[논문]포공영 추출물의 항산화 효과 및 피부 각질세포 보호효과

김형우; 김병주; 임세현; 김현영; 이숙영; 조수인; 김영균

doi:10.6116/kjh.2009.24.3.103

포공영 추출물의 항산화 효과 및 피부 각질세포 보호효과
Anti-oxidative Effects of Taraxaci Herba and Protective Effects on Human HaCaT Keratinocyte 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.24 no.3, 2009년, pp.103 - 108

김형우 (부산대학교 한의학전문대학원) , 김병주 (부산대학교 한의학전문대학원) , 임세현 (고려대학교 간호대학) , 김현영 (동의대학교 한의과대학) , 이숙영 (조선대학교 치과대학) , 조수인 (부산대학교 한의학전문대학원) , 김영균 (동의대학교 한의과대학)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : This study was carried out to investigate anti-oxidative effects of Taraxaci Herba (TH) and protective effects on Human HaCaT keratinocyte. Methods : Anti-oxidative effects were measured by estimating the amount of total phenolics and flavonoids. In addition, DPPH free radical scavenging activities were estimated. Protective effects of TH on HaCaT keratinocytes against oxidative stress induced by hydrogen peroxide were also measured. Results : In our results, treatment with TH did not show cytotoxicity on HaCaT keratinocyte beneath the concentration of 200 $\mu$g/ml. 42.64$\pm$1.90 $\mu$g/ml of total phenolics and 28.09$\pm$1.84 $\mu$g/ml of flavonoids was detected from TH ethanol extract. In addition, DPPH free radical scavenging activities of TH were elevated in dose-dependent manner. In addition, The value of half maximal inhibitory concentration (IC$_{50}$) was 165.5 $\mu$g/ml. Finally, TH showed protective effect against cell death of HaCaT cell induced by hydrogen peroxide significantly. Conclusions : In conclusion, these results suggest that TH may have anti-oxidantic action in human skin and also suggest the possibility as cosmetic material.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 항산화, 항암 등의 다양한 생리 활성 작용을 가진 페놀 및 플라보노이드류의 함량을 측정하고 인간 유래 정상 피부 각질세포를 직접적으로 보호 할 수 있는지를 확인하고자 하였다.
본 연구에서는 蒲公英 추출물(TH)의 항산화 효과 및 피부 각질세포 보호효과를 확인하기 위하여, 항산화 작용에 중요한 부분을 차지하고 있는 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 조사하였고, DPPH 자유 산소라디칼 제거능을 측정하였으며, 인간 유래 피부각질세포인 HaCaT 세포에서 과산화수소에 의하여 발생하는 산화적 스트레스를 효율적으로 제거할 수 있는지 관찰하였다.
2). 이러한 결과를 바탕으로 실제 정상 세포 내에서 항산화 효과를 발휘함으로써 정상 세포를 산화적 스트레스로부터 보호할 수 있는 지를 살펴보았다. 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂)는 산소를 이용한 세포 내 호흡과정에서 정상적으로 생성되는 물질이며, 다양한 세포 실험에서 산화적 스트레스를 생성하는 자극원으로 사용된다²⁴⁾.

제안 방법

세포의 부착이 끝난 후, TH를 처리하고 37℃, 5% CO₂가 공여되는 환경에 24시간 동안 방치하였다. 24시간의 배양이 끝난 후, 산화적 스트레스를 유발하여 세포 생존율을 감소시키는 것으로 알려져 있는 500 mM의 과산화수소 (hydrogen peroxide, H₂O₂)를 처리하고 37℃, 5% CO₂가 공여되는 환경에 4시간 동안 방치하였다. 4시간동안의 배양이 끝난 후, 배양액을 제거하고 각 well에 생성된 formazan결정을 DMSO를 첨가하여 녹인 후 Microplate Reader (Bio-rad, USA)를 이용하여 540 ㎚에서 광도를 측정하였다.
24시간의 배양이 끝난 후, 산화적 스트레스를 유발하여 세포 생존율을 감소시키는 것으로 알려져 있는 500 mM의 과산화수소 (hydrogen peroxide, H₂O₂)를 처리하고 37℃, 5% CO₂가 공여되는 환경에 4시간 동안 방치하였다. 4시간동안의 배양이 끝난 후, 배양액을 제거하고 각 well에 생성된 formazan결정을 DMSO를 첨가하여 녹인 후 Microplate Reader (Bio-rad, USA)를 이용하여 540 ㎚에서 광도를 측정하였다.
항온수조(water bath, 비젼, 한국)에서 37℃를 유지하면서 1시간 동안 반응 후 UV-Vis spectrophotometer (Pharmacia Biotech ultrospec-2000)를 사용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. Basal level은 시료 용액 대신 methanol 용액을 동일하게 처리한 군으로부터 얻었으며, 표준곡선은 tannic acid (Sigma Co., USA)의 농도를 0～500 ㎍/㎖가 되도록 하고 이로부터 총 페놀함량을 구하였다.
DPPH radical에 대한 각 시료의 환원력을 측정하기 위해 99% 메탄올에 각 시료를 녹여 농도별로 희석한 희석액 800 ㎕와 메탄올에 녹인 0.15 mM DPPH 용액 200㎕를 가하여 실온에 30분 방치한 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물의 유리라디칼 소거 활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 RC₅₀값으로 나타내었다.
TH의 농도별 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 측정하였다. 그 결과 농도에 비례하여 DPPH 자유 라디칼 소거능이 증가함이 관찰되었다.
蒲公英 추출물이 가지는 항산화 효과 및 인간 유래 정상 피부 각질세포 보호효과를 확인하기 위하여 蒲公英 추출물의 페놀류 및 플라보노이드류 함량, DPPH 자유라디칼 제거능을 조사하고, HaCaT 세포에 처리하여 생존율 및 산화적 스트레스로부터의 보호효과를 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
1 g에 methanol을 10 ㎖를 가하여 70℃에서 30분 동안 추출 한 후 1 ㎎/㎖로 만들어 사용하였다. 검액 100 ㎕에 1 ㎖의 diethylene glycol을 첨가하고 다시 1N-NaOH 100㎕를 넣어 잘 혼합시켜 37℃ water bath에서 1시간 반응시킨 후 UV-Vis spectrophotometer (Pharmacia Biotech ultrospec-2000)를 사용하여 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 공시험은 시료 용액 대신 methanol 용액을 동일하게 처리하였으며, 표준곡선은 naringin (Sigma Co.
세포는 T-75 플라스크의 80% 정도 자랐을 때 세포의 탈착을 위하여 PBS로 가볍게 세척한 다음, Trypsin-EDTA (Gibco/ BRL)을 처리한 후, 37℃에서 5분간 방치하였다가 세포를 채집하였다. 계대 배양은 2～3일에 1회씩 시행하였다.
검액 100 ㎕에 1 ㎖의 diethylene glycol을 첨가하고 다시 1N-NaOH 100㎕를 넣어 잘 혼합시켜 37℃ water bath에서 1시간 반응시킨 후 UV-Vis spectrophotometer (Pharmacia Biotech ultrospec-2000)를 사용하여 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 공시험은 시료 용액 대신 methanol 용액을 동일하게 처리하였으며, 표준곡선은 naringin (Sigma Co., USA)의 농도를 0～400 ㎍/㎖이 되도록 하여 작성하고 이로부터 총 플라보노이드 함량을 구하였다.
구입된 蒲公英 50 g에 에탄올 500 ㎖를 가하여 5시간 동안 heating mentle로 80℃를 유지하며 에탄올 추출을 시행하였다. 추출액은 filter paper (NO.
그 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT)를 처리하여 MTT가 생존 세포의 효소작용에 의해 환원되도록 4시간을 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 각 well에 생성된 formazan결정에 DMSO를 첨가하여 녹인 후 Microplate Reader (Bio-rad, USA)를 이용하여 540 ㎚에서 광도를 측정하였다.
산화적 스트레스 요인에 의한 세포 손상 보호효과는 MTT법¹⁵⁾을 변형하여 측정하였다. 먼저 HaCaT 세포주를 96-well plate에 well당 5×10⁴개씩 분주한 후, 37℃, 5% CO₂가 공여되는 환경에 4시간 동안 방치하여 부착을 시행하였다.
의 배양기에서 배양하였다. 세포는 T-75 플라스크의 80% 정도 자랐을 때 세포의 탈착을 위하여 PBS로 가볍게 세척한 다음, Trypsin-EDTA (Gibco/ BRL)을 처리한 후, 37℃에서 5분간 방치하였다가 세포를 채집하였다. 계대 배양은 2～3일에 1회씩 시행하였다.
각 시료 추출물의 유리라디칼 소거 활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 RC₅₀값으로 나타내었다. 이때 활성비교를 위하여 butylated hydroxyanisole(BHA)과 ascorbic acid를 사용하였으며 시료농도의 1/10이 되도록 첨가하여 같은 방법으로 항산화 효과를 측정하였다.
본 연구에서 400 ㎍/㎖ 농도를 24시간 동안 유지한 것을 감안할 때, 생체 내에서는 이러한 상태의 유지가 거의 불가능할 것으로 생각된다. 이러한 결과를 바탕으로 본 저자들은 HaCaT 세포주 보호효과를 관찰할 농도를 200 ㎍/㎖로 정하였다.
이상에서와 같이 蒲公英 추출물의 항산화 효과와 인간 유래 각질세포에 대한 보호작용을 확인하였다. 이러한 자료는 추후 蒲公英의 피부과 영역 사용 확대의 근거로 사용될 수 있으며, 이에 관한 지속적 연구가 뒤따라야 할 것으로 생각된다.
총 페놀 함량은 Folin-Denis를 약간 변형하여 측정하였다. 추출물 0.
반응시킨 후 10% Na₂CO₃ 포화용액을 100 ㎕을 첨가하고, 부피를 1 ㎖ 로 맞추기 위해 증류수 150 ㎕을 넣어 잘 혼합시켰다. 항온수조(water bath, 비젼, 한국)에서 37℃를 유지하면서 1시간 동안 반응 후 UV-Vis spectrophotometer (Pharmacia Biotech ultrospec-2000)를 사용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. Basal level은 시료 용액 대신 methanol 용액을 동일하게 처리한 군으로부터 얻었으며, 표준곡선은 tannic acid (Sigma Co.

대상 데이터

1, Advantec)로 여과한 다음, 감압농축기(EYELA, Japan)를 이용하여 45℃에서 감압농축하였다. 감압 농축된 용액을 동결건조기(삼원, 한국)로 동결 건조시켜 3.6g의 최종 산물을 얻었다.
본 실험에 사용된 세포주는 인간 유래 skin keratinocyte인 HaCaT 세포주로 DMEM(Dulbecco’s odified Eagle Medium)에 10%(v/v) fetal bovine serum (FBS, Gibco)과 항생제(Antibiotic antimycotic)를 첨가한 후 37℃, 5% CO2의 배양기에서 배양하였다.
본 실험에서 사용한 蒲公英은 시중(전남생약조합, 화순)을 통해서 신선한 상태로 구입하여 사용하였다.
실험에 사용된 α-α-Diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH)·MTT 등의 시약은 Sigma 제품(Sigma Chemical Co, USA)을 사용하였다.
인간 유래 정상 피부 각질세포(Keratinocyte)인 HaCaT 세포주는 조선대학교 단백질소재연구센터에서 제공받아 실험에 사용하였다.
실험에 사용된 α-α-Diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH)·MTT 등의 시약은 Sigma 제품(Sigma Chemical Co, USA)을 사용하였다. 측정 기기로는 Microplate Reader (Bio-rad, USA), UV-Vis spectrophotometer (Pharmacia Biotech ultrospec-2000) 등을 사용하였다.

데이터처리

본 연구의 통계처리는 SPSS 10.0 for Windows program을 사용하여 실시하였으며, Student-Newman-Keuls multiple range test를 이용하여 평균값의 유의성을 5% 미만일 때 유의성이 있는 것으로 판단하였다.

이론/모형

HaCaT Cells were attached 96-well plate, and added TH as indicated concentrations respectively. After 24 hr incubation, cell viabilities were measured using MTT methods. Result are presented as mean±SD.
TH가 세포 생존율에 미치는 영향 측정은 MTT assay¹⁵⁾를 통해 확인하였다. 간략히 정리하면, 96 well plate에 3×10⁴ cell/㎖의 농도로 분주하여 배양기에서 37℃, 5% CO₂를 유지하며 24시간 동안 pre-incubation시킨 후 25～800 ㎍/㎖의 농도로 약물을 처리하여 24시간 배양하였다.
총 플라보노이드 함량은 Davis 변법¹⁷⁾에 따라 추출물 0.1 g에 methanol을 10 ㎖를 가하여 70℃에서 30분 동안 추출 한 후 1 ㎎/㎖로 만들어 사용하였다. 검액 100 ㎕에 1 ㎖의 diethylene glycol을 첨가하고 다시 1N-NaOH 100㎕를 넣어 잘 혼합시켜 37℃ water bath에서 1시간 반응시킨 후 UV-Vis spectrophotometer (Pharmacia Biotech ultrospec-2000)를 사용하여 420 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

성능/효과

1. HaCaT 세포에 대하여 400 ㎍/㎖ 이상에서 유의할 만한 세포독성이 나타났다.
2. 총 페놀류 함량을 측정한 결과 42.64±1.90 ㎍/㎖로 나타났다.
3. 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과 28.09±1.84 ㎍/㎖로 나타났다.
4. DPPH 라디칼 소거 활성을 측정한 결과 농도에 비례하여 DPPH 자유 라디칼 소거능 증가가 관찰되었으며, IC₅₀은 165.5 ㎍/㎖로 나타났다.
5. HaCaT 세포주에 대하여 과산화수소에 의해 발생하는 산화적 스트레스에 대한 보호 효과를 측정한 결과 유의한 수준으로 과산화수소에 의한 세포 사멸을 방지하였다.
TH가 직접적으로 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 인간 유래 정상 피부 각질세포인 HaCaT 세포에 농도별로 TH를 투여하고 24시간 후, 세포 생존율을 측정한 결과 400 ㎍/㎖ 이상에서 세포 독성이 나타났다. 400, 800 ㎍/㎖에서 세포 생존율은 각각 53.
2). The half maximal inhibitory concentration (IC₅₀)은 165.5 ㎍/㎖로 계산되어, 세포독성을 보이지 않는 유효 범위 내의 값으로 항산화 효과를 발휘하는 것으로 나타났다(Fig. 2). 이러한 결과를 바탕으로 실제 정상 세포 내에서 항산화 효과를 발휘함으로써 정상 세포를 산화적 스트레스로부터 보호할 수 있는 지를 살펴보았다.
TH의 농도별 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 측정하였다. 그 결과 농도에 비례하여 DPPH 자유 라디칼 소거능이 증가함이 관찰되었다. 200 ㎍/㎖ 이상의 농도에서는 양성 대조군으로 사용한 Vit.
따라서 TH가 가지는 항산화 효과를 측정하기 위하여 DPPH free radical 제거능을 관찰한 결과 농도에 비례하여 DPPH 자유 라디칼 소거능 증가가 관찰되었으며, 산화방지제로 사용되는 butylated hydroxy Toluene (BHT)와 유사한 수준의 활성을 보였다(Fig. 2). The half maximal inhibitory concentration (IC₅₀)은 165.
1). 본 연구에서 400 ㎍/㎖ 농도를 24시간 동안 유지한 것을 감안할 때, 생체 내에서는 이러한 상태의 유지가 거의 불가능할 것으로 생각된다. 이러한 결과를 바탕으로 본 저자들은 HaCaT 세포주 보호효과를 관찰할 농도를 200 ㎍/㎖로 정하였다.
본 연구의 결과에서 TH는 42.64±1.90 ㎍/ml의 총 페놀류를 함유하고 있고, 28.09±1.84 ㎍/ml의 플라보노이드류를 함유하고 있는 것으로 나타났다(Table 1).
과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂)는 산소를 이용한 세포 내 호흡과정에서 정상적으로 생성되는 물질이며, 다양한 세포 실험에서 산화적 스트레스를 생성하는 자극원으로 사용된다²⁴⁾. 본 연구의 결과에서 과산화수소의 처리는 HaCaT 세포의 생존율을 유의한 수준으로 감소시켰다. 이러한 생존율 감소에 대하여 TH의 보호효과를 관찰한 결과 유의한 수준으로 생존율 감소를 억제하는 것으로 나타났다(Fig.
산화적 스트레스를 유발하여 세포 생존율을 감소시키는 것으로 알려져 있는 과산화수소(hydrogen peroxide, H2O2)가 유발시키는 세포 손상으로부터 TH가 HaCaT세포를 보호할 수 있는지 살펴 본 결과 과산화수소 처리군의 세포 생존율은 80.2±6.5%를 보였고, TH 전처리 군에서는 94.5± 8.5%의 세포생존을을 보여 유의한 차이를 나타냈다(Fig. 3).
. 연구 결과에서 TH는 생체 내에서는 도달하기 힘든 농도라 생각되는 400 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 세포 독성을 나타냈다(Fig. 1). 본 연구에서 400 ㎍/㎖ 농도를 24시간 동안 유지한 것을 감안할 때, 생체 내에서는 이러한 상태의 유지가 거의 불가능할 것으로 생각된다.
본 연구의 결과에서 과산화수소의 처리는 HaCaT 세포의 생존율을 유의한 수준으로 감소시켰다. 이러한 생존율 감소에 대하여 TH의 보호효과를 관찰한 결과 유의한 수준으로 생존율 감소를 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 3). 이러한 결과는 상기한 항산화 효과가 정상 피부 각질 세포에서도 관찰되는 것으로 해석되며, 추후 후속연구를 통하여 항산화 효소계에 속하는 어떤 효소 또는 어떤 기전에 관여하는지 등을 포함한 명확한 기전을 연구해야 할 것으로 생각된다.
재료 및 방법에서 논술한 바와 같이 TH가 함유하고 있는 페놀류 화합물의 총량을 측정한 결과 96.8±1.8 ㎍/㎖로 나타났으며, 총 플라보노이드 함량은 96.8±1.8 ㎍/㎖로 나타났다(Table 1).

후속연구

3). 이러한 결과는 상기한 항산화 효과가 정상 피부 각질 세포에서도 관찰되는 것으로 해석되며, 추후 후속연구를 통하여 항산화 효소계에 속하는 어떤 효소 또는 어떤 기전에 관여하는지 등을 포함한 명확한 기전을 연구해야 할 것으로 생각된다.
天南星의 결과와 비교하였을 때, 총 페놀류는 비슷한 수준을 보였지만, 플라보노이드류는 4배 정도에 달하는 수치라고 할 수 있다. 이러한 결과는 제한적이지만, TH가 항산화 효과를 통하여 생체 내에서 산화적 스트레스에 의하여 발생하는 각종 질병을 예방해 줄 수 있을 가능성을 제시한다.
이상에서와 같이 蒲公英 추출물의 항산화 효과와 인간 유래 각질세포에 대한 보호작용을 확인하였다. 이러한 자료는 추후 蒲公英의 피부과 영역 사용 확대의 근거로 사용될 수 있으며, 이에 관한 지속적 연구가 뒤따라야 할 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	蒲公英이란 무엇인가?	蒲公英(Taraxaci Herba, TH)은 국화과에 속한 다년생초본인 민들레Taraxacum platycarpum H. Dahlstedt 및 동속 근연식물의 전초로 淸熱解毒, 消腫散結, 利尿通淋의 효능을 가지고 있어서 疔瘡腫毒, 乳癰, 瘰癧 등 피부의 염증 질환에 다용되어 왔다1).
	플라보노이드란 무엇인가?	이들은 항산화, 항암 등의 다양한 생리활성을 가진다8,9). 플라보노이드(flavonoid)는 음식물에 널리 분포하는 황색계통의 색소로 페닐(phenyl)기 2개가 C3사슬에 결합한 탄소골격구조로 되어 있으며, 항균, 항암, 항바이러스, 항알레르기 및 항염증 활성이 있고, 생체 내에서 항산화 작용이 있는 것으로 알려져 있다10,11). 최근 부 등13)은 동양 각국에 자생 또는 재배하는 여주를 대상으로 한 실험에서 ABTS 양이온 소거 활성과 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 유의한 상관 관계가 있음을 보고하였고, 최 등14)은 紫菀에서 분리한 플라보노이드가 superoxide를 효율적으로 제거함으로써 항산화 효과가 있음을 보고하였다.
	포공영의 대표적인 성분은 무엇인가?	포공영은 한국뿐만 아니라 유럽에서도 약초 및 식품으로 이용되고2), 뿌리는 커피 대용으로 이용되기도 하며, 북미에서는 전통적인 민간약초로 알려져 있다. 蒲公英의 대표적인 성분으로는 taraxastenol, taraxarol, taraxerol 등이 보고되어 있다1,2).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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