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문제 정의
- 본 연구에서는 최근 다방면으로 이용되고 있는 로즈마리를 이용하여 S. aureus 및 MRSA에 대한 항균활성과 내성 유전자 조절효과를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- TSA배지에 멸균된 glass spreader로 균을 spread한 후 8 mm paper disc를 올려놓은 다음 syringe filter(0.2 μm)로 제균 시킨 추출물을 최종농도가 0.625, 1.25, 2.5 mg/disc가 되도록 10% DMSO에 용해시킨 후 50 μL 주입하여 완전히 흡수시킨 후 37℃ incubator에서 24시간 배양시켜 paper disc 주위의 inhibition zone의 직경을 측정하였다.
- TSA배지에 멸균된 glass spreader로 균을 고르게 spread 한 후, paper disc(8 mm)를 올려놓은 다음 syringe filter(0.2 μm)로 제균 시킨 추출물을 최종농도가 1, 2.5, 5 mg/disc가 되도록 10% DMSO에 용해시킨 후 50 μL를 주입하여 완전히 흡수시킨 후 37℃ incubator에서 24시간 배양시켜 paper disc 주위의 inhibition zone의 직경을 측정하였다.
- 로즈마리 메탄올 추출물의 분획: 로즈마리 메탄올 추출물을 20배(w/v)의 증류수에 녹인 후 n-hexane, chloroform(CHCl3), ethylacetate(EtOAc) 및 butanol(BuOH)을 순차적으로 3회 반복 추출하여 Fig. 1과 같이 각각의 용매별로 계통분획하였고 남은 수용성층은 농축하여 water 분획으로 감압농축하여 동결건조로 남은 유기용매를 휘발시킨 후, -20o C에보관하면서 실험에 사용하였다.
- 로즈마리 분획물의 MIC(Minimum inhibitory concentration) 측정: 최소생육저해농도는 Kudo와 Saga(23)의 방법을 수정하여 측정하였다. 탁도 0.
- 이를 1% OsO4로 후 고정한 다음 tannic acid로 전도염색을 하였다. 이를 ethanol로 탈수한 후 isoamyl acetate로 치환과정을 거쳐 critical point dryer(Hitachi HCP-2, Tokyo, Japan)로 건조시키고 순금을 300 mm 두께로 도포한 후 주사전자현미경(Hitachi S-450, Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
- 주사전자현미경(Scanning electron microscope: SEM) 관찰: MRSA KCCM 40511에 시료를 처리하여 18시간 후의 세포벽의 변화를 주사전자현미경을 통해 관찰하였다. 각종 배양된 세포균주 배양액을 0.
- 탁도 0.8을 맞춘 균을 TSB 액체배지 10 mL에 150 μL 접종한 후 시료를 농도별로 처리하여 37℃ incubator에서 24시간 배양 후 육안으로 관찰하였을 때 미생물이 증식되지 않는 농도를 MIC로 결정하였다.
- 계속하여 이차항체인 Anti-Mouse IgG와 2시간 반응시키고 다시 TST로 3회 세척하였다. 항체와 반응한 membrane에 ECL 진단 kit의 발색시약 Ⅰ과 Ⅱ를 40:1로 섞은 혼합액을 도포하고, X-ray film에 노출하여 현상한 후 film상의 band 농도를 관찰하였다.
대상 데이터
- 균주 및 배지: 본 실험에서 사용한 균주 S. aureus는 표준균주 KCCM 40511를 한국미생물보존센터로부터, 내성균주인 MRSA는 ATCC 25923을 미국균주보존센터로부터 분양받아 각각의 균들은 tryptic soy broth(TSB, Difco, Detroit, USA)에 1백금이 접종하여 3회 계대배양 후 MRSA 확인 및 성장 최적 조건에서 사용하였으며, 생균수 측정을 위한 배지는 tryptic soy agar(TSA)를, 세균을 희석하기 위한 희석수로는 멸균 증류수를 사용하였다.
- 시료준비: 본 실험에 사용한 천연물 42종은 Table 1과 같으며, 이들 재료는 대구시의 약령시장에서 건조 상태의 것을 구입하여 불순물 제거를 위해 수세 후 건조하여 사용하였고, 무게의 10배량(w/v)의 80% 메탄올이나 증류수(w/v)를 가하여 24시간 동안 정치하여 총 3회 반복 추출하였다. 추출액은 여과지(Whatman No.
- 우선 균주는 해당 평판배지에 균주를 streaking하여 배양한 후 배양된 각 균주 1 백금이를 취해 10 mL TSB에 접종하고 37℃에서 24시간 배양하여 활성화시킨 후 3일 계대 배양 후 spectrophotometer(UNIKON922, Kontron, Italy)를 이용하여 625 nm에서 측정하여 흡광도가 0.08～0.1(McFarland nephelometer)이 되게 하여 균수를 1.5×108 cfu/mL로 사용하였다.
이론/모형
- Western blot에 의한 내성단백질 발현 변화 조사: 로즈마리 추출물이 MRSA 세포벽의 PBP2a와 PBP2a 전사와 관련된 단백질인 MecA의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위하여 MRSA KCCM 40511 균주를 사용하여 western blot을 실시하였다. MRSA KCCM 40511을 15 mL cornical tube에 1.
- 로즈마리 분획물의 MRSA 생육억제 측정: 로즈마리 분획물의 항균력 검색은 disc diffusion method 법을 실시하였다. TSA배지에 멸균된 glass spreader로 균을 spread한 후 8 mm paper disc를 올려놓은 다음 syringe filter(0.
- 생육저해능 비교: 추출물의 항균력 검색은 disc diffusion method 법을 실시하였다. 우선 균주는 해당 평판배지에 균주를 streaking하여 배양한 후 배양된 각 균주 1 백금이를 취해 10 mL TSB에 접종하고 37℃에서 24시간 배양하여 활성화시킨 후 3일 계대 배양 후 spectrophotometer(UNIKON922, Kontron, Italy)를 이용하여 625 nm에서 측정하여 흡광도가 0.
성능/효과
- 42가지의 천연물 시료 중 세신, 호두(열수), 골쇄보, 뽕잎, 로즈마리에서 S. aureus ATCC 25923 및 MRSA KCCM 40511에 대해 우수한 항균활성을 나타냈다. 이들 시료 중 가장 우수한 항균활성을 가지는 로즈마리를 순차 분획하여 각 분획물을 이용한 MRSA에 대한 항균활성을 알아본 결과 hexane, chloroform 분획물에서 항균활성을 나타냈으며, 각 분획물 중 hexane 분획물이 가장 높은 저해활성을 나타내었다.
- 이에 β-lactamase라 불린다. MRSA KCCM 40511 균주에서의 penicillinase 발현 역시 로즈마리 메탄올 추출물 및 hexane 분획물 처리 시에 농도의존적으로 감소하는 것을 알 수 있었다. 이는 penicillinase가 MecA에 의해 합성되어지기 때문에 MecA의 발현이 억제됨에 따라 penicillinase의 발현 또한 억제되는 것으로 생각된다.
- 그러므로 로즈마리 메탄올 추출물 및 hexane 분획물은 MRSA KCCM 40511의 내성 단백질인 MecA와 MecA에 의해 합성되는 세포벽 단백질인 penicillinase의 발현을 억제시킴으로써 고도 내성균의 내성을 억제시키는데 큰 효과가 있는 것을 알 수 있었다.
- 3, 4와 같다. 내성균주에 로즈마리 메탄올 추출물과 Hexane 분획물을 각각 농도별로 처리했을 때, MecA의 발현이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다. MRSA의 내인성 내성은 methicillin과 다른 β-lactam계 항생제에 대한 민감성이 감소된 형태로 나타나고 이 감소 현상을 MecA 유전자에 의해 외인성 PBP2a의 생산을 통하여 일어나게 된다.
- 이들 시료 중 가장 우수한 항균활성을 가지는 로즈마리를 순차 분획하여 각 분획물을 이용한 MRSA에 대한 항균활성을 알아본 결과 hexane, chloroform 분획물에서 항균활성을 나타냈으며, 각 분획물 중 hexane 분획물이 가장 높은 저해활성을 나타내었다. 또한 SEM을 통한 형태학적 관찰을 통해 분획물 처리 시 MRSA의 세포벽이 파괴되는 것을 확인할 수 있었다. 로즈마리 메탄올 추출물 및 hexane 분획물은 MRSA KCCM 40511의 내성 단백질인 MecA와 MecA에 의해 합성되는 세포벽 단백질 penicillinase의 발현을 억제시킴으로써 고도 내성균의 내성을 억제시키는 것으로 나타났다.
- 5 mm, 내성균주의 경우 9 mm의 inhibition zone을 보였다. 또한 hexane 분획물의 경우에서는 2.5 mg/disc의 농도에서 표준균주는 15 mm, 내성균주는 11.5 mm의 inhibition zone을 나타냈으며, 1.25 mg/disc의 경우 표준균주는 13 mm, 내성균주는 11 mm을 나타내어 로즈마리의 CHCl3, hexane 분획물층 모두에서 표준균주와 내성균주에 대해서 높은 항균력을 가지는 것으로 나타났다.
- 또한 SEM을 통한 형태학적 관찰을 통해 분획물 처리 시 MRSA의 세포벽이 파괴되는 것을 확인할 수 있었다. 로즈마리 메탄올 추출물 및 hexane 분획물은 MRSA KCCM 40511의 내성 단백질인 MecA와 MecA에 의해 합성되는 세포벽 단백질 penicillinase의 발현을 억제시킴으로써 고도 내성균의 내성을 억제시키는 것으로 나타났다.
- 로즈마리 메탄올 추출물의 용매별 순차분획: 메탄올로 추출한 로즈마리 powder를 극성이 다른 용매 hexane 및 chloroform, ethyl acetate, butanol로 분획했을 때 수득량은 Table 4와 같으며, 이들을 메탄올 추출물에 대해 차지하는 비율로 환산하면 water fraction 33.5%, butanol fraction 17.1%, ethylacetate fraction 10.26% 순으로 높게 나타났다.
- 로즈마리 분획물의 항균효과: 로즈마리 분획물을 이용하여 S. aureus ATCC 25923 및 MRSA KCCM 40511에 대한 항균효과를 검색한 결과 Table 5에서 보는 것과 같이 EtOAc, BuOH, water 분획물에서는 inhibition zone이 전혀 나타나지 않아 이들 용매 층에서는 항균효과가 확인되지 않았다. 반면, CHCl3에서는 2.
- 약용식물 추출물의 S. aureus ATCC 25923 및 MRSA KCCM 40511에 대한 항균력 검색 42종의 천연약용 식물추출물의 S. aureus ATCC 25923 균주에 대한 항균 활성을 관찰한 결과, 세신, 호두(열수), 골쇄보, 뽕잎, 로즈마리 추출물에서 항균력을 나타냈으며, 이중 로즈마리가 5 mg/disc의 농도에서 17.5 mm의 Inhibition zone을 나타내 가장 높은 항균력을 보였다. 같은 농도에서 세신은 15.
- aureus ATCC 25923 및 MRSA KCCM 40511에 대해 우수한 항균활성을 나타냈다. 이들 시료 중 가장 우수한 항균활성을 가지는 로즈마리를 순차 분획하여 각 분획물을 이용한 MRSA에 대한 항균활성을 알아본 결과 hexane, chloroform 분획물에서 항균활성을 나타냈으며, 각 분획물 중 hexane 분획물이 가장 높은 저해활성을 나타내었다. 또한 SEM을 통한 형태학적 관찰을 통해 분획물 처리 시 MRSA의 세포벽이 파괴되는 것을 확인할 수 있었다.
- 하지만 로즈마리 메탄올 추출물 및 hexane 분획물에서는 각각 165, 130 μg/mL의 농도에서 MIC를 나타냈다. 이러한 결과들로 볼 때, 로즈마리에서 MRSA 균주에 항균력을 나타내는 성분이 hexane 분획물에 다량 함유되어 있다고 판단되며, 앞서 연구된 단삼(24)의 결과와 비교해 볼 때 로즈마리가 우수한 항균물질을 다량 함유하고 있는 것으로 판단된다.
- 주사전자현미경관찰(SEM): KCCM 40511을 SEM을 통하여 15,000배율에서 관찰해본 결과, Fig. 2에서 보는 것과 같이 로즈마리 hexane 분획물의 처리로 인하여 내성균주의 세포벽이 파괴되고 세포의 모양이 흐트러져 원래 구균의 형태를 유지하지 못하고 있는 것을 볼 수 있었다.
후속연구
- 로즈마리는 항균작용 및 진정작용이 우수한 것으로 알려져 있으나 MRSA와 같은 내성균에 대한 보고는 미비한 실정이다. 그래서 이러한 결과는 천연물을 이용한 천연 약재로써의 활용 가치가 클 것으로 예상된다.
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