[논문]감초 지표성분 분석법 확립 및 liquiritigenin의 함량 증대를 위한 감초의 수치에 관한 연구

이종록; 조미정; 박상미; 김상찬; 박숙자

감초 지표성분 분석법 확립 및 liquiritigenin의 함량 증대를 위한 감초의 수치에 관한 연구
Establishment of UPLC method for analysis of liquiritigenin and studies on the processing of licorice for enhancement of liquiritigenin content 원문보기

大韓韓醫學方劑學會誌 = Herbal formula science, v.18 no.1, 2010년, pp.145 - 154

이종록 (대구한의대학교 한의과대학) , 조미정 (대구한의대학교 한의과대학) , 박상미 (대구한의대학교 한의과대학) , 김상찬 (대구한의대학교 한의과대학) , 박숙자 (대구한의대학교 한의과대학)

Abstract ▼ AI-Helper

Objective : Licorice has been used for treating digestive disorder and also recommended as a detoxification agent. Liquiritigenin, a component of licorice, has been reported to have various biological activities. In this study, we aimed to establish the analytical method for liquiritigenin content in licorice and the processing method for the enhancement of liquiritigenin content in licorice. Methods : Processing was accomplished by roasting licorice at $250^{\circ}C$ for indicated time periods (5-20 min). Analysis of liquiritigrnin from roasted licorice was conducted using UPLC(Ultra Performance Liquid Chromatography). Results : We established UPLC method for the analysis of liquiritigenin using water : acetonitrile gradient as mobile phase. Furthermore, we standardized the processing condition of licorice to enhance liquiritigenin content using UPLC method. Processing of licorice was accomplished by roasting at $250^{\circ}C$ for indicated time periods (5-20 min) and by pretreating with 50% of acetic acid or 30% ethanol for 24 h. By roasting licorice, the liquiritigenin contents in the licorice were increased. The best roasting time of licorice was 6 min, while roasting for the time above 8 min resulted in diminishing liquiritigenin contents. Moreover, pretreatment with 50% of acetic acid or 30% ethanol picked up liquiritigenin contents in roasted licorice. Conclusion : The adequate processing condition of licorice for the enhancement of liquiritigenin contents was obtained by pretreating licorice with 50% of acetic acid or 30% ethanol for 24 h and then by roasting at $250^{\circ}C$ for 6 min.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

따라서, 본 연구에서는 감초의 수치 중, 리퀴리티게닌의 함량 변화를 기준으로 한 炒甘草의 제조 및 규격화를 위한 기초적 연구를 위해 감초의 종류별 炒甘草 제조시 가열시간에 따른 리퀴리티게닌의 함량변화를 관찰하고자 하였다.
Liquiritin의 효능에 대해서는 특별히 보고된 바가 없으며, liquiritin은 체내에서 liquiritigenin으로 전환된다고 보고되어 있다²⁹⁾. 한편, liquiritigenin은 항산화작용이 보고되어 있으며³⁰⁾, 이외에도 항치매^31,32), 항균³³⁾, 항혈관 신생³⁴⁾, 항피부암³⁵⁾, 카드뮴유발독성완화²⁵⁾ 등의 활성을 가진 유용한 화합물임을 고려해 볼 때, 炒甘草로 제조에 있어서 지표성분으로 liquiritigenin이 적절하다고 사료되는 바, 본 연구에서는 liquiritigenin의 함량변화를 기준으로 하여, 감초의 종류, 가열시간에 따른 炒甘草로 제조방법을 표준화 하고자 하였다. 시중에서 구입한 1호 감초와 2호 감초, 2종류의 감초를 가열시간에 따라 炒甘草를 조제하여 liquiritigenin의 함량을 측정한 결과 가는 감초인 1호 감초의 liquiritigenin의 함량은 열처리를 하지 않은 감초 1150±24 ppm 보다 250℃에서 6분간 가열하였을 때 1265±44 ppm으로 약 6%가 증가하여 가장 많이 증가하였고, 6분 이상에서는 시간이 경과함에 따라 오히려 liquiritigenin의 함량이 줄어 드는 경향을 보였다(Fig.

가설 설정

(A) Liquiritigenin content of thin licorice was compared with that of thick licorice. (B) Thin licorice was roasted for the indicated time periods and extracted with MeOH as described in methods and materials to determine the content of liquiritigenin.

제안 방법

1×100)을 사용하였고, software는 Empower를 사용하였다. Column의 온도는 실온에서 분석하였다.
炒甘草의 liquiritigenin 함량을 증가시키기 위해 보료로 50% acetic acid와 30% ethanol을 사용하여 24시간 전처치 하였다. 보료로 처치된 감초와 보료처치 후에 250℃에서 6분간 가열한 炒甘草의 liquiritigenin 함량 변화를 조사한 결과, normal 감초에 비해 보료를 처치한 감초에서 liquiritigenin 함량이 높게 나타났으며 특히, 보료처치 후 6분간 가열한 炒甘草에서 유의하게 높은 함량의 liquiritigenin이 확인되었다(Fig.
炒甘草의 제조를 위한 수치장치는 시중에 판매하는 프라이팬을 LPG gas burner로 가열하였고 접촉면의 온도는 digital thermometer(KM 846, UK)를 사용하여 250℃로 조절하였다. 절단한 건조 감초는 50 g 씩 수치장치에 넣고 5분, 6분, 8분, 10분, 15분, 20분 동안 각각 열처리 하여, 가열시간에 따른 炒甘草의 분석 시료로 사용하였다.
감초의 지표화합물인 liquiritigenin의 분석을 용이하게 하기 위해 초고성능 액체크로마토그래피(UPLC)를 사용하여 다음과 같이 최적 분석조건을 확립하였다.
따로 Liquiritigenin 표준품 20 ㎎을 정밀하게 달아 메탄올을 넣어 정확하게 100 ㎖로 하여 표준원액으로 하고, 이를 순차적으로 2배씩 희석하여 검량선 작성용 표준 용액으로 하여 검량선을 작성하였다. 검액 및 표준액 2 ㎕씩을 가지고 다음과 같은 조건으로 시험하여 표준액의 검량선으colum로부터 Liquiritigenin의 량을 산출하였다. 초고성능액체크로마토그래피(UPLC)는 waters ACQUITY^TMultra performance LC system(USA)을 사용하였으며, waters ACQUITY^TM 296 photodiode array detector(PDA)와 waters ACQUITY^TM BEH C₁₈ column (1.
또한 용매 조성을 gradient로 달리하여 분석 시간 및 분리능을 고려한 최적의 분석조건을 위한 이동상을 확립하였다(Table 1). 검출파장의 최적화를 위해 검출파장에 따른 분석능을 검토하여 지표성분에 대한 민감한 분석법을 확립하였고 炒甘草로부터 분리한 liquiritigenin의 UPLC profile은 Fig. 1과 같다.
1% formic acid)을 첨가하여 분리능을 증가시켰다. 또한 용매 조성을 gradient로 달리하여 분석 시간 및 분리능을 고려한 최적의 분석조건을 위한 이동상을 확립하였다(Table 1). 검출파장의 최적화를 위해 검출파장에 따른 분석능을 검토하여 지표성분에 대한 민감한 분석법을 확립하였고 炒甘草로부터 분리한 liquiritigenin의 UPLC profile은 Fig.
절단한 건조 감초는 50 g 씩 수치장치에 넣고 5분, 6분, 8분, 10분, 15분, 20분 동안 각각 열처리 하여, 가열시간에 따른 炒甘草의 분석 시료로 사용하였다. 보료처치 炒甘草의 제조는 건조 감초 50 g에 50% acetic acid와 30% ethanol을 각각 15 ㎖씩 24시간 동안 처치하고 실온에서 건조한 후에 상기와 동일한 가열 방법으로 실행하였다.
유의성있는 검량선을 얻기 위해 적어도 3가지 이상의 농도에서 시험을 실시하였으며 regression equation을 y = ax+b (y와 x는 각각 peak 면적과 시료 함량)의 형태로 구하여 검량선을 작성하였다. 작성된 검량선은 R2의 값을 통하여 직선성을 판단하였으며, R2의 값이 0.
이동상으로 Table 1에서 보는 바와 같이 AcCN과 water를 그 조성 및 비율을 달리하여 최적의 분리조건을 확립하였으며 최적 농도의 산 (0.1% formic acid)을 첨가하여 분리능을 증가시켰다. 또한 용매 조성을 gradient로 달리하여 분석 시간 및 분리능을 고려한 최적의 분석조건을 위한 이동상을 확립하였다(Table 1).
炒甘草의 제조를 위한 수치장치는 시중에 판매하는 프라이팬을 LPG gas burner로 가열하였고 접촉면의 온도는 digital thermometer(KM 846, UK)를 사용하여 250℃로 조절하였다. 절단한 건조 감초는 50 g 씩 수치장치에 넣고 5분, 6분, 8분, 10분, 15분, 20분 동안 각각 열처리 하여, 가열시간에 따른 炒甘草의 분석 시료로 사용하였다. 보료처치 炒甘草의 제조는 건조 감초 50 g에 50% acetic acid와 30% ethanol을 각각 15 ㎖씩 24시간 동안 처치하고 실온에서 건조한 후에 상기와 동일한 가열 방법으로 실행하였다.
감초 및 炒甘草 중 liquiritigenin의 정량용 검액의 조제는 다음과 같은 방법으로 조제하였다. 즉, 감초 및 炒甘草의 가루를 각각 1 g씩 정밀하게 달아 삼각플라스크에 넣고 메탄올 70 ㎖을 넣어 5시간 동안 초음파 수출하여 여액을 여과하고, 다시 메탄올 30 ㎖을 넣어 5시간 동안 반복 추출하여 여액을 여과하여 정확하게 100 ㎖로 하여 검액으로 하였다. 표준액은 Liquiritigenin 표준품 20 ㎎을 정밀하게 달아 메탄올을 넣어 정확하게 100 ㎖로 하여 표준원액으로 하고, 2배씩 희석하여 사용하였다.
함량이 확인된 감초 추출물과 농도를 알고 있는 확정 유효성분 용액을 비율을 달리하여 혼합한 후 직선성이 확인된 농도구간에서 3회 측정하여 판단하였다.

대상 데이터

감초는 대구 수성구에 위치한 대원약업사에서 구입하여, 대한약전 감초 항에 적합한 것을 사용하였고¹⁾, voucher sample은 항온항습시설이 갖추어진 본교의 약재창고에 보관하였다.
1×100)을 사용하였고, software는 Empower를 사용하였다. 시료 추출에 사용된 추출기는 화신테크 power sonic 405 초음파 추출기를 사용하였다. 실험에 사용된 시약은 메탄올(HPLC용, JT BAKER), 아세토니트릴(HPLC용, JT BAKER) Formic acid(MERCK, Germany), 물(3차 증류수)을 사용하였다.
시료 추출에 사용된 추출기는 화신테크 power sonic 405 초음파 추출기를 사용하였다. 실험에 사용된 시약은 메탄올(HPLC용, JT BAKER), 아세토니트릴(HPLC용, JT BAKER) Formic acid(MERCK, Germany), 물(3차 증류수)을 사용하였다. 실험에 사용된 표준품 리퀴리틴, 리퀴리티게닌은 Wako (Japan)사의 제품을 구입하여 사용하였다.
실험에 사용된 시약은 메탄올(HPLC용, JT BAKER), 아세토니트릴(HPLC용, JT BAKER) Formic acid(MERCK, Germany), 물(3차 증류수)을 사용하였다. 실험에 사용된 표준품 리퀴리틴, 리퀴리티게닌은 Wako (Japan)사의 제품을 구입하여 사용하였다.
초고성능 액체크로마토그래피(UPLC)는 Waters ACQUITYTM ultra performance LC system (USA)을 사용하였으며, Waters ACQUITYTM photodiode array detector(PDA)와 Waters ACQUITYTM BEH C18 column (1.7㎛, 2.1×100)을 사용하였고, software는 Empower를 사용하였다.
초고성능액체크로마토그래피(UPLC)는 waters ACQUITYTM ultra performance LC system(USA)을 사용하였으며, waters ACQUITYTM 296 photodiode array detector(PDA)와 waters ACQUITYTM BEH C18 column (1.7㎛, 2.1×100)을 사용하였고, software는 Empower를 사용하였다.

데이터처리

윈도우용 SPSS 17.0을 사용하여 T-test 방식으로 분석하였으며, p값이 0.05 미만일 때, 통계적으로 유의하다고 판정하였다.

이론/모형

검체 중 Liquiritigenin의 정량은 상기 정량용 검액을 이용하여 자체 개발한 UPLC법(결과 참조)을 이용하여 측정하였다. 따로 Liquiritigenin 표준품 20 ㎎을 정밀하게 달아 메탄올을 넣어 정확하게 100 ㎖로 하여 표준원액으로 하고, 이를 순차적으로 2배씩 희석하여 검량선 작성용 표준 용액으로 하여 검량선을 작성하였다.

성능/효과

1호 감초(thin; Φ 0.7-1.2㎝)와 2호 감초(thick; Φ 1.2-1.5㎝)를 MeOH로 추출하여 분석한 결과, 1호 감초에서 1220±21 ppm, 2호 감초에서 1098±15 ppm의 liquiritigenin이 확인되어(Fig. 3A) 炒甘草 제조에는 1호 감초를 사용하였다.
50% acetic acid를 보료로 처치하였을 때 liquiritigenin 함량은 1103±26 ppm이었고, 50% acetic acid 처치 후 가열한 감초에서는 1127±11 ppm의 liquiritigenin이 확인되어 normal 감초의 1050±3 ppm에 비해 유의하게 (p<0.05) 증가되었다(Fig. 4A).
Liquiritigenin 표준품 0.2 ㎎/㎖을 5번 연속 분석하였을 때, 피크 면적의 측정 재현성은 상대표준편차(RSD) 0.65%로 우수하였으며, 머무름 시간의 재현성도 상대표준편차(RSD) 1.5%로 우수하였다.
가열시간의 변화에 의한 炒甘草 내의 liquiritigenin 함량변화는 Fig. 3B와 같으며, 250℃에서 6분간 가열하였을 때 1265±44 ppm의 liquiritigenin 함량을 나타내었고 열처리를 하지 않은 감초의 1150±24 ppm과 비교하여 평균적으로 가장 많은 함량 증가를 보였다.
따라서, liquiritigenin이 강화된 감초의 수치를 위해서는 보료와 가열을 동시에 하는 방법이 가장 적절할 것으로 사료된다. 더불어 초고성능액체크로마토그래프를 사용하여 상기의 방법으로 liquiritigenin을 분석하였을 때, 기존의 HPLC를 이용하여 분석하는 것보다 약 3배의 정도의 분석시간을 단축할 수 있 었다.
보료가 30% ethanol이었을 때는 보료 단독 처치에서 1193±8 ppm, 보료처치 후 가열한 감초에서 1267±14 ppm가 관찰되어 평균적으로 가열에 의해 liquiritigenin 함량이 증가하였고, 보료처치 후 가열한 감초는 normal 감초와 비교하였을 때 liquiritigenin 함량이 유의하게 (p<0.05) 증가되었다(Fig. 4B).
炒甘草의 liquiritigenin 함량을 증가시키기 위해 보료로 50% acetic acid와 30% ethanol을 사용하여 24시간 전처치 하였다. 보료로 처치된 감초와 보료처치 후에 250℃에서 6분간 가열한 炒甘草의 liquiritigenin 함량 변화를 조사한 결과, normal 감초에 비해 보료를 처치한 감초에서 liquiritigenin 함량이 높게 나타났으며 특히, 보료처치 후 6분간 가열한 炒甘草에서 유의하게 높은 함량의 liquiritigenin이 확인되었다(Fig. 4).
본 실험에서는 상관계수 r2=0.999로 양호한 직선성을 나타내어, Liquiritigenin의 정량분석에 양호한 검량선을 얻었다(Fig. 2).
시중에서 구입한 1호 감초와 2호 감초, 2종류의 감초를 가열시간에 따라 炒甘草를 조제하여 liquiritigenin의 함량을 측정한 결과 가는 감초인 1호 감초의 liquiritigenin의 함량은 열처리를 하지 않은 감초 1150±24 ppm 보다 250℃에서 6분간 가열하였을 때 1265±44 ppm으로 약 6%가 증가하여 가장 많이 증가하였고, 6분 이상에서는 시간이 경과함에 따라 오히려 liquiritigenin의 함량이 줄어 드는 경향을 보였다(Fig. 3B).
이상의 연구결과를 요약할 때 가는 감초를 250℃에서 6분간 가열하여 사용하였을 때 liquiritigenin의 함량이 최대가 되었고 50% acetic acid나 30% ethanol을 보료로 전처치한 후에 제조한 炒甘草에서 유의하게 liquiritigenin의 함량이 증가하였다. 50% acetic acid를 보료로 처리하였을 경우는 acetic acid에 의해서 liquiritin이 가수분해 되어 liquiritigenin으로 전환된 것으로 사료되며, 30% ethanol을 보료로 전처치한 후에 제조한 炒甘草에서 liquiritigenin의 함량이 증가하는 것은 30% ethanol의 처리에 의한 추출효율이 증가된 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	감초란?	감초(Licorice, Glycyrrhizae Radix et Rhizoma) 는 감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer), 광과감초 (Glycyrrhiza glabra Linne), 창과감초(Glycyrrhiza inflata Batal)의 뿌리 및 뿌리줄기로서 그대로 사용하거나 또는 주피를 제거 한 것으로1), 한의학에서 빈용되고 있는 약재중의 하나이다2,3). 감초는補脾益氣, 潤肺止咳, 緩急止痛, 淸熱解毒하는 효능이있으므로, 脾胃虛弱, 心虛動悸, 脈結代, 臟躁, 咳喘, 脘腹或四肢痙攣急疼痛, 咽喉腫痛, 식물이나 약물및 농약중독, 緩和藥性, 調和百藥에 이용되고 있다4).
	liquiritigenin의 효능은?	Liquiritin의 효능에 대해서는 특별히 보고된 바가 없으며, liquiritin은 체내에서 liquiritigenin으로 전환된다고 보고되어 있다29). 한편, liquiritigenin은 항산화작용이 보고되어 있으며30), 이외에도 항치매31,32), 항균33), 항혈관 신생34), 항피부암35), 카드뮴유발독성완화25) 등의 활성을 가진 유용한 화합물임을 고려해 볼 때, 炒甘草로 제조에 있어서 지표성분으로 liquiritigenin이 적절하다고 사료되는 바, 본 연구에서는 liquiritigenin의 함량변화를 기준으로 하여, 감초의 종류, 가열시간에 따른 炒甘草로 제조방법을 표준화 하고자 하였다. 시중에서 구입한 1호 감초와 2호 감초, 2종류의 감초를 가열시간에 따라 炒甘草를 조제하여 liquiritigenin의 함량을 측정한 결과 가는 감초인 1호 감초의 liquiritigenin의 함량은 열처리를 하지 않은 감초 1150±24 ppm 보다 250℃에서 6분간 가열하였을 때 1265±44 ppm 으로 약 6%가 증가하여 가장 많이 증가하였고, 6분 이상에서는 시간이 경과함에 따라 오히려 liquiritigenin의 함량이 줄어 드는 경향을 보였다(Fig.
	감초의 약리작용은?	약리작용으로는 진경작용, 진해작용, 항염증작용, 항궤양작용, 항알레르기작용, 중추억제작용, 부신피질호르몬작용, 성호르몬작용, 해독작용, 간장해개선작용, 항바이러스작용, interferon유도작용 등이 밝혀져 있다4-6). 감초의 성분은 glycyrrhizin, liquiritin, isoliquiritin, liquiritigenin, isoliquitigenin, glycyrol 등이 분리·보고되어 있고7,8), glycyrrhizin, liquiritin, liquiritin apioside, isoliquiritin, isoliquiritin apioside, liquiritigenin 등이 주성분으로 알려져 있다9).

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Kim YW, Zhao RJ, Park SJ, Lee JR, Cho IJ, Yang CH, Kim SG, Kim SC. Anti-inflammatory effects of liquiritigenin as a consequence of the inhibition of NF- ${\kappa}B$ -dependent iNOS and proinflammatory cytokines production, Br. J. Pharmacol. 2008;154:165-73.

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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