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문제 정의
- 본 연구에서는 한약재 발효에 주로 사용되어지는 영지버섯, 동충하초, 꿀, 누룩을 발효원으로 사용하여 작약을 발효시킨 후 발효원에 따라 달라지는 약재의 지표성분 변화를 HPLC를 이용하여 분석하고자 하였다. 이를 위하여 대한약전의 9개정판 정량법17)에 고시되어 있는 작약의 주성분인 albiflorin과 paeoniflorin에 대하여 발효 전․후의 함량분석을 통해 발효된 작약의 지표성분 변화에 대한 결과를 보고하고자 한다.
- 본 연구에서는 한약재 발효에 주로 사용되어지는 영지버섯, 동충하초, 꿀, 누룩을 발효원으로 사용하여 작약을 발효시킨 후 발효원에 따라 달라지는 약재의 지표성분 변화를 HPLC를 이용하여 분석하고자 하였다. 이를 위하여 대한약전의 9개정판 정량법17)에 고시되어 있는 작약의 주성분인 albiflorin과 paeoniflorin에 대하여 발효 전․후의 함량분석을 통해 발효된 작약의 지표성분 변화에 대한 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- PDB 배지는 삼각플라스크(500 ㎖)에 200 ㎖씩 각각 넣어 121℃에서 15분간 살균한 다음 냉각시켜 사용하였다. PDA 평판배지에서 20일간 배양된 균사의 가장자리 부위를 직경 5 ㎜ 코르크보러를 사용하여 각각 4조각을 채취한 후 PDB 액체 배지에 접종한 후 25℃에서 7일간 진탕배양(120 rpm)하여 액체 종균을 생산하였다.
- 건조감량 시험을 통하여 작약 가루에 함유되어 있는 수분의 양을 측정하였다. 작약의 건조감량 시험법에 따라 3회 반복 실시한 결과는 <Table 2>와 같다.
- 균주는 PDA 평판배지에서 4℃에서 보존하면서 30일 간격으로 계대배양 하였다. 균사 생장을 위해 PDA 평판배지를 이용하여 항온 배양기에서 25℃, 20일간 배양하였다.
- 동충하초, 영지버섯 균주 보관용 배지는 PDA(Potato Dextrose Agar, Difco사)를 이용하였으며 액체종균 생산용 배지는 PDB(Potato Dextrose Broth, Difco 사)를 사용하였다. 균사 생장을 위해 항온 배양기(HST-301M-3D)와 진탕배양기(HST-201M-SLI)를 사용하였다. 꿀, 누룩 발효를 위해 dry oven(JSOF-150, Korea)을 이용하였다.
- 꿀 발효는 당귀가루 500 g에 희석한 꿀(꿀 150 ㎖ + 생수 150 ㎖)300 ㎖를, 누룩발효는 당귀가루 500 g에 누룩발효액(누룩 50 g에 고두밥 500 g를 넣어 섞은 후 발효시킴)300 ㎖를 넣은 후 각각의 시료를 dry oven에서 37℃를 유지하면서 22일간 고체발효를 실시하였다.
- 무게를 단 칭량병에 시료 3.0 g을 넣어 무게를 정밀하게 측정하여 105℃에서 6시간 건조하고, 데시케이터에서 방냉한 후 그 무게를 항량이 되었을 때의 감량을 건조감량(%)으로 하였으며 검액의 조제시 이를 감안하여 검체무게를 측정하였다.
- 잔류물에 50% 메탄올 30 ㎖를 넣어 같은 방법으로 조작하였다. 여액을 모두 합하여 50% 메탄올을 넣어 정확하게 100 ㎖로 하여 0.45 ㎛ syringe filter로 여과한 여액을 검액으로 사용하였으며 HPLC로 분석하여 얻은 chromatogram의 면적을 구하여 표준품의 회귀직선 방정식으로부터 각각의 albiflorin과 paeoniflorin의 함량을 구하였고 시료에 대해 3회 반복하여 지표성분의 함량(%)을 산출하였다.
- 작약가루에 동충하초, 영지버섯 액체종균 현탁액을 각각 10%(v/v) 수준으로 접종하여 생육온도 25℃, 상대습도 80%를 유지하면서 30일간 고체발효를 실시하였다.
- 작약을 영지버섯, 동충하초 균사체, 꿀, 누룩을 이용하여 발효시킨 후 변화되는 지표성분 albiflorin과 paeoniflorin의 함량을 분석하였다.
대상 데이터
- (Japan)의 system controller(SCL-10A vp), solvent delivery system(LC-6AD), photodiode array detector(SPD-M10A vp), auto sample injector(SIL-10AF), degasser(DGU-14A)를 사용하였으며 HPLC column은 RStech사의 C18 Optimapak(4.6 × 250 ㎜, 5 ㎛)을 사용하였다.
- 균사 생장을 위해 항온 배양기(HST-301M-3D)와 진탕배양기(HST-201M-SLI)를 사용하였다. 꿀, 누룩 발효를 위해 dry oven(JSOF-150, Korea)을 이용하였다.
- 작약의 발효에 사용된 균주는 (주)바이온에서 직접 동충하초(Paecilomyces japonica)와 영지버섯(Ganoderma lucidum)품종을 자실체에서 분리하여 사용하였다. 꿀은 강원도 양구 방산꿀(잡꿀)을 사용하였으며 누룩은 부산시 금정구 산성누룩을 사용하였다.
- 동충하초, 영지버섯 균주 보관용 배지는 PDA(Potato Dextrose Agar, Difco사)를 이용하였으며 액체종균 생산용 배지는 PDB(Potato Dextrose Broth, Difco 사)를 사용하였다. 균사 생장을 위해 항온 배양기(HST-301M-3D)와 진탕배양기(HST-201M-SLI)를 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 작약 (P. lactiflora)은 식약청 지정 검사기관에서 품질검사가 완료된 약재로써 경북영천에서 생산되었으며 영천현대약업사에서 구입하여 사용하였으며 추출수율의 향상을 위해 잘게 분쇄한 후 사용하였다.
- 시료의 추출에 사용한 유기용매는 대정화금주식회사에서 생산한 특급 시약을 사용하였으며 기기분석을 위한 HPLC 용매는 J.T Baker사의 특별시약을 사용하였다. 그 외는 모두 특급 시약을 사용하였다.
- 실험에 사용한 지표물질인 albiflorin과 paeoniflorin은 식품의약품안전청에서 분양 받았으며 지표물질을 메탄올에 녹인 후 albiflorin은 0.05, 0.03, 0.01, 0.005 mg/mL 의 농도로, paeoniflorin은 0.5, 0.3, 0.1, 0.05 mg/mL 의 농도로 희석하여 검량선을 작성하였다.
- 작약의 발효에 사용된 균주는 (주)바이온에서 직접 동충하초(Paecilomyces japonica)와 영지버섯(Ganoderma lucidum)품종을 자실체에서 분리하여 사용하였다. 꿀은 강원도 양구 방산꿀(잡꿀)을 사용하였으며 누룩은 부산시 금정구 산성누룩을 사용하였다.
성능/효과
- 1. Albiflorin의 함량은 SYT, SNT 실험군에서 감소하였으며 SDT, SST 실험군에서 증가하였다.
- 2) 또한 작약은 어혈을 풀어주어 피를 원활하게 하며 통증을 멈추게 하는 효능이 있으며 주성분으로는 paeoniflorin, albiflorin, paeonol, paeonin, tannin, β-sitosterol, triterpenoids 등이 함유되어 있다.
- 2. Paeoniflorin의 함량은 모든 실험군에서 control 보다 감소하였다.
- 3. SDT, SST, SNT 크로마토그램에서 9분대에 새로운 peak가 검출되었다.
- Control과 작약 발효추출물의 HPLC chromatogram에서 작약의 2가지 지표성분이 비교적 잘 분리되었음을 알 수 있었으며 이들의 함량은 에 나타내었다.
- 동충하초와 꿀 발효추출물의 경우 albiflorin의 peak는 증가하고, paeoniflorin의 peak는 감소하는 경향을 보이면서 9분대에서 새로운 peak가 검출됨을 알 수 있었다. 누룩발효 추출물의 경우 albiflorin과 paeoniflorin의 peak가 모두 감소하면서 동시에 9분대에서 새로운 peak가 크게 검출됨을 확인 할 수 있었다. 위의 결과를 살펴보면 영지버섯 발효추출물은 발효 후 지표성분 뿐만 아니라 전체적으로 모든 peak가 감소되는 경향을 보였으며, 동충하초, 꿀, 및 누룩 발효추출물은 발효 후 지표성분의 일부가 9분대에서 새로 검출된 물질로 전환된 것으로 생각되며 이 성분에 대한 정확한 규명과 더불어 작약의 발효 전․후의 다양한 효능 평가를 통한 비교분석이 이루어진다면 향후 발효를 통한 생약의 신소재로의 활용가치가 높아질 것으로 사료된다.
- 영지버섯 발효추출물의 경우 albiflorin과 paeoniflorin의 함량이 모두 감소하였고 그 이외의 peak도 전체적으로 감소하는 경향을 보였으며 새로운 peak도 검출되지 않았다. 동충하초와 꿀 발효추출물의 경우 albiflorin의 peak는 증가하고, paeoniflorin의 peak는 감소하는 경향을 보이면서 9분대에서 새로운 peak가 검출됨을 알 수 있었다. 누룩발효 추출물의 경우 albiflorin과 paeoniflorin의 peak가 모두 감소하면서 동시에 9분대에서 새로운 peak가 크게 검출됨을 확인 할 수 있었다.
- 작약의 건조감량 시험법에 따라 3회 반복 실시한 결과는 <Table 2>와 같다. 모든 발효된 작약은 발효하지 않은 control에 비하여 건조감량이 높게 나타났으며, 발효하지 않은 control을 포함하여 모든 발효된 작약시료에서 발효 후 수분 함량이 증가하는 결과를 나타내었다.
- Paeoniflorin의 경우 지표성분의 함량은 모든 실험군에서 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 영지버섯 발효추출물의 경우 albiflorin과 paeoniflorin의 함량이 모두 감소하였고 그 이외의 peak도 전체적으로 감소하는 경향을 보였으며 새로운 peak도 검출되지 않았다. 동충하초와 꿀 발효추출물의 경우 albiflorin의 peak는 증가하고, paeoniflorin의 peak는 감소하는 경향을 보이면서 9분대에서 새로운 peak가 검출됨을 알 수 있었다.
- 작약 발효 추출물에 함유된 지표성분의 함량은 albiflorin의 경우, 영지버섯과 누룩발효 추출물은 발효후 control에 비해 함량이 감소하는 것을 알 수 있었으며 동충하초와 꿀 발효추출물의 경우 albiflorin의 함량이 control 대비 각각 13.02, 3.37% 증가하는 것을 알 수 있었다. Paeoniflorin의 경우 지표성분의 함량은 모든 실험군에서 감소하는 것을 확인 할 수 있었다.
후속연구
- 누룩발효 추출물의 경우 albiflorin과 paeoniflorin의 peak가 모두 감소하면서 동시에 9분대에서 새로운 peak가 크게 검출됨을 확인 할 수 있었다. 위의 결과를 살펴보면 영지버섯 발효추출물은 발효 후 지표성분 뿐만 아니라 전체적으로 모든 peak가 감소되는 경향을 보였으며, 동충하초, 꿀, 및 누룩 발효추출물은 발효 후 지표성분의 일부가 9분대에서 새로 검출된 물질로 전환된 것으로 생각되며 이 성분에 대한 정확한 규명과 더불어 작약의 발효 전․후의 다양한 효능 평가를 통한 비교분석이 이루어진다면 향후 발효를 통한 생약의 신소재로의 활용가치가 높아질 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로 작약의 발효와 지표성분 albiflorin과 paeoniflorin의 함량증가와는 정비례하지 않는 것으로 사료되며, 또한 발효 후의 보다 정확한 지표성분 변화 매커니즘 규명을 위해서는 지표성분이 발효에 따라 전환, 생성되는 새로운 물질의 동정과 함께 발효 전․후에 따른 다양한 효능연구가 병행되어야 할 것으로 사료된다.
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