[논문]HPLC를 이용한 발효 감초의 지표 성분 분석

엄영란; 심기석; 이재훈; 박화용; 마진열

HPLC를 이용한 발효 감초의 지표 성분 분석
Quantitative Analysis of Glycyrrhizic Acid in Fermented Glycyrrhizae Radix by HPLC 원문보기

韓國韓醫學硏究院論文集 = Korean journal of oriental medicine, v.15 no.1 = no.25, 2009년, pp.85 - 89

엄영란 (한국한의학연구원 신한방제제연구센터) , 심기석 (한국한의학연구원 신한방제제연구센터) , 이재훈 (한국한의학연구원 신한방제제연구센터) , 박화용 (한국한의학연구원 신한방제제연구센터) , 마진열 (한국한의학연구원 신한방제제연구센터)

Abstract ▼ AI-Helper

The aim of this study was to study the quantitative analysis of glycyrrhizic acid in Glycyrrhizae Radix extract fermented with Paecilomyces japonica, Ganoderma lucidum, honey or Nuruk. The amounts of dry on loss were measured and the quantitative analysis of glycyrrhizic acid was performed by high performance liquid chromatographic (HPLC). HPLC method was performed on C18 column ($250\;mm\;{\times}\;4.6\;mm$, $5\;{\mu}m$, RS tech) using gradient solvent mixtures of water-acetonitrile with photodiode array detector (254 nm). The flow rate was $1.0\;m{\ell}/min$. Retention time of glycyrrhizic acid was about 23.96 min and linearity of calibration was $R^2$=0.9998. Contents of glycyrrhizic acid in Glycyrrhizae Radix extract (control) was $5.048\;{\pm}\;0.14$; Contents of glycyrrhizic acid in Glycyrrhizae Radix extract fermented with Paecilomyces japonica (SDT) was $1.975\;{\pm}\;0.07$; Contents of glycyrrhizic acid in Glycyrrhizae Radix extract fermented with Ganoderma lucidum (SYT) was $2.676 \;{\pm}\;0.07$; Contents of glycyrrhizic acid in Glycyrrhizae Radix extract fermented with honey (SST) was $5.191\;{\pm}\;0.06$; Contents of glycyrrhizic acid in Glycyrrhizae Radix extract fermented with Nuruk (SNT) was $5.305\;{\pm}\;0.34$, respectively. Contents of glycyrrhizic acid in SDT and SYT were decreased but that in SST and SNT was increased when compared to control.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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제안 방법

45 ㎛ syringe filter로 여과한 여액을 검액으로 사용하였다. HPLC로 분석하여 얻은 chromatogram의 면적을 회귀직선 방정식에 대입하여 각각의 glycyrrhizic acid의 함량을 구했으며 각각의 시료에 대해 3회 반복하여 지표성분의 함량(%)을 산출하였다.
감초가루에 동충하초, 영지버섯 액체종균 현탁액을 각각 10%(v/v) 수준으로 접종하여 생육온도 25℃, 상대습도 80%를 유지하면서 30일간 고체발효를 실시하였다.
감초를 동충하초, 영지버섯, 꿀, 누룩으로 발효한 후 건조감량 시험법에 따라 발효 후 감초의 건조 감량을 측정하였다(Table 2). 모든 발효한 감초 추출물은 발효하지 않은 control에 비하여 건조감량이 높게 나타났으며 이는 발효 후 수분 함량이 높아지는 것을 보여주며 검액의 조제 시 이를 감안하여 검체무게를 측정하였다.
균주는 PDA 평판배지에서 4℃에서 보존하면서 30일 간격으로 계대배양 하였다. 균사 생장을 위해 PDA 평판배지를 이용하였고 항온 배양기에서 25℃로 20일간 배양하였다.
동충하초, 영지버섯 균주 보관용 배지는 Potato Dextrose Agar(PDA, Difco, USA)를 이용하였으며 액체종균 생산용 배지는 Potato Dextrose Broth(PDB, Difco, USA)를 사용하였다. 균사 생장을 위해 항온 배양기(HST-301M-3D)와 진탕배양기(HST-201M-SLI)를 사용하였다. 꿀과 누룩 발효를 위해 dry oven(JSOF-150, Korea)을 이용하였다.
꿀 발효는 감초가루 500g에 희석한 꿀(꿀 150 ㎖ + 생수 150 ㎖) 300 ㎖를, 누룩발효는 감초가루 500 g에 누룩발효액(누룩 50 g에 고두밥 500 g을 넣어 섞은 후 발효시킴) 300 ㎖를 넣은 후 각각의 시료를 dry oven에서 37℃를 유지하면서 22일간 고체발효를 실시하였다.
하지만, 이에 대한 선행 연구로 여러 가지 발효원에 따른 감초의 지표 성분의 변화에 대한 연구가 필요하나 아직까지 일부가 이루어졌을 뿐이다. 따라서 본 연구는 발효법에서 사용되는 동충하초, 영지버섯, 꿀, 누룩으로 감초를 발효한 후 감초 내 주요 지표 성분인 glycyrrhizic acid의 HPLC 정량 분석을 실시하여 발효에 의한 지표 성분 변화를 관찰하였다.
무게를 단 칭량병에 시료 3.0 g을 넣어 무게를 정밀하게 측정하여 105℃에서 6시간 건조하고, 데시케이터에서 방냉한 후 그 무게를 항량이 되었을 때의 감량을 건조감량(%)으로 하였다.
전통적인 한방 발효법에 사용되는 동충하초, 영지버섯, 누룩, 꿀을 이용하여 감초를 발효한 후 감초의 대표적인 지표성분인 glycyrrhizic acid의 함량을 분석하였다.

대상 데이터

(Japan)의 system controller(SCL-10A vp), solvent delivery system(LC-6AD), photodiode array detector(SPD-M10A vp), auto sample injector(SIL-10AF), degasser(DGU-14A)를 사용하였으며 HPLC column은 RS tech 사의 C18 Optimapak(250 × 4.6 ㎜, 5 ㎛)을 사용하였다.
PDB 배지는 500 ㎖ 삼각플라스크에 200 ㎖씩 각각 넣어 121℃에서 15분간 살균한 다음 냉각시켜 사용하였다. PDA 평판배지에서 20일간 배양된 균사의 가장자리 부위를 직경 5 ㎜ 코르크보러를 사용하여 각각 4조각을 채취하였다. 이를 PDB 액체 배지에 접종한 후 25℃에서 7일간 진탕배양(120 rpm)하여 액체 종균을 생산하였다.
감초의 발효에 사용된 균주는 동충하초(Paecilomyces japonica)와 영지버섯(Ganoderma lucidum)품종으로 자실체에서 분리한 후 사용하였다. 꿀은 방산꿀(강원도 양구시)을 그리고 누룩은 산성누룩(부산시 금정구)을 각각 구입하여 발효에 사용하였다.
균사 생장을 위해 항온 배양기(HST-301M-3D)와 진탕배양기(HST-201M-SLI)를 사용하였다. 꿀과 누룩 발효를 위해 dry oven(JSOF-150, Korea)을 이용하였다.
감초의 발효에 사용된 균주는 동충하초(Paecilomyces japonica)와 영지버섯(Ganoderma lucidum)품종으로 자실체에서 분리한 후 사용하였다. 꿀은 방산꿀(강원도 양구시)을 그리고 누룩은 산성누룩(부산시 금정구)을 각각 구입하여 발효에 사용하였다.
동충하초, 영지버섯 균주 보관용 배지는 Potato Dextrose Agar(PDA, Difco, USA)를 이용하였으며 액체종균 생산용 배지는 Potato Dextrose Broth(PDB, Difco, USA)를 사용하였다. 균사 생장을 위해 항온 배양기(HST-301M-3D)와 진탕배양기(HST-201M-SLI)를 사용하였다.
본 실험에 사용한 감초(Glycyrrhizae Radix)는 신흥제약부설연구소에서 검사하여 류수한방제약사에서 판매하는 것 중 대한약전 감초 항에 적합한 것을 엄선하여 감초의 추출수율의 향상을 위해 잘게 분쇄한 후 사용하였다.
시료의 추출에 사용한 유기용매는 대정화금주식회사에서 생산한 특급 시약을 사용하였으며 기기분석을 위한 HPLC용매는 J.T Baker사의 특별시약을 사용하였다. 그 외는 모두 특급 시약을 사용하였다.
실험에 사용한 지표 성분인 glycyrrhizic acid(Figure 1)은 식품의약품안전청에서 분양 받았으며 지표 성분 5 ㎎을 70% 에탄올 10 ㎖에 녹인 후 0.5, 0.3, 0.1, 0.05 ㎎/ ㎖의 농도로 희석하여 검량선을 작성하였다.

이론/모형

대한약전 9개정의 정량법¹⁷⁾에 따라 검체를 잘게 자른 후 검체 0.5 g을 70% 에탄올 40 ㎖에 넣어 1시간 초음파 추출한 다음 여과하였다. 잔류물에 70% 에탄올 30 ㎖를 넣어 같은 방법으로 조작하였다.

성능/효과

1) 본초 문헌에서 甘草는 화를 식히고 목의 아픈 증상을 없애며 약물 중독을 제거하고 胃의 적열을 제거하며 尿管通을 없애는 효능이 있다고 기록되어 있다.²⁾ 현대의학에선 감초의 항염증작용, 항궤양 작용, 항알레르기 작용, 항바이러스 작용 등이 밝혀졌다.
1. 모든 발효한 감초 추출물은 발효하지 않은 Control에 비하여 건조감량이 높게 나타났다.
¹⁾ 본초 문헌에서 甘草는 화를 식히고 목의 아픈 증상을 없애며 약물 중독을 제거하고 胃의 적열을 제거하며 尿管通을 없애는 효능이 있다고 기록되어 있다.²⁾ 현대의학에선 감초의 항염증작용, 항궤양 작용, 항알레르기 작용, 항바이러스 작용 등이 밝혀졌다.^3,4) 감초의 성분으로 saponin(6-14%)인 glycyrrhizin이 주요 성분이며 이외 phenol 성분인 licopyranocoumarin, fla- vonoid 성분인 apioliquiritin 등이 있고 glycyrrhizin은 β-Dglucuronidase 의해 생체 내 주요 생리활성 성분인 glycyrrhizinic acid로 대사된다.
2. Glycyrrhizic acid 함량은 SNT, SST, Con, SYT, SDT의 순으로 높게 나타났다.
3,4) 감초의 성분으로 saponin(6-14%)인 glycyrrhizin이 주요 성분이며 이외 phenol 성분인 licopyranocoumarin, fla- vonoid 성분인 apioliquiritin 등이 있고 glycyrrhizin은 β-Dglucuronidase 의해 생체 내 주요 생리활성 성분인 glycyrrhizinic acid로 대사된다.
3. Glycyrrhizic acid 함량에서 Con에 비교하여 SDT는 65%, SYT는 49%가 각각 감소하였고 SST는 3%, SNT 5% 각각 증가하였다.
¹⁸⁾ 또한, 누룩을 이용한 감초 발효에서 liquritin과 liquiritin apioside의 감소와 동시에 약 95%의 전환율을 보이며 liquiritigenin 증가하는 것이 보고된 바 있다.⁹⁾ 일련의 연구들로 미루어 볼 때 감초 발효에 사용된 각각의 한방 발효원 또는 발효 조건에 따라 감초 지표성분이 변화되며 이는 발효로 인한 감초의 효능 변화와 연관시킬 수 있을 것으로 보인다. 앞으로 여러 가지 감초 발효원과 발효 조건에 따라 변화된 발효 감초 지표성분의 분석과 발효 중 새로이 생성되는 물질의 동정 그리고 다양한 발효 감초의 효능 연구가 수행되는 것이 발효 감초의 사용 목적에 적합한 발효원의 개발과 효율적인 발효 감초 생산을 위해 필요할 것으로 사료된다.
감초의 지표성분과 발효된 감초 추출물에 대한 HPLC 그래프는 [Figure 2]에서와 같이 나타났으며 이들의 함량은 [Table 3]에 나타내었다. 감초의 지표성분인 glycyrrhizic acid의 검량선은 y=11918x+56820(r2=0.9998)으로 양호한 직선성을 나타냈으며(Figure 3) HPLC chromatogram에서 retention time은 약 23.96분대로 확인되었다.
모든 발효된 감초 추출물의 그래프에서 지표성분은 다른 성분들과 비교적 잘 분리되었음을 확인하였다(Figure 2). 분리된 지표성분의 함량은 SNT, SST, Con, SYT, SDT순서로 높게 나타났다.
감초를 동충하초, 영지버섯, 꿀, 누룩으로 발효한 후 건조감량 시험법에 따라 발효 후 감초의 건조 감량을 측정하였다(Table 2). 모든 발효한 감초 추출물은 발효하지 않은 control에 비하여 건조감량이 높게 나타났으며 이는 발효 후 수분 함량이 높아지는 것을 보여주며 검액의 조제 시 이를 감안하여 검체무게를 측정하였다.
모든 발효된 감초 추출물의 그래프에서 지표성분은 다른 성분들과 비교적 잘 분리되었음을 확인하였다(Figure 2). 분리된 지표성분의 함량은 SNT, SST, Con, SYT, SDT순서로 높게 나타났다. 지표성분 함량을 발효하지 않은 Con과 비교할 때 SDT는 Con보다 62% 그리고 SYT는 49% 감소하였고 SNT는 Con보다 3% 그리고 SNT는 5% 증가하였다(Table 3).
분리된 지표성분의 함량은 SNT, SST, Con, SYT, SDT순서로 높게 나타났다. 지표성분 함량을 발효하지 않은 Con과 비교할 때 SDT는 Con보다 62% 그리고 SYT는 49% 감소하였고 SNT는 Con보다 3% 그리고 SNT는 5% 증가하였다(Table 3).
¹⁰⁾ 이에 더해 본 연구에선 4가지 발효원으로 발효한 감초 발효에서 각각의 발효원에 따라 감초의 주요 지표성분인 glycyrrhizic acid의 함량에 증감을 보였다. 한편, 감초의 법제 조건에 따라 성분 변화를 관찰한 연구로 열처리한 감초 제조 시 열처리하는 시간이 증가함(100분에서 120분)에 따라 glycyrrhetic acid의 함량 증가(0.02%에서 0.44%)와 함께 항산화활성이 현저하게 증가되는 것이 확인되었다.¹⁸⁾ 또한, 누룩을 이용한 감초 발효에서 liquritin과 liquiritin apioside의 감소와 동시에 약 95%의 전환율을 보이며 liquiritigenin 증가하는 것이 보고된 바 있다.

후속연구

4가지 다른 발효원으로 발효한 감초에서 지표성분의 차이를 처음으로 발견한 본 연구 결과는 발효 감초를 이용하는 여러 한약재 성분 분석의 기초 자료로 이용될 수 있으며 이를 통해 치료 목적에 맞는 한약재의 제조 및 제형 그리고 발효 한약재를 이용한 기능성 한방 제품의 개발에도 유용하게 응용될 수 있을 것으로 기대된다.
⁹⁾ 일련의 연구들로 미루어 볼 때 감초 발효에 사용된 각각의 한방 발효원 또는 발효 조건에 따라 감초 지표성분이 변화되며 이는 발효로 인한 감초의 효능 변화와 연관시킬 수 있을 것으로 보인다. 앞으로 여러 가지 감초 발효원과 발효 조건에 따라 변화된 발효 감초 지표성분의 분석과 발효 중 새로이 생성되는 물질의 동정 그리고 다양한 발효 감초의 효능 연구가 수행되는 것이 발효 감초의 사용 목적에 적합한 발효원의 개발과 효율적인 발효 감초 생산을 위해 필요할 것으로 사료된다.
이처럼 다양한 발효원을 감초 발효에 적용 시 다빈용 한약재인 감초의 약효에 변화를 줄 수 있을 뿐만 아니라 발효 감초를 이용한 한약재의 개발에도 영향을 줄 것으로 보인다. 하지만, 이에 대한 선행 연구로 여러 가지 발효원에 따른 감초의 지표 성분의 변화에 대한 연구가 필요하나 아직까지 일부가 이루어졌을 뿐이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	감초의 성분은 무엇인가?	2) 현대의학에선 감초의 항염증작용, 항궤양 작용, 항알레르기 작용, 항바이러스 작용 등이 밝혀졌다.3,4) 감초의 성분으로 saponin(6-14%)인 glycyrrhizin이 주요 성분이며 이외 phenol 성분인 licopyranocoumarin, fla- vonoid 성분인 apioliquiritin 등이 있고 glycyrrhizin은 β-Dglucuronidase 의해 생체 내 주요 생리활성 성분인 glycyrrhizinic acid로 대사된다.5)
	감초의 법제법 중 발효법은 무엇인가?	한방 문헌에 기록된 다양한 감초의 법제법으로 炒法, 蜜炙法, 醱酵法 등이 있다.6-8) 이 중 발효법은 꿀이나 누룩과 같은 액체 또는 고체 발효원 안의 독특한 미생물이나 효소를 이용하여 한약재 내의 생리 활성 성분의 흡수를 증가시키거나 새로운 활성 성분을 생성시켜 한약재의 효능을 향상시키는 방법이다. 최근에 누룩으로 발효를 한 감초발효액이 발효전의 감초액과 비교하여 fibro- blast의 콜라겐 생성능을 증가시키는 것이 보고되었다.
	감초란 무엇인가?	감초(Glycyrrhizae Radix, Glycyrrhiza)는 감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer) 또는 광과감초(光果甘草, Glycyrrhiza glabra Linne)의 뿌리와 주출경을 그대로 또는 주피를 제거한 것으로 한방에서 가장 높은 빈도로 사용되는 약재이다.1) 본초 문헌에서 甘草는 화를 식히고 목의 아픈 증상을 없애며 약물 중독을 제거하고 胃의 적열을 제거하며 尿管通을 없애는 효능이 있다고 기록되어 있다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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