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문제 정의
- 먼저 시험관내(in vitro)실험에서는 선학초 추출물의 인간위암세포주 AGS에서의 세포사멸 기전을 살펴보았다. 또한 시험관외(in vivo) 실험을 통해 시험관내(in vitro) 실험에서의 선학초 추출물의 抗癌 效果가 동물실험에서도 같은 결과를 보이는지도 살펴보았다. 한편, 쥐의 장세포주 RIE1에서의 선학초 추출물의 작용기전을 AGS 암세포주에서의 작용기전과 비교함으로써 선학초의 항암세포에 대한 선택적 치료효과를 밝혀보고자 하였다.
- 본 연구에서는 APL이 암세포에만 선택적으로 세포독성을 나타내는 항암 활성을 가지는지 in vitro에서 확인하고(Fig. 1, Fig 2), 세포사멸의 기전에는 어떻게 관여하는지를 살펴보기 위하여 caspase-3, caspase-8, caspase-9 활성 및 Bcl-2 family protein의 발현을 살펴보았다.
- 본 연구에서는 항암효과가 있는 것으로 알려진 선학초의 시험관내 실험과 시험관외 실험을 바탕으로 선학초의 항암효과에 대한 구체적인 기전을 연구하기 위한 실험을 진행하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 한편, 쥐의 장세포주 RIE1에서의 선학초 추출물의 작용기전을 AGS 암세포주에서의 작용기전과 비교함으로써 선학초의 항암세포에 대한 선택적 치료효과를 밝혀보고자 하였다. 이상의 실험을 수행한 결과 선학초의 항암효능과 암세포에 대한 선택적 치료 기전에 관하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 선학초의 항암 활성 및 항암기전에 대한 실험적 연구가 아직까지는 양적, 질적으로 매우 부족함을 알 수 있다. 이에 본 저자는 선학초의 항암효능을 확인하고, 특히 세포사멸 기작(apoptosis)에 근거하여 그 항암효과의 기전을 밝히고자 연구를 시행하였다.
- 그러나 선학초의 실험적 연구는 매우 부족하며, 특히 抗癌 活性에 대한 기초적인 실험연구들은 거의 없는 상태이다. 이에 저자는 실험을 통해 선학초의 抗癌 效能을 확인하고, 그 메커니즘을 알아보고자 하였다.
- 또한 시험관외(in vivo) 실험을 통해 시험관내(in vitro) 실험에서의 선학초 추출물의 抗癌 效果가 동물실험에서도 같은 결과를 보이는지도 살펴보았다. 한편, 쥐의 장세포주 RIE1에서의 선학초 추출물의 작용기전을 AGS 암세포주에서의 작용기전과 비교함으로써 선학초의 항암세포에 대한 선택적 치료효과를 밝혀보고자 하였다. 이상의 실험을 수행한 결과 선학초의 항암효능과 암세포에 대한 선택적 치료 기전에 관하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 1% Tween 20이 들어간 1×PBS로 washing하고, 1차 항체를 HRP-conjugated secondary antibodies와 1:1,000으로 1시간 정도 반응시켰다. Chemiluminescence detection system(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, England)을 사용하여 X-ray film으로 결과를 확인하였다. 또한, 각 실험에 사용한 억제제(inhibitors)는 1시간 전에 z-VAD-fmk(50μM,Calbiochem)를 처리한 다음, APL을 처리하여 SDS-PAGE와 Western blot analysis를 수행하였다.
- 이러한 결과가 실제 동물실험에서 같은 결과를 보이는지 확인하기 위하여 시험관외 실험을 진행하였다. LLC mouse tumor cell을 6주령된 C57BL/6J 마우스의 등쪽에 접종하여 일정한 크기의 암이 형성되도록 한 후 세 그룹으로 나누어 식염수만을 복강주사한 군(그룹-1, control)과 APL을 농도별로 처리한 두 군(그룹-2; 50 ㎎/㎏, -3; 100 ㎎/㎏)으로 나누어 실험을 진행하였다. 선학초가 마우스에게 독성을 유발하는지를 간접적으로 측정하기 위하여 APL을 복강주사하는 동안의 몸무게의 변화를 측정하였다.
- cells) 를 60㎜ dishes에 깐 다음, 24시간 동안 안정화시켰다.다양한 농도의 선학초를 처리한 다음, 24, 48, 72 시간 후에 detached 와 adherent cells 을 모두 모아 95% ethanol 3 ㎖(0.5% BSA 첨가)로 고정시켰다.샘플이 모아질 때까지 샘플은 -20℃에 보관하였다.
- 5×106 cells)를 100㎜ dishes에 깐 다음, 24시간 동안 안정화시켰다. 다양한 농도의 선학초를 처리한 다음, 24, 48, 72 시간 후에 detached와 adherent cells을 모두 모은 후, ice-cold PBS로 두 번 wash하였다. 각 시간별로 모아진 cell pellet을 lysis buffer를 이용하여 단백질만을 분리하였다.
- 다음으로는 실제로 APL 추출물이 암의 부피를 감소시키는지 확인하기 위하여 마우스에서 암을 제거하여 암의 부피와 무게 등을 비교하였다. 그룹-1(control)에 비하여 APL을 처리한 군에서 암을 접종한지 18일 후에 통계적으로 유의한 수준으로 암의 부피가 감소한 것을 관찰 할 수 있었다(Fig.
- 떼어낸 암조직의 일부를 Western blot을 수행하여 세포 사멸 과정에 관련하는 marker들을 확인하였다. APL을 처리한 군뿐만이 아니라 그룹-1(control)에서도 역시 세포 사멸에 관련된 caspase cascade가 활성화됨을 확인하였다(Fig.
- 또한, 각 실험에 사용한 억제제(inhibitors)는 1시간 전에 z-VAD-fmk(50μM,Calbiochem)를 처리한 다음, APL을 처리하여 SDS-PAGE와 Western blot analysis를 수행하였다.
- 먼저 시험관내(in vitro)실험에서는 선학초 추출물의 인간위암세포주 AGS에서의 세포사멸 기전을 살펴보았다. 또한 시험관외(in vivo) 실험을 통해 시험관내(in vitro) 실험에서의 선학초 추출물의 抗癌 效果가 동물실험에서도 같은 결과를 보이는지도 살펴보았다.
- 선학초가 마우스에게 독성을 유발하는지를 간접적으로 측정하기 위하여 APL추출물을 복강주사하는 동안의 몸무게의 변화를 측정하였다. 미묘하지만 100㎎/㎏ APL 추출물을 투약한 마우스가 대조군에 비해서 몸무게 증가율이 낮은 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 선학초가 마우스에게 독성을 유발하는지를 간접적으로 측정하기 위하여 APL추출물을 복강주사하는 동안의 몸무게의 변화를 측정하였다. 미묘하지만 100㎎/㎏ APL 추출물을 투약한 마우스가 대조군에 비해서 몸무게 증가율이 낮은 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 세포 생존율 측정 실험을 하기 위해서 AGS, RIE1 세포(1× 104 세포/100㎕)를 96-well tissue culture plate에 깐 다음, 24시간 동안 안정화시켰다.
- 암 부피의 측정은 caliper(500-181-20, Mitutoyo, Japan)를 이용하였으며, 계산 방법은 아래와 같다. Tumor volume= 단축 × 단축 × 장축
- 2 ㎖ saline복강 주사하고, 그룹-2(약물 투약, N=3)는 50㎎/㎏ APL복강 주사하고, 그룹-3(약물 투약군, N=3)는 100 ㎎/㎏ APL 복강 주사하였다. 암을 접종한 1주일 후부터 11일 동안 매일 복강 주사하고, 몸무게는 이틀에 한번 측정하였다.
- 시험관내 실험에서 APL 추출물은 항암효능을 가지고 있었다. 이러한 결과가 실제 동물실험에서 같은 결과를 보이는지 확인하기 위하여 시험관외 실험을 진행하였다. LLC mouse tumor cell을 6주령된 C57BL/6J 마우스의 등쪽에 접종하여 일정한 크기의 암이 형성되도록 한 후 세 그룹으로 나누어 식염수만을 복강주사한 군(그룹-1, control)과 APL을 농도별로 처리한 두 군(그룹-2; 50 ㎎/㎏, -3; 100 ㎎/㎏)으로 나누어 실험을 진행하였다.
- 이러한 결과들은 APL 추출물에 의한 세포사멸현상이 세포 외-내부사멸 경로 혹은 미토콘드리아를 경유하여 일어날 수 있음을 알 수 있었다21. 이에 APL 추출물을 AGS 세포에 처리하여 미토콘드리아를 경유하는 세포사멸과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 Bcl-2 family protein의 level변화를 확인하였다. 그 결과, pro-apoptotic members인 Bax 단백질은 눈에 띄게 시간 의존적으로 증가하였고, 반면에 Bcl-2와 Bcl-xL와 같은 anti-apoptotic members의 발현은 감소하였다(Fig.
- Lewis Lung Carcinoma(LLC) cells(5 × 105/50 ㎕)를 6주령 된 C57BL/6 mice(Daehan Biolink) 총 아홉 마리의 등에 피하주사로 접종하였다. 일주일 후에 세 마리씩 세 그룹으로 나누어 그룹-1(대조군, N=3)은 0.2 ㎖ saline복강 주사하고, 그룹-2(약물 투약, N=3)는 50㎎/㎏ APL복강 주사하고, 그룹-3(약물 투약군, N=3)는 100 ㎎/㎏ APL 복강 주사하였다. 암을 접종한 1주일 후부터 11일 동안 매일 복강 주사하고, 몸무게는 이틀에 한번 측정하였다.
- 실험에 사용된 약재인 선학초(Agrimonia Pilosa Ledebour: APL, 짚신나물)는 옴니허브(Korea)에서 구입하여 100g을 정량 후 80% 에탄올을 가하여 30분 동안 2회에 걸쳐 초음파진동을 이용하여 추출액을 획득하였다.지름 185㎜ 종이여과지(Whatman, Maidstone, England)를 이용하여 감압 여과하였다. 그 후 감압 농축기(Eyela, Japan)를 사용하여 농축한 다음, 동결 건조기(Freezedryer, Matsushita, Japan)로 동결 건조하여 분말 5.
대상 데이터
- Lewis Lung Carcinoma(LLC) cells(5 × 105/50 ㎕)를 6주령 된 C57BL/6 mice(Daehan Biolink) 총 아홉 마리의 등에 피하주사로 접종하였다.
- 본 실험에 사용한 시약은 특별히 명기한 것 외에는 모두 Sigma(Sigma-Aldrich, Michigan, USA)에서 구입하였다.
- 실험에 사용된 동물(중앙실험동물[주], 한국)은 5주령의 C57BL/6J계 雌性 鼠(체중 18g-20g)를 공급 받아 경희대 한의과대학 동물실 환경(24±2℃, 습도40～60%,晝夜 12시간 교대로 150～300Lux 照 射)에서 淨化 |멸균된 증류수와 고형사료(조단백질 21.1%, 조지방 3.5%, 조섬유 5.0%, 조회분 8.0%, 칼슘 0.6%, 인 0.6% - 퓨리나[주], 한국)를 충분히 공급하고, 동물사육 cage(20 × 26 × 13cm)에 넣고 매주 3회 깔짚을 교체하여 청결을 유지하며, 건강 상태를 관찰하면서 1주간 적응시켰다.
- 실험에 사용된 약재인 선학초(Agrimonia Pilosa Ledebour: APL, 짚신나물)는 옴니허브(Korea)에서 구입하여 100g을 정량 후 80% 에탄올을 가하여 30분 동안 2회에 걸쳐 초음파진동을 이용하여 추출액을 획득하였다.지름 185㎜ 종이여과지(Whatman, Maidstone, England)를 이용하여 감압 여과하였다.
- 인간 위암세포주 AGS와 쥐의 장세포주 RIE1는 미국 세포주은행(American Type Culture Collection)을 통하여 구입하였으며, AGS는 RPMI 1640 배지, RIE1는 DMEM(Gibco)배지에 10%(v/v)혈청(heat-inactivated fetal bovine serum (Gibco BRL))과 1% 항생제[penicillin-streptomycin,(GibcoBRL)]를 넣어 5% CO2가 든 37℃ humidified incubator에서 키웠다.
데이터처리
- 마지막으로 10㎎/㎖ propidium iodide(PI)로 염색한 다음, 암상태로 보관하였다. DNA양을 FACStar flow cytometer(BectonDickinson, SanJose, CA)와 ModFit LT V2.0 software를 이용하여 분석하였다.
- Values with different superscripts were significantly different at the p<0.05 level versus saline-treated control by t-test.
- 실험결과에 대한 모든 분석은 Win PC-SPSS (VER.8.5) 프로그램으로 실시하였고,기술통계학적 분석은 각 group의 측정값을 Mean(평균) ± S.E(표준오차)로 요약하였으며, student t-test method로 분석하여 0.05 level에서 유의성을 인정하였다.
이론/모형
- AGS or RIE1 cells were treated with 5~100㎍/㎖ the APL extract for 72 hours. And cell viability was measured by the MTS assay. Data are shown as the mean of three independent experiments(error bars were shown in mean ± standard deviation(SD)).
성능/효과
- 1. 선학초 추출물에 의한 인간 위암 세포주인 AGS에서의 항암효과가 세포 사멸 기전에 의한 것임을 확인하였다.
- 2. 선학초 추출물이 정상 장세포주인 RIE1에서는 세포사멸을 일으키지 않았다.
- 3. 선학초 추출물은 암유발 C57BL/6J 마우스에서 대조군에 비하여 암 부피와 무게를 유의성 있게 감소시켰다(p<0.05).
- 4.선학초 추출물의 암유발 C57BL/6J 마우스에서의 암 부피와 무게 감소 기전은 밝히지 못하였다.
- APL 추출물을 25, 50㎍ / ㎖ 농도로 AGS 위암 세포주에 0~48시간 동안 처리한 후, DNA contents를 분석한 결과, 시간과 농도에 의존적으로 apoptotic sub-G1 fraction이 증가하였다(Fig.2).
- APL 추출물을 50 ㎍/㎖로 처리하고 다양한 시간대별로(24, 48, 72 시간) sample을 획득하여 SDS-PAGE 후, Western blotting을 수행한 결과, procaspase-3의 cleavage와 caspase-3 activation이 일어나며, caspase-3의 기질인 poly(ADP-ribose) polymerase(PARP)가 degradation되었다. PARP cleavage는 24시간째부터 일어나지만, 72시간 째 가장 두드러지게 나타났다(Fig.
- APL 추출물을 농도별로 72시간 동안 AGS 세포주에 처리하였을 때, 괄목할 만큼 cell proliferation이 감소함을 확인하였다. IC50농도는 약 30㎍/㎖ 인 것으로 나타났다(Fig.
- 떼어낸 암조직의 일부를 Western blot을 수행하여 세포 사멸 과정에 관련하는 marker들을 확인하였다. APL을 처리한 군뿐만이 아니라 그룹-1(control)에서도 역시 세포 사멸에 관련된 caspase cascade가 활성화됨을 확인하였다(Fig. 9).
- Bcl-2와 Bcl-XL와 같은 anti-apoptotic members는 시간 의존적으로 서서히 감소하였고, pro-apoptotic members인 Bax의 발현은 시간 의존적으로 두드러지게 증가하였다(Fig. 5).
- 그 결과 APL추출물은 caspase-3 의존적으로 세포사멸과정을 유발한다는 것을 밝혔으며, caspase-8과 caspase-9 또한 활성화되는 것을 확인하였다(Fig. 3A). 또한 caspase 활성 억제제인 z-VAD-fmk 를 처리하였을 때, 세포사멸과정이 완벽하게 저해되었는데(Fig.
- 이에 APL 추출물을 AGS 세포에 처리하여 미토콘드리아를 경유하는 세포사멸과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 Bcl-2 family protein의 level변화를 확인하였다. 그 결과, pro-apoptotic members인 Bax 단백질은 눈에 띄게 시간 의존적으로 증가하였고, 반면에 Bcl-2와 Bcl-xL와 같은 anti-apoptotic members의 발현은 감소하였다(Fig. 5). 따라서 APL추출물에 의한 세포사멸과정은 미토콘드리아를 경유한다는 것이 확실해졌다.
- 3B). 그리고 AGS cells에 z-VAD-fmk(a pan caspases inhibitor)를 1시간 전처리한 후, APL추출물을 처리하였을 때, caspase cascade activation이 완벽하게 억제되었다(Fig. 4).
- 5). 따라서 APL추출물에 의한 세포사멸과정은 미토콘드리아를 경유한다는 것이 확실해졌다. 그러나 APL 추출물에 의한 세포사멸과정이 TNF나 FasL와 같은 extrinsic receptors에 의해서 유도되는지, 아니면 두 가지 경로를 모두 통하여 일어나는지에 대해서는 실험을 더 진행해야 한다16.
- 3A). 또한 APL 추출물에 의해 caspase-8과 -9가 활성화되는 것을 확인하였다(Fig. 3A). RIE1을 같은 조건으로 실험하였을 때,이러한 결과가 나타나지 않았다(Fig.
- 3A). 또한 caspase 활성 억제제인 z-VAD-fmk 를 처리하였을 때, 세포사멸과정이 완벽하게 저해되었는데(Fig.4) 이로써 APL 추출물에 의해 유도되는 세포사멸과정에서 caspase activation이 결정적으로 필요하다는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과들은 APL 추출물에 의한 세포사멸현상이 세포 외-내부사멸 경로 혹은 미토콘드리아를 경유하여 일어날 수 있음을 알 수 있었다21.
- 선학초가 마우스에게 독성을 유발하는지를 간접적으로 측정하기 위하여 APL추출물을 복강주사하는 동안의 몸무게의 변화를 측정하였다. 미묘하지만 100㎎/㎏ APL 추출물을 투약한 마우스가 대조군에 비해서 몸무게 증가율이 낮은 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6).
- 7). 뿐만 아니라, 그룹-1(control)에 비하여 APL 처리군에서 암을 접종한지 18일 후에 통계적으로 유의한 수준으로 암의 무게 역시 감소한 것을 관찰 할 수 있었다(Fig. 8).
- 뿐만 아니라, 그룹-1(control)에 비하여 APL 추출물을 처리한 군에서 암을 접종한지 18일 후에 통계적으로 유의한 수준으로 암의 무게 역시 감소한 것을 관찰 할 수 있었다(p<0.05)(Fig .8).
- 6의 결과를 보면, 미묘하지만 100 ㎎/㎏ APL을 투약한 마우스가 control에 비해서 몸무게 증가가 적게 되는 것을 확인할 수 있다. 이러한 결과로 보아 100㎎/㎏ APL추출물을 복강투여 하였을 때,약간의 독성이 있는 것으로 판단된다.
- 이러한 결과를 바탕으로 APL 추출물이 암의 성장을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 암 성장의 억제가 세포 사멸 기전에 의한 것인지를 Western Blot을 수행하여 확인하였으나, 대조군에서도 세포 사멸 기전이 활성화 되어 있는 것을 확인하였다(Fig.
- 이러한 결과를 바탕으로 APL 추출물이 암의 성장을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 암 성장의 억제가 세포 사멸 기전에 의한 것인지를 Western Blot을 수행하여 확인하였으나, 대조군에서도 세포 사멸 기전이 활성화 되어 있는 것을 확인하였다(Fig. 9). 이는 대조군의 암 크기가 너무 커서 자체 세포 사멸 기전이 활성화되었기 때문이 아닐까 사료된다.
- 이상의 연구결과로 볼 때 선학초는 인간 위암 세포주의 세포사멸 기전에만 선택적으로 작용함으로써 정상세포에 대해서는 세포독성이 없는 안정적인 항암제로써의 유의성이 확인되었다. 시험관외 실험의 경우 향후 더 구체적이고 세밀한 실험을 계획하여 진행한다면 선학초의 항암 효과에 대한 기전을 좀 더 구체적으로 밝힐 수 있을 것이라 사료된다.
후속연구
- 이는 대조군의 암 크기가 너무 커서 자체 세포 사멸 기전이 활성화되었기 때문이 아닐까 사료된다. APL의 추출물이 in vivo에서의 암 성장 억제에 관한 기전은 본 연구에서 적은 샘플 수로 시행한 점, 정확한 기전을 밝히지 못한 점을 고려할 때 향후 좀 더 많은 연구가 필요할 것으로 판단된다.
- 이상의 연구결과로 볼 때 선학초는 인간 위암 세포주의 세포사멸 기전에만 선택적으로 작용함으로써 정상세포에 대해서는 세포독성이 없는 안정적인 항암제로써의 유의성이 확인되었다. 시험관외 실험의 경우 향후 더 구체적이고 세밀한 실험을 계획하여 진행한다면 선학초의 항암 효과에 대한 기전을 좀 더 구체적으로 밝힐 수 있을 것이라 사료된다.
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