유리판에서 떼어낸 후 80℃ 온도의 5 wt% NaOH 용액에 2시간 동안침지시켜 실리카 입자를 녹여낸 다음 다량의 물로 수차례 세척하여 잔존하는 NaOH를 제거하여 다공성 키토산 막을 제조하였다. 이 단계에서 얻어진 다공성 키토산 막은 예비실험 결과 dead-end 막모듈에 설치 시 O-ring과의 접촉부위가 파손되는 문제가 발생하였으며, 또한 키토산은 알카리에는 강하나 산에는 용해되는 특성이 있어 친화 막으로의 사용에 문제가 있다.
- 특성이 있다. 다공성 키토산 막의 용매 안정성과 물리적 강도를 높이기 위해 epichlorohydrin으로 키토산 막을 가교시켰다. 가교시켜 얻어진 키토산 막 및 키틴 막의 산 안정성은 막을 2 cm X 2 cm의 크기로 절단하여 5 vol% acetic acid 용액(pH 2.
- 다공성 키토산 막의 제조절차는 다음과 같다; 먼저 1 vol % acetic acid 용액 50 mL에 키토산 0.5 g을 용해시킨 용액에 키토산에 대한 실리카 입자의 함유량 질량비(ratio of silica to chitosan; S/C)가 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2가 되도록 입자 크기가 다른 3종류 실리카 입자 (평균 직경 3 um, 5 um 및 10 um)를 첨가하여 격렬히 교반 하면서 현탁시켰다. 이 실리카 입자 함유 키토산 용액을 깨끗한 유리판 위에 붓고 Film Applicator (YBA-3 type, Yoshimitsu Co.
- 다공성 키토산 및 키틴 막의 다공도(porosity)는 막의 물에 대한 팽윤도를 측정하여 평가하였다. 가로 2 cm X 세로 2 cm 크기의 완전히 건조시킨 다공성 키토산 및 키틴 막 시료의 무게(W1)를 측정한 후, 이를 20℃의 수중에서 충분히 팽윤시킨 상태에서의 무게 (W2)를 측정하여 아래의 식으로 다공도(porosity)를 계산하였다.
- 다공성 키토산 및 키틴 막의 몰 폴로 지(세공크기와분포)는 주사전자현미경(SEM, S-2500C, Hitachi Co., 일본)을 사용하여 관찰하였다. 막 시료는 완전히 건조시킨 후 금을 진공 증착시켜 SEM 이미지를 관찰하였다.
- 다공성 키틴 막은 가교시키기 전 단계에서 얻어진 다공성 키토산 막을 acetic anhydride가 5 vol% 농도로 용해되어 있는 메탄올 용액 중에 침지시켜 50℃ 온도에서 1시간 동안 아세틸화시킨 후 메탄올, 순수, 5 wt% NaOH 용액으로 순차적으로 세척시켜 제조하였다. 키틴 막 제조의 아세틸화 반응을 Fig.
- 막 제조조건을 결정하였다. 다음으로 반응성 염료인 Cibacron Blue 3GA를 결합시킨 키토산 친화 막을 제조하여 BSA (bovine serum albumin) 단백질의 흡착실험을 통해 평형 흡착량을 측정하고, 또한 키틴 친화 막에의 lysozyme 효소의 평형 흡착량을 측정함으로서 향후 본 연구의 후속 과제인 단백질(BSA)과 효소 (lysozyme)의 친화 막 크로마토그래피 연구에 활용될 키토산과 키틴 다공 막의 친화 막으로서의 기본 특성을 평가하였다.
- 이 단계에서 얻어진 다공성 키토산 막은 예비실험 결과 dead-end 막모듈에 설치 시 O-ring과의 접촉부위가 파손되는 문제가 발생하였으며, 또한 키토산은 알카리에는 강하나 산에는 용해되는 특성이 있어 친화 막으로의 사용에 문제가 있다. 따라서 이러한 문제점을 개선하기 위해 다공성 키토산 막을 0.067 M NaOH 용액을 사용하여 pH가 10으로 조절된 50℃ 온도의 0.02 M epichlorohydrin 용액에 침지 시켜 2시간 동안 가교시킨 다음 과량의 순수로 세척하여 최종의 가교 결합된 다공성 키토산 막을 제조하였다. Epichlorohydrin에 의한 키토산의 가교화 반응을 Fig.
- 이들은 알칼리에 실리카 입자는 용해되나 키토산은 용해되지 않는 특성을 이용해 먼저 키토산 용액에 실리카 입자를 첨가시켜 필름을 형성시킨 후 이를 NaOH 용액에 침지 시켜 실리카 입자를 제거하여 다공성의 키토산 막을 제조하였으며, 이때 실리카 입자의 크기 및 함유량을 달리함으로서 키토산 막의 세공특성 조절이 가능하다. 또한 이들은 제조된 키토산 막을 아세틸화시킴으로서 적절한 가용성 용매가 없어 필름형성이 불가능한 것으로 알려진 키틴의 다공 막 제조법도 제시하였다.
- , 일본)을 사용하여 관찰하였다. 막 시료는 완전히 건조시킨 후 금을 진공 증착시켜 SEM 이미지를 관찰하였다.
- 막의 순수 투과량(PWF, pure water flux)은 dead-end 막모듈(내용적 0.25 L, 유효 막면적 14.5 cm?)을 사용하여 TMP (transmembrane pressure) 변화(0.2~2 atm)에 따라 측정하였다. 압축질소를 이용하여 25℃의 온도를 유지하고 있는 순수 저장조에 일정한 압력을 가하고, dead-end 막모듈에 설치된 다공성 키토산 및 키틴 막을 투과한 순수의 양을 전자저울로 30분 동안 측정하여 PWF를 계산하였다.
- 막의 인장강도(tensile strength)는 막을 길이 5 cm X 폭 2 cm의 크기로 절단하여 완전히 건조시킨 후, UTM (LR-30K, Lloyd Instrument Co., 미국)을 사용하여 cross-head speed 20 mm/min, gauge length 20 mm 의 조건에서 측정하였다.
- 본 연구에서는 키토산 및 키틴 친화 막을 제조하기 위해 먼저 Zeng과 Ruckenstein] 10]이 제시한 방법을 사용하여 세공특성이 다른 다공성의 키토산 및 키틴 막을 제조한 후 막의 물리적 특성을 평가하여 최적의다공 막 제조조건을 결정하였다. 다음으로 반응성 염료인 Cibacron Blue 3GA를 결합시킨 키토산 친화 막을 제조하여 BSA (bovine serum albumin) 단백질의 흡착실험을 통해 평형 흡착량을 측정하고, 또한 키틴 친화 막에의 lysozyme 효소의 평형 흡착량을 측정함으로서 향후 본 연구의 후속 과제인 단백질(BSA)과 효소 (lysozyme)의 친화 막 크로마토그래피 연구에 활용될 키토산과 키틴 다공 막의 친화 막으로서의 기본 특성을 평가하였다.
- 2~2 atm)에 따라 측정하였다. 압축질소를 이용하여 25℃의 온도를 유지하고 있는 순수 저장조에 일정한 압력을 가하고, dead-end 막모듈에 설치된 다공성 키토산 및 키틴 막을 투과한 순수의 양을 전자저울로 30분 동안 측정하여 PWF를 계산하였다.
- 먼저 제조된 키토산 친화 막을 가로 4 cm X 세로 4 cm 크기로 잘라 농염산(12 N) 용액 15 mL 내에 넣고 80℃에서 15분 동안 가열하여 키토산을 가수분해 시켜 염료를 탈착시키고, 25℃로 냉각한 후 5 mL5] 순수를 첨가한다. 염료가 탈착되어 있는 용액의 흡광도를 CB3GA의 최대 흡수파장인 515 nm에서 UV/Vis 분광광도계(UVIKON 860, 미국 Kontron Instruments Co.) 로 측정하고, 미리 작성된 검량선 으로부터 고 정화된 염료의 양(umol 염료/mL membrane)을 계산하였다.
- 제조하였다. 제조된 막의 물리적 특성을 검토하여 최적의 제막 조건을 결정하였으며, BSA와 lysozyme의 평형 결합용량을 측정하여 막여과 크로마토그래피용 친화 막으로서의 특성을 검토한 결과 다음의 결론을 얻었다.
- 1 M phosphate buffer/1 M NaCl (pH 8)]에 30분간 침적시킨 후, 여기에 농도를 알고 있는 BSA 및 lysozyme 용액 5 mL를 첨가하고, 25℃, 60 rpm에서 12시간 동안 진탕시켜 흡착평형에 도달하도록 한다. 친화 막에의 BSA 및 lysozyme 흡착량(mg/mL membrane)은 용액의 흡광도를 280 nm에서 UV/Vis 분광광도계로 측정하여 계산하였다.
- 키토산 용액에 함유시킨 실리카 입자의 크기 및 키토산에 대한 실리카 입자의 함유량 비율을 달리 하여 제조된 다공성 키토산 및 키틴 막의 물리적 특성치로는 순수 투과량, 인장강도, 산(acid) 안정성, 몰폴로지, 다공도와 BET 비표면적을 측정하였으며, 측정된 물리적 특성치를 비교 평가하여 다공성 키토산 및 키틴 막의 최적 제조조건을 결정하였다.
- 키토산 친화 막에 대해서는 BSA 단백질의 평형 홉착량을, 키틴 친화 막에 대해서는 lysozyme 효소의 평형 흡착량을 측정하여, 향후 본 논문의 후속 연구인 BSA와 lysozyme의 친화 막 크로마토그래피에 사용될 키토산 및 키틴 친화 막의 기본 특성(단백질과 효소 결합용량)을 평가하였다. 친화 막에의 BSA 및 lysozyme 평형 흡착량 측정은 아래의 절차로서 수행하였다.
- 키토산 친화 막의 제조는 Fig. 3의 반응을 통해 epichlorohydrin으로 가교시켜 얻어진 다공성 키토산 막에 반응성 염료인 CB3GA를 고정화시켜 제조하였다. Fig.
- , 미국)를 사용하여 질소의 흡착 . 탈착 실험을 수행하여 비표면적을 측정하였다.
대상 데이터
- 가로 2 cm X 세로 2 cm 크기의 다공성 키토산 및 키틴 막 시료를 대상으로 BET 장치(Autosorb・l, Quanta Chrome Co., 미국)를 사용하여 질소의 흡착 . 탈착 실험을 수행하여 비표면적을 측정하였다.
- 기공 형성제로 사용된 실리카 입자로는 (주)보광화학(한국)의 평균 입자경이 각각 3 印n, 5 um, 10 um인 3가지 종류를 사용하였다. 키토산 막의 가교제로는 epichlorohydrine (Aldrich Co.
- 기공 형성제로 실리카 입자를 사용하여 단백질 및 효소에 대한 친화력이 우수한 다공성 키토산 및 키틴 막을 제조하였다. 제조된 막의 물리적 특성을 검토하여 최적의 제막 조건을 결정하였으며, BSA와 lysozyme의 평형 결합용량을 측정하여 막여과 크로마토그래피용 친화 막으로서의 특성을 검토한 결과 다음의 결론을 얻었다.
- 다공 막의 소재로는 평균 분자량이 750, 000인 키토산(Fluka Chemi AG, 스위스)을 사용하였다. 기공 형성제로 사용된 실리카 입자로는 (주)보광화학(한국)의 평균 입자경이 각각 3 印n, 5 um, 10 um인 3가지 종류를 사용하였다.
- , 네덜란드)를 사용하였다. 키토산 막에 결합시킬 친화성 리간드로는 Cibacron Blue 3GA (CB3GA, 염료 함량 55%, Sigma Co., 미국)를사용하였다. CB3GA는 직물 염색에 사용되는 triazine 염료의 한 부류인 Procion H 계 열의 반응성 염료로서 그 구조가" NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) 와흡사하여, * dinucleotide fbld'를 갖고 있는 단백질 (serum albumin, dehydrogenase류, kinase류, nucleotide-binding 효소류 등)과의 친화력이 우수한 물질이다[11].
- 기공 형성제로 사용된 실리카 입자로는 (주)보광화학(한국)의 평균 입자경이 각각 3 印n, 5 um, 10 um인 3가지 종류를 사용하였다. 키토산 막의 가교제로는 epichlorohydrine (Aldrich Co., 미국)을 사용하였으며, 키토산 막을 아세틸화시켜 키틴 막으로 전환하기 위해 acetic anhydride (Mallinckrodt Baker Co., 네덜란드)를 사용하였다. 키토산 막에 결합시킬 친화성 리간드로는 Cibacron Blue 3GA (CB3GA, 염료 함량 55%, Sigma Co.
- 키토산 친화 막에의 흡착 용질로는 BSA (Fraction V, 96 — 99% albumin, Mw = 69, 000, Sigma Co., 미국) 단백질을, 키틴 친화 막에의 흡착 용질로는 lysozyme (EC 3.2.1.17, 3 times crystallized, dialyzed and lyophilized from hen egg white, Sigma Co., 미국) 효소를 사용하였다. 이외의 기타 시약들은 모두 특급 시약을 사용하였으며, 순수로는 Milli-RO+/Milli-Q+ Water Purification System (Millipore Co.
이론/모형
- 인자이다. 고정화된 염료의 양은 강산을 사용하여 염료를 키토산으로부터 탈착시키는 Chambers[16]법을 사용하여 측정하였다. 먼저 제조된 키토산 친화 막을 가로 4 cm X 세로 4 cm 크기로 잘라 농염산(12 N) 용액 15 mL 내에 넣고 80℃에서 15분 동안 가열하여 키토산을 가수분해 시켜 염료를 탈착시키고, 25℃로 냉각한 후 5 mL5] 순수를 첨가한다.
- 친화 키토산 막에 결합된 CB3GA 염료의 양(막 단위 부피당 결합량)을 Chambers법 [16]을 사용하여 측정한 결과 40.2 umol/mL이었다. 이 염료 결합량 값은 관 크로마토그래피의 고정상 입자로 널리 사용되고 있는 agarose hydrogel bead에 결합되는 반응성 염료의 양이 1~10 umol/mL인 것[1 기과 비교할 때, 수~수십 배 큰 값이다.
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