[논문]식물병원균에 대한 짚신나물 (선학초) 추출물의 항균활성과 Agrimol B의 동정

전성봉; 양바롬; 최춘환; 김익수; 박경석

식물병원균에 대한 짚신나물 (선학초) 추출물의 항균활성과 Agrimol B의 동정
Antibacterial Activities against Plant Pathogens and Identification of Agrimol B from Agrimonia pilosa LEDEB 원문보기

농약과학회지 = The Korean journal of pesticide science, v.10 no.3, 2006년, pp.230 - 236

전성봉 (민족사관고등학교) , 양바롬 (민족사관고등학교) , 최춘환 (중부대학교 산학협력단 생명과학분석센터) , 김익수 (중부대학교 산학협력단 생명과학분석센터) , 박경석 (농촌진흥청 농업과학기술원 식물병리과 생물제어연구실)

초록
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선학초 (전초) 메탄올 조추출물이 오이 세균성모무늬병균인 Pseudomonas syringae pv. lacrymans, 토마토 풋마름병균인 Ralstonia solanacearum 및 담배세균성들불병균인 Pseudomonas syringae pv. tabaci에 대해서 항균활성을 나타내었다. 활성성분을 silica gel column 및 HPLC로 순수분리하여 LC-Mass 분석 결과 분자량 682.7을 갖는 물질로 추정 할 수 있었으며, 선학초에서 분리된 물질중 분자량 687.2를 나타내는 Agrimol A와 B를 구별하기 위하여 $^1H-NMR$, $^{13}C-NMR$ 스팩트럼 분석 결과 항균활성성분이 Agrimol B임을 확증할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Eighty-five percent methanol extract of Agrimonia pilosa has antibacterial activity against Pseudomonas syringae pv. lacrymans (bacterial leaf spot pathogen), Ralstonia solanacearum (tomato bacterial wilt pathogen) and Pseudomonas syringae pv. tabaci (Tobacco wild fire pathogen.). The active substance was purified by silica gel column chromatography and HPLC. The molecular weight of the active compound was determined by LC-Mass as 687.2. With NMR analysis, the active substance was identified as Agrimol B.

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

주사하였다. 25℃ 온실에 정치시킨 뒤 24시간 후 잎에 나타난 괴저 등의 반응을 조사하였다.
MeOH로 추출된 활성성분의 식물에 대한 영향을 알아보기 위하여 7가지 한약재로부터 추출된 시료를 살균 증류수를 이용하여 1, 10, 100 ppm의 농도로 희석한 다음 30일간 육묘한 담배(Nicotiana tabacum Xanthi nc) 잎의 엽육사이로 100 pL씩 주사기를 이용하여 주사하였다. 25℃ 온실에 정치시킨 뒤 24시간 후 잎에 나타난 괴저 등의 반응을 조사하였다.
n-Hexane 추출물로부터 항균 활성물질을 분리하기 위하여 siHca gel G-60 컬럼 (40×3.5 cm) 크로마토그래피를 실시하여 8개의 분획으로 나누었다. 이들 분획을 식물병원균에 대한 생물 활성을 검정한 결과 Fro.
그리고 이들 분획과 분리한 화합물을 LC-Mass(Waters Alliance 2695 system, ZQ 2000) 로 분석하였다. n-Hexane분획은 1000 ppm, Agrimol B는 100 ppm으로 하여 Xterra^®MS C¹⁸ (3.5㎛ 2.1×150 mm) column을 사용하였으며, 이때 이동상의 구배조건(gradient condition)은 분당 0.2 mL로 하였으며 A액, 18% ACN(0.1% Acetic acid)와 B액 80% ACN(0.1% Aceitc acid)을 이용하여 A액 100에서 B액이 100%의 gradient 조건으로 분석 하였다. LC-Mass 조건은 ESI negative scan mode (MW:200-2000) cone voltage 60으로 하였다.
syringae pv. tabaci, R solanacearum에 대한 항균활성물질의 구명에 집중하였다.
농축된 시료의 일부를 냉동건조하여 잔여수분과 용매를 완전히 제거하여 식물병원균에 대한 항균 활성을 검정하였다. 각각의 식물병원진균에 대한 항균효과의 검정을 위하여 PDA 배양기(87.5×15 mm)위에 500 ppm으로 조절된 7종의 시료추출액을 각각 100 μL씩 흡착시킨 페이퍼디스크 (8 mm, Toyo filter Co.)와 각각의 식물병원 진균 절편(5 mm)을 대치하여 배양하고 3일 후에 형성된 저지원의 크기를 측정하여 항균 활성을 조사하였다. 식물병원세균에 대하여는 시험세균을 TSA 배지에서 48시간 배양시킨 후 세균현탁액을 TSA 배지(87.
, 2005). 그러나 식물병원균에 대한 선학초 추출물 및 분리물질의 항균활성은 아직 보고된 바 없으므로 본 연구에서는 7종의 공시 식물로부터 얻은 추출물의 식물병원균에 대한 항균활성을 검정하고 식물세균 병원균에 가장 좋은 효과를 나타내는 선학초(Agrimonia pilosa)로부터 항균활성물질을 분리하여 동정하였다.
2의 주된 화합물인 Agrimol B(34 mg)를 얻었다. 그리고 이들 분획과 분리한 화합물을 LC-Mass(Waters Alliance 2695 system, ZQ 2000) 로 분석하였다. n-Hexane분획은 1000 ppm, Agrimol B는 100 ppm으로 하여 Xterra^®MS C¹⁸ (3.
농축하였다. 농축된 시료를 SHica gel G60(particle size : 60-240 pm) 컬럼 (40x3.5 cm) 에서 n-hexane:ethyl acetoacetate(9:l)을 이동상(mobile phase)으로 하여 8개의 분획을 얻었다. 이중 식물병원세균에 대한 항균활성이 가장 큰 분획은 Frc.
N-5)를 이용하여 농축하였다. 농축된 시료의 일부를 냉동건조하여 잔여수분과 용매를 완전히 제거하여 식물병원균에 대한 항균 활성을 검정하였다. 각각의 식물병원진균에 대한 항균효과의 검정을 위하여 PDA 배양기(87.
NMR 분석

분리된 Agrimol B의 구조를 명확히 하기 위해 핵자기 공명기를 이용하여 ¹H-NMR, ¹³C-NMR를 이용하여 측정하였다. 분석기기는 Bruker Co 의 400 NMR spectrometei를 이용하였다.
lachrymans, Ralstonia solanacearum 등 3종의 식물세균병원균 및 Escherichia coli HB101 을 공시하였다. 식물병원 곰팡이 균은 PDA 배지에서 4℃로 보존되었으며 PDA가 분주된 페트리디쉬(87.5 mmxl5 mm)에 접종하여 28℃ 인큐베이터에서 1주간 배양하여 내경 5 mm크기의 디스크로 만들어 배지에 접종하였다. 세균의 경우에는 Gylcerol-PDB에 각각의 세균을 희석한 다음 -80℃의 초저온조에 보존하여 시험에 사용하였다.
)와 각각의 식물병원 진균 절편(5 mm)을 대치하여 배양하고 3일 후에 형성된 저지원의 크기를 측정하여 항균 활성을 조사하였다. 식물병원세균에 대하여는 시험세균을 TSA 배지에서 48시간 배양시킨 후 세균현탁액을 TSA 배지(87.5Q5 mm)위에 접종용 loop(10 μL)로 문질러 접종한 다음 500ppm 추출액 100 μL가 흡착된 페이퍼디스크(8 mm, Toyo filter Co.) 각각을 올려서 28℃로 3일간 배양 후 형성된 저지원의 크기를 평가하였다.
신이 등 각각의 건조시료 5 kg을 잘게 부수어 85%(v/v) MeOH에 침적 후 상온에서 12시간동안 침적하는 방법으로 3회 반복하였으며 Celite filter를 통과시켜 여과액을 rotary vacuum evaporator(Eyela Co. N-5)를 이용하여 농축하였다. 농축된 시료의 일부를 냉동건조하여 잔여수분과 용매를 완전히 제거하여 식물병원균에 대한 항균 활성을 검정하였다.

대상 데이터

tabaci, Pseudomonas syringae pv. lachrymans, Ralstonia solanacearum 등 3종의 식물세균병원균 및 Escherichia coli HB101 을 공시하였다. 식물병원 곰팡이 균은 PDA 배지에서 4℃로 보존되었으며 PDA가 분주된 페트리디쉬(87.
분석기기는 Bruker Co 의 400 NMR spectrometei를 이용하였다.
세균의 경우에는 Gylcerol-PDB에 각각의 세균을 희석한 다음 -80℃의 초저온조에 보존하여 시험에 사용하였다. 식물병원 미생물은 농과원 식물병리과에서 분양 받아 수행하였다.
한약재 중 인체 내에서 항균 작용을 하면서도 식물병원균에 대해 항균효과가 실험되지 않은 7가지 한약재 시료들을 동의보감 등의 자료를 검색하여 신이(Magnolia kobus), 애기똥풀(Chelidonium majus var. asiaticum), 선학초(Agrimonia pilosa), 씀바귀(Ixeris dentate), 유피 (Ulmus darvidiana for. suberosa), 유근피(Ulmus darvidiana for. suberosd), 탱자(Poncirus trijbliata)을 경동시장에서 구입하여 시험에 사용하였다.

성능/효과

두 화합물은 동일한 구조를 가지고 있으나, 측쇄의 일부분이 dimethyl ketone으로 연결되어 있는 Agrimol A와 ethyl ketane으로 연결되어 있는 Agrimol B로 구별된다. 화합물 A를 'H-NMR과 "c-NMR의 기기분석을 통하여 얻은 데이터를 분석한 결과, 6개의 메틸기를 나타내는 chemical shift가 나타났다. 이것으로 화합물 A 는 7개의 메틸기를 가진 Agrimol A보다는 6개의 메틸기를 가진 Agrimol B로 추정되었으며, 2차원 NMR로 구조를 분석한 결과, 화합물 A를 Agrimol B로 동정하였다.
또한 Frc. 2를 HPLC-MS로 분자량을 측정한 결과, 적어도 3 종류의 화합물이 들어 있음을 추정할 수 있었다(그림 3).
Frc. 2를 칼럼크로마토그래피로 분리 정제하여 화합물 A를 얻었고, HHC-MS로 분자량을 측정한 결과, 682.7의 분자량을 나타냈다. 문헌조사를 통하여 선학초에서 분리된 화합물들을 조사한 결과, 682.
HPLC-MS로 Frc. 2의 물질 패턴을 분석한 결과, RT 56.99분과 RT 57.83분에서 피크가 나타났다(그림 2).
5 kg의 선학초 시료(건물중)로부터 85% methanol 추출을 통하여 574.85 g의 고형분을 얻었으며, 그 중 200 g으로부터 항균활성성분을 분리한 결과 n-hexane 층은 12.32 g으로 공시 식물체의 6.16%이었으며 ethyl acetate 추출물은 44.97 g으로 식물체 총량의 22.49%를 얻었다(표 3)
lacrymans, 토마토 풋마름병균인 Ralstonia solanacearum 및 담배세균성들불병균인 Pseudomonas sysringae pv. fczfoaci에 대해서 항균활성을 갖는 것으로 밝혀졌으며 아직 동정되지 않은 다른 성분이 존재함을 확인 할 수 있었다.
화합물 A를 'H-NMR과 "c-NMR의 기기분석을 통하여 얻은 데이터를 분석한 결과, 6개의 메틸기를 나타내는 chemical shift가 나타났다. 이것으로 화합물 A 는 7개의 메틸기를 가진 Agrimol A보다는 6개의 메틸기를 가진 Agrimol B로 추정되었으며, 2차원 NMR로 구조를 분석한 결과, 화합물 A를 Agrimol B로 동정하였다. Agrimol B의 구조와 NMR 데이터는 그림 4와 같다.
표 4에서와 같이 식물세균병에 대한 항균활성은 85% MeOH과 EtoAc 추출물보다 n-Hexane 층에서 좋은 활성을 나타냄을 알 수 있었다. 특히 오이 세균성모무늬병균인 Pseudomonas syringae pv.

후속연구

선학초에서 추출된 Agrimol B는 식물병원세균에 대한 활성이 비교적 낮은 편이어서 실용화의 가능성을 낮아 보이나 선학초는 산야초로서 우리 주변에 널리 존재하며 또한 재배를 통하여 대량으로 수확할 수 있으므로 연작지 토양에서의 식물병원균의 제거를 위한 대체 작물로서 혹은 선학초 퇴비의 활용 등의 농가 실용화 방인을 고려 할 수 있을 것으로 생각된다. 향후 선학초의 성분들의 활용을 위하여는 항균활성 뿐 아니라 유도저항성 등 다양한 기작의 검정을 통하여 발전될 것으로 생각된다.

참고문헌 (10)

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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