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문제 정의
- 본 실험은 바이러스성 간염에서 사용되는 인진청간탕과 인진사령산이 NASH의 모델중 MCD-diet로 유발된 경우에서 간기능,지방간정도,간섬유화에 미치는 영향을 살펴보고자 하였다.
- 본 연구에서는 급만성간질환에 효과적인 것으로 보고되고 있는 인진청간탕과 인진사령산이 지방대사의 장애로 인한 지방간염에도 쓰일 수 있을 것이라 판단되어 MCD-diet로 유발시킨 NASH 병태모델에 인진청간탕과 인진사령산이 미치는 영향을 살펴보았다. 체중측정, 간중량측정, 간기능검사를 하고, 병리조직학적 변화를 관찰하고, Real-Time PCR로 간섬유화 관련 유전자의 발현정도를 관찰하여 유의한 결과를 얻어 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 급만성간질환에 효과적인 것으로 보고되고 있는 인진청간탕과 인진사령산이 지방대사의 장애로 인한 지방간염에도 쓰일 수 있을 것이라 판단되어 MCD-diet로 유발시킨 NASH 병태모델에 인진청간탕과 인진사령산이 미치는 영향을 살펴보았다. 체중측정, 간중량측정, 간기능검사를 하고, 병리조직학적 변화를 관찰하고, Real-Time PCR로 간섬유화 관련 유전자의 발현정도를 관찰하여 유의한 결과를 얻어 보고하는 바이다.
제안 방법
- 1.5㎖ 시험관에 2.4㎕의 25mM MgCl2,2㎕의 Lightcycler fast start enzyme이 포함된 DNA masterSYBR greenI,10p㏖의 sense와 antisense 시발체,증류수를 포함하여 18㎕로 최종용량을 조정하였다. 18㎕의 혼합물에 2㎕의 cDNA를 혼합하여 모세관(capillarytube)에 분주한 다음 뚜껑을 닫고 700g,5초간 원침한 다음 Lightcycler증폭기(AppliedScience,Mannheim,Germany)에 장착하였다.
- 5주간 MCD-diet 및 약재투여 후 mouse를 에테르 마취하에 채혈 및 방혈치사시킨 다음 간장을 적출하여 간의 중량을 측정하였다.
- 5주간 MCD-diet및 약재투여 후 mouse를 에테르 마취하에 채혈 및 방혈치사시킨 다음 간장을 적출하여 10% 중성포르말린 용액에 고정한 후 파라핀 포매 후 로타리 마이크로톰으로 4㎛ 두께로 조직절편을 제작한 다음 H-E 염색 및 Masson-Trichrome 염색을 시행하여 광학현미경으로 관찰하였고, I-Solution(iMTechnology, Vancouver, Canada) program을 이용하여 지방축적으로 인한 간조직의 공포의 면적비율 및 Collagen축적 영역의 면적비율을 측정하였다.
- 5주간의 약재투여 후 2일 후 동물을 희생하고 혈액을 채취하여 생화학검사(Beckman Coulter, LX-20)를 시행하였다.검사항목으로는 AST, ALT, TotalBilirubin, Alkaline Phosphatase를 측정하였다.
- 5주의 실험기간동안 실험동물의 체중을 주 1회씩 측정하였다.
- RNeasyMiniKit(Qiagen,TX,USA)를 사용하여 RNA를 분리하였다.
- Reverse Transcription System(Promega, WI, USA)을 이용하여 cDNA를 합성하였다.
- 검사항목으로는 AST, ALT, TotalBilirubin, Alkaline Phosphatase를 측정하였다.
- 실험동물들을 정상군(Normaldietwithoutany treatment), 대조군(MCD-dietonly), 인진청간탕군(MCD-diet+인진청간탕 1g/kg), 인진사령산군(MCD-diet+인진사령산 1g/kg)의 4군으로 나누고 군 당 10마리씩 배치하였다. 검액은 매일 오전 10시경 1회 주 6회씩 5주간 경구 투여하였다. 또한 정상군 및 대조군에는 생리식염수를 동량으로 5주간 경구투여 하였다.
- Annealing온도는 55℃로서 PCR 생성물의 크기에 따라서 25bp/sec로 하여 real-timePCR을 시행하였다.그런 다음 각 유전자의 발현정도를 GAPDH 와의 상대적인 수치로 계산하였다.
- 검액은 매일 오전 10시경 1회 주 6회씩 5주간 경구 투여하였다. 또한 정상군 및 대조군에는 생리식염수를 동량으로 5주간 경구투여 하였다.
- 실험동물들을 정상군(Normaldietwithoutany treatment), 대조군(MCD-dietonly), 인진청간탕군(MCD-diet+인진청간탕 1g/kg), 인진사령산군(MCD-diet+인진사령산 1g/kg)의 4군으로 나누고 군 당 10마리씩 배치하였다. 검액은 매일 오전 10시경 1회 주 6회씩 5주간 경구 투여하였다.
- 혈청검사로부터 각종 감염이 인정되지 않고, 일반증상과 체중감소가 없는 20g 내외의 A/J Slc mouse 암컷(중앙동물실험)을 실험에 사용하였다. 실험동물은 멸균한 polycarbonate cage에 방사선 멸균한 시판 고형사료(대한실험동물센터)와 MCD-diet(Methionine Choline Deficient diet) 및 정제한 물을 자유 공급하였으며 1주 동안 normal diet를 섭취하면서 실험실 환경에 적응시킨 후 본 실험을 시작하였다. 실험기간동안 명암주기 12시간 간격, 온도 25±2℃, 습도 55%로 실험실 환경을 유지하였다.
- 인진청간탕 153g 및 인진사령산 110g을 환류추출기(Duksan,Korea)에 넣고, 냉각기를 부착한 상태에서 증류수를 1000㎖를 가하여 2시간씩 2회 가열 추출하였다. 추출액을 filterpaper로 여과 후, Rotaryevaporator(Buchi社RE121,SWISS)로 감압농축하여 농축액을 얻었다.
- 인진청간탕과 인진사령산이 A/Jmice에 MCD-diet로 유발시킨 NASH 병태모델에 미치는 효능을 관찰하기 위하여,체중변화,간중량변화,간기능 검사,병리조직학적 검사(Hematoxylin & Eosin 염색,Masson-Trichrome염색)및 간섬유화와 연관된 유전자 검사를 Real-TimePCR를 시행한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 즉,MgCl2(25mM) 4㎕, 10X RT buffer2㎕, dNTP(10mM)2㎕,Random primer1㎕(0.5㎍), RecombinantRnasinRibonucleaseInhibitor0.5㎕, AMVRT0.6㎕(15u),targetRNA1㎍을 넣고 나머지는 DEPC water를 첨가하여 총 용량이 20.1㎕가 되게 하여 25℃ 10분,42℃ 1시간,95℃ 5분 동안 처리하여 cDNA를 제작하고 5℃에서 차게 해서 -20℃에 보관하였으며 필요할 때마다 사용하였다.
- 즉,동물을 희생한 후 간조직을 적당량 취하여 RNAlatersolution(Qiagen,TX,USA)에 넣었다가 24시간 이상 지난 다음에 간조직을 70-80㎎ 내외로 채취하여 50㎖ tube에 넣고 BME-RLT buffer(Qiagen, TX,USA)1㎖을 가한 후 TissueMiser(Fisher Scientific,CA,USA)를 이용하여 homogenize한 후 얼음 위에서 10분간 방치하여 상층액을 얻고 이것을 QiagenShreddercolumn(Qiagen,TX,USA)에 통과시켜 잡질을 제거하였다. 그런 다음 Qiagen RNeasyMiniKit를 이용하여 제작사의 protocol에 따라 RNA를 분리하였다.
대상 데이터
- Housekeepinggene으로는 GAPDH를 사용하였고,targetgene으로는 ProcollagenTypeIa1,ASMA, TGFβ1,MMP 2,TIMP1,TIMP2,PDGFRβ의 gene을 사용하였으며 각 primer의 sequence는 다음과 같다.
- 본 실험에 사용한 약재는 대한약전외 한약(생약)규격집 주해서11에 근거하여 경희대 부속 한방병원에서 구입하여 엄선한 것을 사용하였으며 1첩 당 내용 및 용량은 Table1, Table2와 같다.
- 혈청검사로부터 각종 감염이 인정되지 않고, 일반증상과 체중감소가 없는 20g 내외의 A/J Slc mouse 암컷(중앙동물실험)을 실험에 사용하였다. 실험동물은 멸균한 polycarbonate cage에 방사선 멸균한 시판 고형사료(대한실험동물센터)와 MCD-diet(Methionine Choline Deficient diet) 및 정제한 물을 자유 공급하였으며 1주 동안 normal diet를 섭취하면서 실험실 환경에 적응시킨 후 본 실험을 시작하였다.
데이터처리
- 0.K를 사용하여 one-way ANOVA(일원배치분산분석)를 하였고,사후검정으로는 Scheffe검정을 사용하였으며,유의수준 0.05 이하를 유효한 것으로 인정하였다.
성능/효과
- 1.MCD-diet는 mouse의 체중을 유의성 있게 감소시켰으며,인진청간탕이나 인진사령산에서는 대조군에 비해 체중감소가 심하지 않았으나 유의성은 인정되지 않았다
- 2.MCD-diet는 mouse의 간장 중량을 유의성 있게 감소시켰지만, 대조군과 인진청간탕군 및 인진사령산군간의 변화에서 유의성은 인정되지 않았다.
- 3.인진청간탕은 MCD-diet로 인한 ALP와 ALT의 상승을 억제하였고,인진사령산은 totalbilirubin, AST,ALT의 상승을 억제하였으나 유의성은 인정되지 않았다.
- 4.인진청간탕과 인진사령산은 MCD-diet로 유발된 간조직의 지방축적과 섬유화 진행을 유의성 있게 억제하였다.
- 5.인진청간탕과 인진사령산은 MCD-diet로 증가된 CollagentypeIa1,PDGFBR1,MMP2유전자의 발현을 억제하였고,감소된 ASMA,TGFb1, TIMP I유전자의 발현을 증가시켰다.TIMP II유전자는 MCD-diet군에서 발현이 저하되었고 인진청간탕과 인진사령산의 투여로 더욱 저하되었다.
- Collagen침착은 정상군에서는 혈관구조물에 정상적으로 분포하는 것 외에는 관찰되지 않았으나 대조군에서는 많은 Collagen이 관찰되어 섬유화가 심하게 진행되었음을 알 수 있었고,YJCGT군과 YJSRS군에서는 대조군에 비하여 섬유화가 억제되었다(Masson-Trichrome염색)(Fig.6).
- MCD-diet는 CollagentypeIa1(COLL1),PDGFBR1, MMP2유전자의 발현을 증가시켰고,ASMA,TGFb1, TIMP I,TIMP II유전자의 발현을 감소시켰다. YJCGT군과 YJSRS군에서는 대조군에서 상승된 COLL1,PDGFBR1,MMP2유전자의 발현이 억제되었고,대조군에서 저하된 ASMA,TGFb1,TIMPI유전자의 발현은 증가되었다.
- MCD-diet로 유발되는 병태모델에서는 Fat로 유발시킨 병태모델과 다르게 체중감소가 나타는데, 정상군보다 실험군에서 유의성 있게 체중이 감소하였으나,인진청간탕군과 인진사령산군은 대조군보다는 체중이 덜 감소하였으나 유의성은 없었다.
- MCD-diet는 CollagentypeIa1(COLL1),PDGFBR1, MMP2유전자의 발현을 증가시켰고,ASMA,TGFb1, TIMP I,TIMP II유전자의 발현을 감소시켰다. YJCGT군과 YJSRS군에서는 대조군에서 상승된 COLL1,PDGFBR1,MMP2유전자의 발현이 억제되었고,대조군에서 저하된 ASMA,TGFb1,TIMPI유전자의 발현은 증가되었다.다만 대조군에서 저하된 TIMP II 유전자의 발현은 YJCGT군과 YJSRS군에서 더욱 저하되었다(Table 9, Fig.
- 간기능검사에서 MCD-diet를 섭취한 대조군에서는 ALP와 ALT가 유의성있게 상승하였고 total bilirubin,AST는 상승하였다.인진청간탕을 사용한 경우 ALP와 ALT의 상승을 억제하였고 total bilirubin과 AST는 대조군보다 상승하였고,인진사령산에서는 totalbilirubin,AST,ALT의 상승을 억제하였고 ALP는 대조군보다 상승하였다.
- 간섬유화와 연관된 유전자를 RT-PCR을 통하여 살펴보았는데,MCD-diet를 시행한 대조군에서는 콜라겐 합성이 증가될 때 발현이 증가되는 Collagen typeIa1,PDGFBR1,MMP2유전자가 증가하였고,MMP 합성을 억제하는 TIMP I,II 유전자의 발현은 억제하였다.그러나 간성상세포가 활성화될 때 증가되는 ASMA의 발현은 감소하였고 fibrogenesis때 증가되는 TGFβ1을 정상군보다 도리어 억제되었다.
- 간장 중량에서는 대조군과 인진청간탕군에서는 유의성있게 감소하였지만(p<0.05),이것을 다시 각 동물 체중 평균으로 나누어서 비교해 보았을 때에는 간장의 중량이 체중 대비 각 실험군 모두에서 증가된 것으로 나타났으며 대조군과 실험군간의 유의성은 인정되지 않았다.
- 간장 중량이 control군과 YJCGT군에서는 유의성 있게 감소하였지만(p<0.05), 이것을 다시 각 동물 체중 평균으로 나누어서 비교해 보았을 때에는 간장의 중량이 체중 대비 각 실험군 모두에서 증가된 것으로 나타났다(Fig. 2).
- 그러나 간성상세포가 활성화될 때 증가되는 ASMA의 발현은 감소하였고 fibrogenesis때 증가되는 TGFβ1을 정상군보다 도리어 억제되었다.
- 이러한 점은 MCD-diet로 유발되는 간섬유화는 인간 성상세포 활성에서 섬유화가 진행하는 양상과 정확하게 일치하지는 않다는 점을 시사한다.다만 섬유화 진행에서 변화되는 CollagentypeIa1,MMP2,PDFG 증가와 TIMP I,II감소는 동일한 양상으로 나타났다.
- 인진청간 탕과 인진사령산 모두 ALT 상승을 억제하여 간보호 작용을 하는 것으로 나타났다.다만 인진청간탕에서 담즙정체를 반영하는 ALP를 억제하였지만 totalbilirubin은 도리어 증가하였고,인진사령산은 totalbilirubin은 억제하였지만 ALP는 도리어 상승하였다.따라서 인진청간탕과 인진사령산은 빌리루빈 배출과정과 빌리루빈 생성과정에 미치는 영향을 다른 것으로 사려된다.
- 이상에서 인진청간탕과 인진사령산은 MCD-diet로 유발된 NASH 동물모델에서 간기능회복, 지방축적 및 섬유화 억제에 효과가 있음이 확인되었다. 따라서 인진청간탕과 인진사령산의 장기간 투여는 간세포 보호 및 지방과 콜라겐 침착 억제를 통한 NASH치료에 효과적일 것으로 사료되며, 추후 다양한 병태모델을 통한 효능검증과 치료기전에 관한 심도있는 연구가 필요하리라 사료된다.
- 이상에서 인진청간탕과 인진사령산은 MCD-diet로 유발시킨 NASH 병태모델에서 간세포 보호작용과 지방축적억제,간섬유화 억제작용을 하였으며,간섬유화 억제작용은 간섬유화시 증가되는 Collagen typeIa1,MMP2,PDGFBR1유전자의 발현을 억제하고,TIMP I및 TIMP II유전자의 발현을 증가시키면서 이루어지는 것으로 판단되었다.
- 하지만 현재까지 NASH 병태모델로서 MCD-diet유발 동물모델이 학계에서 인정되고 있으며 관련된 논문들이 발표되고 있는 것은 병태가 완전히 일치하는 것은 아니지만 연구목적으로 인정받고 있음을 의미하는 것이라 할 수 있다.이에 본 연구의 결과를 바탕으로 고려할 때,인진청간탕이나 인진사령산의 투여는 염증으로부터 간세포를 보호할 뿐 아니라 NASH에서 지방축적을 감소시키고 섬유화 진행을 억제하는 효과를 발휘할 수 있을 것으로 생각되었다.부족하나마 이번 연구의 결과는 NASH 병태 모델을 이용한 한약처방의 치료효과를 검증하는 초기의 시도라 할 수 있으며,보다 효과적이고 임상에 적용하기 용이한 처방을 구성하기 위하여서는 다양한 약재의 검증 및 처방 구성을 위한 노력이 지속되어야 할 것으로 사료된다.
- 인진청간탕을 사용한 경우 ALP와 ALT의 상승을 억제하였고 total bilirubin과 AST는 대조군보다 상승하였고,인진사령산에서는 totalbilirubin,AST,ALT의 상승을 억제하였고 ALP는 대조군보다 상승하였다.인진청간 탕과 인진사령산 모두 ALT 상승을 억제하여 간보호 작용을 하는 것으로 나타났다.다만 인진청간탕에서 담즙정체를 반영하는 ALP를 억제하였지만 totalbilirubin은 도리어 증가하였고,인진사령산은 totalbilirubin은 억제하였지만 ALP는 도리어 상승하였다.
- 인진청간탕과 인진사령산을 투여한 결과 Collagen typeIa1,MMP2,PDGFBR1유전자의 발현은 대조군에 비하여 억제되었고,TIMP I및 TIMP II유전자의 발현은 상승시키는 것으로 나타났다.
- 인진청간탕은 MCD-diet로 유발된 ALP, ALT의 상승을 대조군에 비하여 유의하게 억제하였으며, 인진사령산은 AST의 상승을 억제하였으나 유의성은 인정되지 않았다(Table 6, Fig. 3).
- 간기능검사에서 MCD-diet를 섭취한 대조군에서는 ALP와 ALT가 유의성있게 상승하였고 total bilirubin,AST는 상승하였다.인진청간탕을 사용한 경우 ALP와 ALT의 상승을 억제하였고 total bilirubin과 AST는 대조군보다 상승하였고,인진사령산에서는 totalbilirubin,AST,ALT의 상승을 억제하였고 ALP는 대조군보다 상승하였다.인진청간 탕과 인진사령산 모두 ALT 상승을 억제하여 간보호 작용을 하는 것으로 나타났다.
- 정상군에 비해 실험군들의 콜라겐 침착은 유의성 있게 증가하였고(p<0.01), 콜라겐의 침착은 YJCGT군과 YJSRS군에서 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다(YJCGT군은 p<0.05,YJSRS군은 p<0.01)(Table8,Fig.7).
- 정상군에서는 체중변화가 없었고, 대조군, YJCGT군 및 YJSRS군 모두에서 유의성 있게 체중이 감소하였다. YJCGT군과 YJSRS군에서는 대조군에 비하여 적게 감소되었지만 유의성은 인정되지 않았다(Table 5, Fig.
후속연구
- 이상에서 인진청간탕과 인진사령산은 MCD-diet로 유발된 NASH 동물모델에서 간기능회복, 지방축적 및 섬유화 억제에 효과가 있음이 확인되었다. 따라서 인진청간탕과 인진사령산의 장기간 투여는 간세포 보호 및 지방과 콜라겐 침착 억제를 통한 NASH치료에 효과적일 것으로 사료되며, 추후 다양한 병태모델을 통한 효능검증과 치료기전에 관한 심도있는 연구가 필요하리라 사료된다.
- 이에 본 연구의 결과를 바탕으로 고려할 때,인진청간탕이나 인진사령산의 투여는 염증으로부터 간세포를 보호할 뿐 아니라 NASH에서 지방축적을 감소시키고 섬유화 진행을 억제하는 효과를 발휘할 수 있을 것으로 생각되었다.부족하나마 이번 연구의 결과는 NASH 병태 모델을 이용한 한약처방의 치료효과를 검증하는 초기의 시도라 할 수 있으며,보다 효과적이고 임상에 적용하기 용이한 처방을 구성하기 위하여서는 다양한 약재의 검증 및 처방 구성을 위한 노력이 지속되어야 할 것으로 사료된다.
- 따라서 인진청간탕과 인진사령산은 빌리루빈 배출과정과 빌리루빈 생성과정에 미치는 영향을 다른 것으로 사려된다.향후 이에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 보인다.
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