로즈마리(Rosmarinus offcinalis L.) 분획물의 암세포에 대한 성장억제 및 세포사멸 유도 효과 Effect of Rosmarinus officinalis L. on Growth Inhibition and Apoptosis Induction in Cancer Cells원문보기
최근 다방면에서 효능이 알려지고 있는 로즈마리를 이용하여 apoptosis 유도기전을 해석하기 위하여 인간유래 자궁암 Hela 세포주를 대상으로 조사한 결과는 다음과 같다. 로즈마리 분획물 중 hexane층과 chloroform층의 처리 농도 의존적으로 Hela 자궁암세포의 저해활성은 현저하게 감소되었으며 이는 apoptosis 유도와 연관성이 있었다. 로즈마리 분획물 중 hexane층과 chloroform층의 처리에 의하여 apoptosis 억제에 관여하는 Bcl-2 단백질의 발현은 감소되었으며, apoptosis 유도에 관여하는 Bax 유전자의 발현은 농도 의존적으로 증가되었다. 로즈마리 분획물 중 hexane층과 chloroform층의 처리에 의한 apoptosis 유도는 caspase-3, 7, 9 및 PARP의 활성화와 연관성이 있었다.
최근 다방면에서 효능이 알려지고 있는 로즈마리를 이용하여 apoptosis 유도기전을 해석하기 위하여 인간유래 자궁암 Hela 세포주를 대상으로 조사한 결과는 다음과 같다. 로즈마리 분획물 중 hexane층과 chloroform층의 처리 농도 의존적으로 Hela 자궁암세포의 저해활성은 현저하게 감소되었으며 이는 apoptosis 유도와 연관성이 있었다. 로즈마리 분획물 중 hexane층과 chloroform층의 처리에 의하여 apoptosis 억제에 관여하는 Bcl-2 단백질의 발현은 감소되었으며, apoptosis 유도에 관여하는 Bax 유전자의 발현은 농도 의존적으로 증가되었다. 로즈마리 분획물 중 hexane층과 chloroform층의 처리에 의한 apoptosis 유도는 caspase-3, 7, 9 및 PARP의 활성화와 연관성이 있었다.
The goal of this study was to evaluate the anticancer effect of Rosmarinus officinalis L. In this study induction of apoptosis by methanol extract of rosemary and their fractions were investigated in vitro. In examining the effect of rosemary methanol extract on the inhibition of growth of Hela, Hep...
The goal of this study was to evaluate the anticancer effect of Rosmarinus officinalis L. In this study induction of apoptosis by methanol extract of rosemary and their fractions were investigated in vitro. In examining the effect of rosemary methanol extract on the inhibition of growth of Hela, HepG2, A549, AGS cells and HT-29 cell, it was found that the methanol extract of rosemary and their fractions demonstrated a cytotoxic effect in a dose-dependent manner; in addition, hexane and chloroform fractions showed a particularly high cytotoxic effect on Hela and AGS cells. The results showed that the hexane and chloroform fractions of rosemary have cytotoxic effect which are related to the activity of the essential oil in the rosemary. Apoptosis in Hela and AGS cells mediated by the hexane and chloroform fractions was associated with the increase of cleaved caspase-3 levels and cleaved PARP. Therefore, with more researches on identification and action mechanism of active compound, the hexane and chloroform fractions are expected to be natural sources for the developments of functional food and medical agents to prevent gastric cancer and uterus cancer.
The goal of this study was to evaluate the anticancer effect of Rosmarinus officinalis L. In this study induction of apoptosis by methanol extract of rosemary and their fractions were investigated in vitro. In examining the effect of rosemary methanol extract on the inhibition of growth of Hela, HepG2, A549, AGS cells and HT-29 cell, it was found that the methanol extract of rosemary and their fractions demonstrated a cytotoxic effect in a dose-dependent manner; in addition, hexane and chloroform fractions showed a particularly high cytotoxic effect on Hela and AGS cells. The results showed that the hexane and chloroform fractions of rosemary have cytotoxic effect which are related to the activity of the essential oil in the rosemary. Apoptosis in Hela and AGS cells mediated by the hexane and chloroform fractions was associated with the increase of cleaved caspase-3 levels and cleaved PARP. Therefore, with more researches on identification and action mechanism of active compound, the hexane and chloroform fractions are expected to be natural sources for the developments of functional food and medical agents to prevent gastric cancer and uterus cancer.
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문제 정의
그러나 로즈마리의 추출물 및 분획물뿐만 아니라 단일성분의 세포사멸 유도 효과에 대한 연구는 거의 없는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 로즈마리의 추출물 및 분획물이 여러 가지 암세포주의 성장을 억제하는지 검색하고 세포사멸 기전을 살펴보았다.
그 이외의 ethyl acetate, butanol, water 분획물에서는 암세포주에 대한 저해 활성이 미미한 수준으로 나타났다. 이러한 결과를 통해 각각의 암세포주에서는 로즈마리의 hexane, chloroform 분획물이 뛰어난 성장 저해 효과를 나타내는 것을 알 수 있었으며 이들 분획물을 사용하여 Hela 세포주에 대한 세포사멸 유도 기전을 알아보았다.
제안 방법
본 실험에 사용된 AGS, HepG2, HT-29, Hela, A549 cell은 한국세포주은행으로부터 분양받아 사용하였다. 각각의 세포주는 RPMI(Rosewell Park Memorial Institute) 1640, DMEM(Dulbeco Minimum Essential Medium), MEM (Minimum Essential Medium)과 10% FBS와 1% antibiotic-antimycotic이 첨가된 배지에서 37 ℃의 5% CO2 배양기에서 2～3일에 한 번씩 계대 배양하였다.
단백질 전기영동: SDS-polyacrylamide gel electrophoresis를 위하여 먼저 10% running gel과 4.5% stacking gel을 제조하였다. 이때 분리한 단백질의 농도를 10 μg으로 조정하고 95 ℃에서 5분간 가열한 후 준비된 gel에 분주하여 20 mA에서 전기영동 하였다.
로즈마리 메탄올 추출물을 극성이 다른 용매인 hexane, chloroform, ethylacetate 및 butanol로 순차 분획하였으며 그 수율은 Table 1과 같다. Water 분획물과 ethylacetate 분획물은 각각 33.
배양 후 상층액을 제거하고 각 well 당 DMSO 100 μL를 가하여 10분간 교반한 후 ELISA reader(Molecular Device Co., Sunnyvale, CA, USA)로 550 nm에서 흡광도를 측정하여 성장억제효과{Growth inhibitory effect (%)＝100 －(시료처리구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100}를 구하여 암세포의 성장 저해 효과를 측정하였다.
본 실험에 사용한 시료는 대구시의 약령시장에서 건조 상태의 것을 구입하여 사용하였다. 시료는 불순물 제거를 위하여 수세한 후 건조하여 사용하였고, 무게의 10배량(w/v)의 80% 메탄올을 가하여 24시간 동안 정치하여 총 3회 반복추출하였다. 추출액은 여과지(Whatman No.
즉각 메탄올 추출물 시료 1 mg을 증류수 1 mL에 녹이고 10배 희석한 희석액 2 mL에 2배 희석한 Folin 시약2 mL을 첨가하고 잘 혼합한 후 3분간 방치한 후 10% Na2CO3 2 mL을 넣고 1시간 반응시킨 후 UV/Visible spectrophotometer(UVIKON 922, Kontron Instruments, Milan, Italy)를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. 이 때 tannic acid를 이용한 표준곡선으로부터 총 폴리페놀 함량을 구하였다.
계속하여 이차항체인 goat anti-Rabbit IgG와 2시간 반응시키고 다시 TTBS으로 3회 세척하였다. 증류수로 세척하고 membrane에 ECL detection kit의 발색시약 Ⅰ과 Ⅱ를 1:1로 섞은 후에 혼합액을 도포하고, X-ray film에 노출하여 현상한 후 film상의 band 농도를 관찰하였다. 실험에 사용한 1, 2차 항체인 Bcl-2, Bax, Goat Anti-Rabbot IgG, Goat Anti-Mouse IgG 등은 Santa Cruz사(California, USA)로부터, caspase family는 Cell Signaling Technologies(Beverly, MA, USA)사로부터 구입하였으며, 그 밖의 시약들도 특급또는 일급의 제품을 사용하였다.
대상 데이터
본 실험에 사용된 AGS, HepG2, HT-29, Hela, A549 cell은 한국세포주은행으로부터 분양받아 사용하였다. 각각의 세포주는 RPMI(Rosewell Park Memorial Institute) 1640, DMEM(Dulbeco Minimum Essential Medium), MEM (Minimum Essential Medium)과 10% FBS와 1% antibiotic-antimycotic이 첨가된 배지에서 37 ℃의 5% CO2 배양기에서 2～3일에 한 번씩 계대 배양하였다.
본 실험에 사용한 시료는 대구시의 약령시장에서 건조 상태의 것을 구입하여 사용하였다. 시료는 불순물 제거를 위하여 수세한 후 건조하여 사용하였고, 무게의 10배량(w/v)의 80% 메탄올을 가하여 24시간 동안 정치하여 총 3회 반복추출하였다.
증류수로 세척하고 membrane에 ECL detection kit의 발색시약 Ⅰ과 Ⅱ를 1:1로 섞은 후에 혼합액을 도포하고, X-ray film에 노출하여 현상한 후 film상의 band 농도를 관찰하였다. 실험에 사용한 1, 2차 항체인 Bcl-2, Bax, Goat Anti-Rabbot IgG, Goat Anti-Mouse IgG 등은 Santa Cruz사(California, USA)로부터, caspase family는 Cell Signaling Technologies(Beverly, MA, USA)사로부터 구입하였으며, 그 밖의 시약들도 특급또는 일급의 제품을 사용하였다.
데이터처리
결과들은 평균 ± 표준오차로 표시하고, 변수의 분석들은 Student t-test를 사용하였다. P값이 0.05 미만인 경우에 통계적으로 유의하다는 판정을 하였으며, 모든 실험은 독립적으로 3회 이상 실시하여 통계처리를 하였다.
결과들은 평균 ± 표준오차로 표시하고, 변수의 분석들은 Student t-test를 사용하였다.
이론/모형
Bcl-2 family에 속하는 여러 단백질들은 apoptosis에서 중요한 역할을 하는데 이들 중 Bax, Bad, Bak, Bid, Bcl-xS 등은 apoptosis를 촉진하는 역할을 하며, Bcl-2, Bcl-xL 등은 apoptosis를 억제하는 기능을 가진다고 보고되었다(16). Bcl-2 family 중 Bax와 Bcl-2의 단백질 발현을 western blot방법으로 확인하였다. 로즈마리의 hexane, chloroform 분획물을 다양한 농도로 24시간 처리한 결과 Fig.
암세포주에 대한 시료의 저해효과를 측정하기 위하여 Green 등(14)의 방법에 준하여 MTT assay를 실시하였다. 암세포주를 96 well plate에 1×104 cells/well이 되게 200 μL 분주하고 24시간 배양 후 새로운 배지로 교환하고, 시료를 일정농도로 희석하여 20 μL 첨가하여 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다.
총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(8)을 응용하여 측정하였다. 즉각 메탄올 추출물 시료 1 mg을 증류수 1 mL에 녹이고 10배 희석한 희석액 2 mL에 2배 희석한 Folin 시약2 mL을 첨가하고 잘 혼합한 후 3분간 방치한 후 10% Na2CO3 2 mL을 넣고 1시간 반응시킨 후 UV/Visible spectrophotometer(UVIKON 922, Kontron Instruments, Milan, Italy)를 사용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.
총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno 등(15)의 방법에 의해 측정하였다. 각 시료 100 μL를 80% ethanol 900 μL에 희석한 후 100 μL를 취하여 10% aluminum nitrate와 1 μM postassium acetate를 함유하는 80% ethanol 4.
성능/효과
MeOH 추출물의 경우, 가장 높은 농도인 100 μg/mL을 첨가 시 위암세포주인 AGS cell에서 95%로 가장 높은 성장저해 효과를 보였고, 다음으로 Hela, HT-29, HepG2, A549 순으로 각각 83%, 78%, 65%, 60%를 저해하는 것으로 나타났다.
로즈마리 메탄올 추출물을 극성이 다른 용매인 hexane, chloroform, ethylacetate 및 butanol로 순차 분획하였으며 그 수율은 Table 1과 같다. Water 분획물과 ethylacetate 분획물은 각각 33.5%, 10.26%로 높은 수율을 보였으며, butanol 분획물과 hexane 분획물은 17.1%, 2.5%의 수율을 나타냈다. chloroform 분획물은 0.
따라서 로즈마리 분획물이 유도하는 apoptosis 과정의 caspase의 신호전달 기전을 알아보고자 Hela cell에 로즈마리의 hexane, chloroform 분획물을 6.25, 12.5, 25, 50 μg/mL의 농도로 각각 처리하여 caspase의 활성을 측정한 결과 Fig. 4, 5와 같이 농도 의존적으로 그 활성이 증가되는 것을 알 수 있었다.
4, 5와 같이 농도 의존적으로 그 활성이 증가되는 것을 알 수 있었다. 또한 로즈마리 hexane, chloroform 분획물은 caspase-3, 7, 9를 각각 활성화시킴으로써 최종적으로 PARP를 활성화시켜 apoptosis를 유도하는 것으로 나타났다.
Bcl-2 family 중 Bax와 Bcl-2의 단백질 발현을 western blot방법으로 확인하였다. 로즈마리의 hexane, chloroform 분획물을 다양한 농도로 24시간 처리한 결과 Fig. 2, 3과 같이 apoptosis를 유도하는 Bax의 단백질 발현은 농도에 비례하여 증가한 반면 apoptosis를 억제하는 Bcl-2 단백질은 농도에 비례하여 발현이 감소하였다. 따라서 hexane, chloroform 분획물은 Bcl-2의 발현 감소와 Bax의 발현 증가를 통해 apoptosis를 촉진할 것으로 생각된다.
이들은 phenolic hydroxyl(OH)기를 갖기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 쉽게 결합하며 항산화, 항암 등의 다양한 생리활성을 가진다. 본 실험에서는 로즈마리의 MeOH 추출물 및 분획물에 존재하는 총 폴리페놀 함량과총 플라보노이드 함량을 측정한 결과(Table 3), 로즈마리의 MeOH 추출물은 172.69 mg/g으로 나타났으며, 분획물은 hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol, water fraction순으로 각각 161.41, 122.22, 489.02, 283.05, 120.92 mg/g의높은 폴리페놀 화합물을 함유하고 있었으며, 특히 ethyl acetate 분획물에서 가장 높은 폴리페놀 함량을 보였다. 플라보노이드 함량(Table 4)은 MeOH 추출물에서 21.
분획물의 가장 높은 농도인 100 μg/mL을 첨가 시 hexane 분획물에서는 Hela cell에서 93%로 가장 높은 저해 활성을 나타냈으며, chloroform층의 경우 100 μg/mL을 첨가 시, AGS cell에서 95%로 가장 높은 저해 활성을 나타냈으며, Hela cell에서도 92% 이상의 저해 활성을 나타냈다.
후속연구
이상의 결과에서 로즈마리 분획물 중 hexane과 chloroform층의 처리에 의한 암세포의 저해 활성은 apoptosis 조절에 중요한 유전자들의 선택적 발현 조절을 통한 apoptosis 유도와 밀접한 관련이 있었으며 로즈마리는 항암효과를 가진 식품소재로 개발 가능성이 있는 물질 중의 하나로서 향후 지속적인 연구가 수행되어야 할 것으로 생각된다.
하지만 각각의 암세포주에 대한 저해 효과를 확인한 결과 hexane, chloroform층에서 가장 뛰어난 효과가 나타난 것으로 보아 apoptosis 유도에 영향을 미친 성분은 폴리페놀류가아닌 로즈마리의 hexane, chloroform층에 존재하는 정유성분이나 지용성 성분인 apigenin, β-carotene, β-sitosterol, tannin 등일 것이라 생각되며, 향후 연구에서 로즈마리의 분리정제를 통한 단일물질에 대한 분석이 요구된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
로즈마리의 성분 중에서 α-Pinene는 무엇인가?
로즈마리에서 추출되는 essential oils는 조미료, 향수 및 의약품으로써 널리 이용되고 있으며 그 중에서 rosmarinic acid는 로즈마리 에서 추출한 2차대사산물의 일종으로 식품의 산패방지 또는 미생물의 활동을 억제하는 등 천연 항산화물로 이용되고 있다(8). α-Pinene은 식물계에 가장 풍부한 terpenoids로써 방충, 항균, 생체활성에 기여하는 물질로 감기, 감염 등의 바이러스성 질환과 신진대사 촉진, 혈액순환 및 지혈 등에 효능을 나타내며(9), apigenin은 염증과 산화스트레스 억제 및 탄수화물대사를 증진하는 효과를 보인다(10,11). 그리고 β-sitosterol은 뇌신경세포의 지질 속에 유리 또는 에스테르 등의 유도체로 존재하며 구조형성과 여러 대사에 관여하고 있는 것으로 생각되며, 스테로이드 호르몬계 화합물의 합성원료로 이용된다(12).
로즈마리의 주요 성분에는 무엇이 있는가?
)는 해안에서 많이 자생하고 있고, 지중해 연안이 원산인 상록관목으로 소나무 잎처럼 뾰족한 잎에 장뇌와 비슷한, 산뜻하고 강한 향이 있어 라벤더와 나란히 유럽에서는 예로부터 약, 향수에 사용되었다. 로즈마리의 주요 성분으로는 α-pinene, apigenin, β-carotene, β-sitosterol, betulinic acid, borneol, rosmanol, rosmarinic acid, 1-8 cineol, carnosol, carnosic acid, tannin, 칼슘, 철, 마그네슘, 망간, 인, 칼륨, 아연, 비타민 B 1, B 3, C 등이 있다(7). 로즈마리에서 추출되는 essential oils는 조미료, 향수 및 의약품으로써 널리 이용되고 있으며 그 중에서 rosmarinic acid는 로즈마리 에서 추출한 2차대사산물의 일종으로 식품의 산패방지 또는 미생물의 활동을 억제하는 등 천연 항산화물로 이용되고 있다(8).
로즈마리의 주요 성분 중에서 Borneol는 무엇이며 어떤 기능을 가지고 있는가?
그리고 β-sitosterol은 뇌신경세포의 지질 속에 유리 또는 에스테르 등의 유도체로 존재하며 구조형성과 여러 대사에 관여하고 있는 것으로 생각되며, 스테로이드 호르몬계 화합물의 합성원료로 이용된다(12). Borneol은 담즙을 촉진하는 물질로 일정량 섭취 시 적당량의 담즙분비를 촉진하여 체내의 콜레스테롤 수치를 낮추고 소화를 촉진하는데 기여하며, carnosol과 carnosic acid는 로즈마리 추출물의 항산화성 중 90%의 효능을 갖는 물질로 세포내의 마이크로좀과 리포좀계에서 지질의 과산화를 강력히 저해한다고 보고되고 있다(13). 이러한 기능성 성분을 함유하고 있는 로즈마리는 식품법규 65421 2000.
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