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문제 정의
- 이 중 agglutinin은 세포표면의 galactose-N-acetyl-galactosamine에 특이하게 결합하는 당단백질로 알려져 있으며(15-18) PCR을 이용한 agglutinin에 대한 검출방법은 아직 보고된 바 없다. 본 연구에서는 식품중의 땅콩성분을 검출하는 방법을 개발하기 위하여 agglutinin 유전자를 target DNA로 사용하는 PCR 방법을 확립하고 이를 이용하여 가공식품에서의 땅콩성분 검출과 민감도를 조사하였다.
제안 방법
- PCR 조건은 95℃에서 2분간 실시 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초를 1 cycle로 하여 총 35 cycle을 수행하였으며, 마지막 단계로 72°C에서 3분간 수행하였다. PCR product는 ethidium bromide를 포함한 2% agarose gel에서 전기 영동하여 DNA 산물의 크기 및 양을 확인하였다.
- PCR 조건은 95℃에서 2분간 실시 후, 95℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 30초를 1 cycle로 하여 총 35 cycle을 수행하였으며, 마지막 단계로 72°C에서 3분간 수행하였다.
- PCR에 사용하는 template DNA의 총량을 1 µg으로 하여 대두에서 추출한 DNA에 땅콩 DNA를 각각 10%(100 ng)에서 0.001%(10 pg)까지 10배씩 단계적으로 희석하여 섞은 후 PCR을 수행하였다(Fig. 3B).
- 일반적으로 땅콩을 그대로 섭취하는 경우를 제외하고는 땅콩의 소비 형태는 가공식품의 원료로 일부분 첨가되어 섭취되는 경우가 대부분이다. 그러므로 가공식품에 원료로 소량 첨가되어 있는 땅콩의 검출한계를 확인하기 위하여 과량의 대두 DNA에 소량의 땅콩 DNA를 인위적으로 혼합 후 땅콩 DNA의 검출을 시도하였다. PCR에 사용하는 template DNA의 총량을 1 µg으로 하여 대두에서 추출한 DNA에 땅콩 DNA를 각각 10%(100 ng)에서 0.
- 디자인한 primer pair(agglutinin-1/agglutinin-2)의 땅콩에 대한 특이성을 확인하기 위하여 땅콩 및 땅콩이 첨가된 6종의 가공식품과 견과류, 곡류, 두류 및 땅콩이 표시되어 있지 않은 가공식품 13종에서 추출한 각각의 DNA를 대상으로 PCR을 수행하여 특이적 크기의 DNA 단편 생성여부를 확인하였다. 또한 PCR법을 통한 땅콩의 검출 가능한 최소 DNA 농도를 알아보기 위하여 정제한 땅콩의 DNA를 100 ng에서 1 pg까지 단계적으로 10배씩 희석하여 PCR을 수행하였다.
- 땅콩 성분을 검출하는 PCR 방법의 최적조건을 구성하고 그 특이성을 조사하기 위하여 땅콩과 5종의 견과류(피스타치오, 아몬드, 해바라기씨, 잣, 호두), 2종의 곡류(백미, 흑미), 4종의 두류 (대두, 검은콩, 강낭콩, 팥)에 대해 PCR을 수행하였다(Fig. 1). 땅콩을 제외한 11종의 다른 식품에서는 어떠한 크기의 DNA 단편도 증폭되지 않아 agglutinin 유전자를 target으로 하는 본 PCR 방법의 특이성을 확인할 수 있었다.
- 디자인한 primer pair(agglutinin-1/agglutinin-2)의 땅콩에 대한 특이성을 확인하기 위하여 땅콩 및 땅콩이 첨가된 6종의 가공식품과 견과류, 곡류, 두류 및 땅콩이 표시되어 있지 않은 가공식품 13종에서 추출한 각각의 DNA를 대상으로 PCR을 수행하여 특이적 크기의 DNA 단편 생성여부를 확인하였다. 또한 PCR법을 통한 땅콩의 검출 가능한 최소 DNA 농도를 알아보기 위하여 정제한 땅콩의 DNA를 100 ng에서 1 pg까지 단계적으로 10배씩 희석하여 PCR을 수행하였다. 또한 가공식품에 첨가된 땅콩성분의 검출감도를 조사하기 위하여 대두에서 추출한 DNA에 땅콩의 DNA를 10%(땅콩 100 ng+대두 900 ng), 1%(땅콩 10 ng+대두 990 ng), 0.
- 또한 PCR법을 통한 땅콩의 검출 가능한 최소 DNA 농도를 알아보기 위하여 정제한 땅콩의 DNA를 100 ng에서 1 pg까지 단계적으로 10배씩 희석하여 PCR을 수행하였다. 또한 가공식품에 첨가된 땅콩성분의 검출감도를 조사하기 위하여 대두에서 추출한 DNA에 땅콩의 DNA를 10%(땅콩 100 ng+대두 900 ng), 1%(땅콩 10 ng+대두 990 ng), 0.1%(땅콩 1 ng+대두 999 ng), 0.01%(땅콩 100 pg+대두 999.9 ng), 0.001%(땅콩 10 pg+대두 999.99 ng)로 혼합 후 PCR을 수행하였다.
- 사용한 식품시료의 DNA를 분리·정제하기 위하여 각 시료를 막자사발을 이용하여 분쇄 후 각각 0.1 g씩 취하여 PowerPrep™ DNA Extraction kit(Kogenbiotech, Seoul, Korea)를 이용하여 chromosomal DNA를 정제하고 100 µL의 멸균증류수로 DNA를 용출하여 사용하였다.
- Agglutinin은 땅콩에서 알레르기 유발 단백질의 하나로 알려져 있다. 식품중의 땅콩성분을 검출하기 위하여 agglutinin 유전자에 특이적인 primer pair를 이용하는 polymerase chain reaction(PCR) 방법을 개발하였다. PCR 반응은 땅콩에서 agglutinin DNA의 특정부분을 증폭시켰으나 11종의 다른 견과류, 두류 및 곡류(피스타치오, 아몬드, 해바라기씨, 잣, 호두, 대두, 검은콩, 강낭콩, 팥, 백미, 흑미)에 대해서는 반응하지 않았다.
- 이 PCR 방법의 특이성을 가공식품에서 확인하기 위하여 땅콩 성분이 대략 5-10% 첨가된 것으로 표시되어 있는 6종의 가공식품(비스킷류 2종, 잼류 1종, 캐러멜류 1종, 다류 1종, 견과류 가공품 1종)을 대상으로 PCR을 수행하였다(Fig. 2). 양성 대조군으로 순수한 땅콩(lane 1) 에서 증폭된 200 bp의 DNA 단편과 마찬가지로 테스트한 6종의 땅콩 함유식품 모두 동일한 크기의 DNA 단편만 증폭됨으로서 소량의 땅콩이 포함된 가공식품에 대해서도 본 PCR 방법의 특이성을 확인할 수 있었다.
- 이 염기 서열들을 ClustalW를 이용하여 alignment하고 공통의 서열을 참고하여 각각 20 mer의 forward primer인 agglutinin-1(5'-CCTTCAACTTCAACTCTT TC-3')과 reverse primer인 agglutinin-2(5'-GAAAGAGAACGAGGT CAC-3')를 제작하였다.
대상 데이터
- 땅콩을 포함하는 식품으로 땅콩과 땅콩이 대략 5-10% 첨가된 것으로 표시되어 있는 6종의 가공식품(비스킷류 2종, 잼류 1종, 캐러멜류 1종, 다류 1종, 견과류가공품 1종)을 시장에서 구입하여 사용하였다. 또한, 땅콩을 포함하지 않는 식품으로 5종의 견과류(피스타치오, 아몬드, 해바라기씨, 잣, 호두), 2종의 곡류(백미, 흑미), 4종의 두류(대두, 검은콩, 강낭콩, 팥) 및 땅콩이 표시되어 있지 않은 가공식품 13종(비스킷류 10 종, 초콜릿가공품 2종, 두유 1종)을 사용하였다.
- 땅콩을 포함하는 식품으로 땅콩과 땅콩이 대략 5-10% 첨가된 것으로 표시되어 있는 6종의 가공식품(비스킷류 2종, 잼류 1종, 캐러멜류 1종, 다류 1종, 견과류가공품 1종)을 시장에서 구입하여 사용하였다. 또한, 땅콩을 포함하지 않는 식품으로 5종의 견과류(피스타치오, 아몬드, 해바라기씨, 잣, 호두), 2종의 곡류(백미, 흑미), 4종의 두류(대두, 검은콩, 강낭콩, 팥) 및 땅콩이 표시되어 있지 않은 가공식품 13종(비스킷류 10 종, 초콜릿가공품 2종, 두유 1종)을 사용하였다.
이론/모형
- 땅콩에 특이적인 primer를 제작하기 위해 NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 GenBank에서 땅콩의 agglutinin 유전자(accession No. S42352, U22471, U22468, U22470 및 AJ311170)들의 염기서열을 참고하였다. 이 염기 서열들을 ClustalW를 이용하여 alignment하고 공통의 서열을 참고하여 각각 20 mer의 forward primer인 agglutinin-1(5'-CCTTCAACTTCAACTCTT TC-3')과 reverse primer인 agglutinin-2(5'-GAAAGAGAACGAGGT CAC-3')를 제작하였다.
성능/효과
- Lane M, 100 bp ladder; lane 1, 100 ng; lane 2, 10 ng; lane 3, 1 ng; lane 4, 100 pg; lane 5, 10 pg; lane 6, 1 pg; lane 7, no template control. (B) Small amount of peanut DNA (100 ng to 10 pg) was mixed with excessive amount of soybean DNA to yield the final concentrations ranging from 10% to 0.001%. Lane M, 100 bp ladder; lane 1, 10%; lane 2, 1%; lane 3, 0.
- 3B). 과량의 대두 DNA와 혼합된 땅콩 DNA의 검출한계는 0.1%(1 ng의 땅콩 DNA+999 ng의 대두 DNA)로 순수한 땅콩 DNA에 대한 검출한계(100 pg)보다 10배 정도 감소하는 것으로 나타났다.
- 대부분의 가공 식품에서 땅콩의 함량은 비스킷, 스낵 및 사탕 등에 5-10%, 두유에 따라 1% 내외가 함유되어 있는 것을 감안할때, 땅콩에 대한 특이성과 0.1%의 검출한계를 가진 본 PCR 방법은 땅콩이 첨가된 가공식품에서 땅콩성분을 검출하는 데는 충분히 활용이 가능할 것으로 생각한다. 현재 세계적으로 식품에서 땅콩성분을 검출하기 위한 방법으로 ELISA를 이용한 방법이 주로 사용되고 있다(8,20,21).
- 현재 국내에서 식품 중 미량의 땅콩성분 검출에 대한 연구 보고는 미흡한 실정이고, 일본의 경우 Hashimoto 등(19)이 밀, 메밀과 땅콩에 대한 multiplex PCR을 수행하여 이 3가지 종을 각각 구분한 연구 결과가 보고되었지만, PCR에 의한 검출한계 실험은 진행되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 PCR 방법을 통한 땅콩 DNA의 검출 가능한 최소 농도를 알아보기 위하여 정제된 땅콩의 DNA를 100 ng에서 1 pg까지 단계적으로 10배씩 희석하여 PCR을 수행한 결과 100 pg까지 검출이 가능하였다(Fig. 3A). 땅콩 100 mg에서 약 15 µg의 DNA를 얻을 수 있으므로 이 100 pg의 검출한계는 약 0.
- 1). 땅콩을 제외한 11종의 다른 식품에서는 어떠한 크기의 DNA 단편도 증폭되지 않아 agglutinin 유전자를 target으로 하는 본 PCR 방법의 특이성을 확인할 수 있었다. 한편 agglutinin 유전자들의 cDNA 염기서열상에서 두 primer에 의해 증폭되는 부위에 intron이 없다면 증폭될 것으로 예상하는 DNA 단편의 크기는 200 bp 이다.
- 이 PCR 방법으로 땅콩성분이 함유된 6종의 가공식품을 모두 확인할 수 있었으며 땅콩이 구성성분으로 표시되지 않은 13종의 다른 가공식품에 대해서는 모두 음성반응을 나타냈다. 본 방법은 정제된 땅콩 DNA를 100 pg까지 검출할 수 있었으며 대두 DNA 에 땅콩 DNA가 0.1%까지 혼합된 경우도 검출이 가능하였다.
- 한편 agglutinin 유전자들의 cDNA 염기서열상에서 두 primer에 의해 증폭되는 부위에 intron이 없다면 증폭될 것으로 예상하는 DNA 단편의 크기는 200 bp 이다. 실제 땅콩의 genomic DNA를 주형으로 하여 PCR을 한 결과 200 bp 정도의 DNA 단편을 얻어 두 primer에 의해 증폭되는 땅콩의 agglutinin 유전자 부위는 intron을 갖고 있지 않은 것으로 보인다.
- 2). 양성 대조군으로 순수한 땅콩(lane 1) 에서 증폭된 200 bp의 DNA 단편과 마찬가지로 테스트한 6종의 땅콩 함유식품 모두 동일한 크기의 DNA 단편만 증폭됨으로서 소량의 땅콩이 포함된 가공식품에 대해서도 본 PCR 방법의 특이성을 확인할 수 있었다. 한편 성분분석표에 땅콩성분의 함유여부가 표시되어 있지 않은 13종의 가공식품 (비스킷 10 종, 초콜릿가공품 2종, 두유 1종)에 대해서도 이 PCR 방법을 적용한 결과, 땅콩성분이 표시되어 있지 않은 가공식품 모두 음성반응을 나타내 agglutinin 유전자를 target으로 하는 본 PCR 방법이 땅콩에 특이적임을 확인하였다(data not shown).
- PCR 반응은 땅콩에서 agglutinin DNA의 특정부분을 증폭시켰으나 11종의 다른 견과류, 두류 및 곡류(피스타치오, 아몬드, 해바라기씨, 잣, 호두, 대두, 검은콩, 강낭콩, 팥, 백미, 흑미)에 대해서는 반응하지 않았다. 이 PCR 방법으로 땅콩성분이 함유된 6종의 가공식품을 모두 확인할 수 있었으며 땅콩이 구성성분으로 표시되지 않은 13종의 다른 가공식품에 대해서는 모두 음성반응을 나타냈다. 본 방법은 정제된 땅콩 DNA를 100 pg까지 검출할 수 있었으며 대두 DNA 에 땅콩 DNA가 0.
- 양성 대조군으로 순수한 땅콩(lane 1) 에서 증폭된 200 bp의 DNA 단편과 마찬가지로 테스트한 6종의 땅콩 함유식품 모두 동일한 크기의 DNA 단편만 증폭됨으로서 소량의 땅콩이 포함된 가공식품에 대해서도 본 PCR 방법의 특이성을 확인할 수 있었다. 한편 성분분석표에 땅콩성분의 함유여부가 표시되어 있지 않은 13종의 가공식품 (비스킷 10 종, 초콜릿가공품 2종, 두유 1종)에 대해서도 이 PCR 방법을 적용한 결과, 땅콩성분이 표시되어 있지 않은 가공식품 모두 음성반응을 나타내 agglutinin 유전자를 target으로 하는 본 PCR 방법이 땅콩에 특이적임을 확인하였다(data not shown).
후속연구
- Holzhauser와 Vieths(8)은 ELISA 방법으로 식품의 종류에 따라 땅콩성분을 2-18 ppm까지 검출이 가능하였다고 보고한 바 있다. 이와 비교하여 볼 때 알레르기를 일으키는 agglutinin 단백질의 유전자를 검출하는 본 PCR 시스템은 검출 수준이 비교적 낮아 민감도를 개량할 필요가 있으며 땅콩에서 DNA copy 수가 더 많은 유전자를 target으로 사용하거나 보다 민감한 real-time PCR 방법의 사용이 바람직할 것으로 보인다.
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