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문제 정의
- 골막기원세포의 증식과 조골세포로의 분화과정에서 덱사메타손 농도의 효과는 아직 잘 알려져 있지 않다. 이에 본 연구는 덱사메타손의 농도가 골막기원세포의 증식 및 조골세포로의 분화과정에 미치는 영향을 관찰하고자 한다.
- 본 연구에서는 골막기원세포의 증식 및 분화는 덱사메타 손이 포함된 골형성 유도 배지에서 더 활성을 나타내었다. 덱사메타손이 포함된 골형성 유도 배지중에서는 골막기원 세포의 증식은 100 nM의 덱사메타손 존재하에서 보다 10 nM의 덱사메타손 존재하에서 뚜렷하였으나 배양 후반기에 서는 덱사메타손이 포함된 골형성 유도 배지에서보다 덱사 메타손이 포함되지 않은 배지에서 더 증식되는 양상을 나타내었다.
제안 방법
- 다른 농도(0, 10, 100 nM)의 덱사메타손이 포함된 골형성 유도 배지에서 골막기원세포의 증식은 CCK-8 kit (Dojindo, Gaithersburg, USA)를 이용하여 분석하였다. 골막기원세포들을 5 X 103 cells/well의 밀도로 96-well plate에 주입하고 다른 농도(0, 10, 100 nM)의 덱사메타손이 포함된 골형성 유도 배지에서 37℃에서 1시간동안 well당 10 M CCK-8 solution으로 처리하여 2, 4, 7, 10, 13, 16, 19 그리고 21일째 세포 증식 양상을 관찰하였다.
- 다른 농도(0, 10, 100 nM)의 덱사메타손이 포함된 골형성 유도 배지에서 골막기원세포의 증식은 CCK-8 kit (Dojindo, Gaithersburg, USA)를 이용하여 분석하였다. 골막기원세포들을 5 X 103 cells/well의 밀도로 96-well plate에 주입하고 다른 농도(0, 10, 100 nM)의 덱사메타손이 포함된 골형성 유도 배지에서 37℃에서 1시간동안 well당 10 M CCK-8 solution으로 처리하여 2, 4, 7, 10, 13, 16, 19 그리고 21일째 세포 증식 양상을 관찰하였다.
- 무기질이 침착된 기질을 갈색으로 표현되게 하는 von kossa 염색을 통하여 골기질 형성정도를 평가하였다. 배양된 세포를 인산염 식염수로 세척하고 4% 포름알데히드로 10분간 고정하였다. 증류수로 세척한 후, 5% 질산은 용액으로 처리하고 30분간 암실에서 보관하였다.
- 6 N HCl로 탈회시킨다. 이후 o-cresolphthalein 방법 (o-cresolphthalein method, calcium C-test Wako, Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)을 이용하여 다양한 농도(0, 10, 100 nM)의 dexamethasone0] 포함된 골형성 유도 배지에서 골막기원세포에 의하여 형성된 칼슘에 대한 정량적 평가를 실시한다. 형성된 칼슘은 BCA protein assay kit (Pierce Chemical Co, Rockford, USA)를 이용하여 측정 한다.
- 다른 농도(0, 10, 100 nM)의 덱사메타손 존재하에서 골막기원세포의 증식 양상을 배양 2, 4, 7, 10, 13, 16, 그리고 21일째 분석하였다. 골막기원세포는 덱사메타손이 존재하든, 존재하지 않든 배양 16일째까지 증식되는 양상을 나타내었으며 특히 100 nM의 덱사메타손의 존재하에서 보다 10 nM의 덱사메타손 존재하에서 그 증식 양상이 뚜렷함을 알 수 있었다.
- 다른 농도(0, 10, 100 nM)의 덱사메타손 존재하에서 골막기원세포에서 발현되는 알칼리 성 인산분해 효소의 양상 및 그 활성도를 배양 10일째 관찰하였다. 덱사메타손을 포함하는 골형성 유도 배지에서 알칼리성 인산분해효소의 발현은 나타났으며 10 nM의 덱사메타손의 존재하에서 보다 100 nM의 덱사메타손 존재하에서 알칼리성 인산분해효소는 골막기원세포에서 뚜렷하게 발현되었다 (Fig.
- 다른 농도(0, 10, 100 nM)의 덱사메타손 존재하에서 골막기원세포에서 형성되는 골기질 정도는 von kossa 염색과 칼슘량의 측정을 통하여 배양 21일째에 정성적 및 정량적으로 분석하였다. 무기질이 침착되어 갈색으로 인기되어 의미있는 골기질 형성을 나타내는 von kossa 양성 골기질은 10 nM의 덱사메타손의 존재하에서 보다 100 nM의 덱사 메타손 존재하에서 뚜렷하였다 (Fig.
- 골 전구세포를 성숙한 조골세포로 분화시키는 과정을 응용하는 골 조직공학이 지난 십여년 전부터 많이 보고되고 있다. 본 연구에서는 조골세포의 원천으로 치과적으로 국소 마취하에 매복치 발치등을 포함한 일반적인 시술을 통하여 쉽게 채취할 수 있는 골막에서 골막기원세포를 추출하여 분 화시켰다. 외래 환자에서 골결손 부위와 상대적으로 덜 관계된 부위에서 국소마취하에 적은양의 골관련 절편을 쉽게 채취하고 이를 통하여 관련 세포를 추출하고 증식시켜며 분 화시키는 것이 골조직공학의 본연의 장점임을 고려할 때, 구강내 일반적인 시술을 통하여 쉽게 채취할 수 있는 골막에서 골막기원세포를 추출하여 조골세포로 분화시키는 작업 은 분명 골 조직공학의 본연의 장점을 충분히 가진다고 할 수 있을 것이다.
- 여긴다. 무기질 침착과 관련하여서는 von kossa 양성 염색 및 기질내 칼슘의 정량적 측정이 관련된 세포에 의하여 형성된 무기질 정도를 평가하여준다.
- 본 연구에서도 이러한 점을 고려하여 알칼리성 인산분해효소의 발현은 배양 10일째, 그리고 von kossa 양성 염색 및 기질내 칼슘의 정량적 측정은 배양 21일째에 시행하였다.
- 경상대학교 병원의 윤리위원회를 따르고 환자 동의하에 매복된 하악 제3대구치의 발치과정에서 5×20 mm의 골막을 채취하여 일차배양 및 계대배양을 실시하고 passage 3을 거친 골막기원세포를 50μg/ml L-ascorbic acid 2- phosphate, 10 mMglycerophosphate, 그리고 다양한 농도(0, 10, 100 nM)의 덱사메타손이 포함된 골형성 유도 배지에서 21일간 배양하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 무기질이 침착된 기질을 갈색으로 표현되게 하는 von kossa 염색을 통하여 골기질 형성정도를 평가하였다. 배양된 세포를 인산염 식염수로 세척하고 4% 포름알데히드로 10분간 고정하였다.
성능/효과
- 다른 농도(0, 10, 100 nM)의 덱사메타손 존재하에서 골막기원세포의 증식 양상을 배양 2, 4, 7, 10, 13, 16, 그리고 21일째 분석하였다. 골막기원세포는 덱사메타손이 존재하든, 존재하지 않든 배양 16일째까지 증식되는 양상을 나타내었으며 특히 100 nM의 덱사메타손의 존재하에서 보다 10 nM의 덱사메타손 존재하에서 그 증식 양상이 뚜렷함을 알 수 있었다. 그러나 배양 16일 이후, 골막기원세포는 덱사메타손이 존재하지 않는 경우에서 더 증식됨을 관찰하였 다 (Fig.
- 다른 농도(0, 10, 100 nM)의 덱사메타손 존재하에서 골막기원세포에서 발현되는 알칼리 성 인산분해 효소의 양상 및 그 활성도를 배양 10일째 관찰하였다. 덱사메타손을 포함하는 골형성 유도 배지에서 알칼리성 인산분해효소의 발현은 나타났으며 10 nM의 덱사메타손의 존재하에서 보다 100 nM의 덱사메타손 존재하에서 알칼리성 인산분해효소는 골막기원세포에서 뚜렷하게 발현되었다 (Fig. 2).
- 알칼리성 인산분해효소의 조직화학적 발현양상과 유사하게, 골막기원세포에서 나타나는 알칼리성 인산분해효소의 활성도 또한 10 nM의 덱사메타손의 존재하에서 보다 100 nM의 덱사메타손 존재하에서 증가되었다 (Fig. 3).
- 정량적인 칼슘량도 골형성 유도 배지에서 관찰되었으며 그 양상은 von kossa 염색과 유사하게 10 nM의 덱사메타손의 존재하에서 보다 100 nM의 덱사메타손 존재하에서 214배 정도 더 증가되었음을 관찰하였다 (Fig. 5).
- Li 등31)은 마우스의 골수기질에서 클로닝한 세포주인 이의 배양시 덱사메타손 의 적용은 골형성으로의 분화 저하 및 지방형성으로의 분화 촉진을 유발한다고 하였다. 특히 조기 조골세포의 표지자로 알려진 Runx2/core binding factor alpha 1의 발현이고 농도의 덱사메타손 존재하에서 매우 약하게 발현됨을 관찰하였다. 이와 같이 실험동물이 유사한 경우에도 상반되는 결과들이 보고되는 것은 덱사메타손이 적용되는 시간, 적용되는 양, 그리고 실험에 사용되는 해당 세포들의 밀도등 여러 가지 요인이 작용한다고 할 수 있을 것이다.
- 본 연구에서는 조골세포의 원천으로 치과적으로 국소 마취하에 매복치 발치등을 포함한 일반적인 시술을 통하여 쉽게 채취할 수 있는 골막에서 골막기원세포를 추출하여 분 화시켰다. 외래 환자에서 골결손 부위와 상대적으로 덜 관계된 부위에서 국소마취하에 적은양의 골관련 절편을 쉽게 채취하고 이를 통하여 관련 세포를 추출하고 증식시켜며 분 화시키는 것이 골조직공학의 본연의 장점임을 고려할 때, 구강내 일반적인 시술을 통하여 쉽게 채취할 수 있는 골막에서 골막기원세포를 추출하여 조골세포로 분화시키는 작업 은 분명 골 조직공학의 본연의 장점을 충분히 가진다고 할 수 있을 것이다. 조직공학적 방법을 통한 골형성에 있어서 골막기원세포가 가지는 또다른 장점으로는 공여자의 연령이 조골세포로의 기능적 분화에 크게 영향을 미치지 않는다는 점이다.
- 본 연구에서는 골막기원세포의 증식 및 분화는 덱사메타 손이 포함된 골형성 유도 배지에서 더 활성을 나타내었다. 덱사메타손이 포함된 골형성 유도 배지중에서는 골막기원 세포의 증식은 100 nM의 덱사메타손 존재하에서 보다 10 nM의 덱사메타손 존재하에서 뚜렷하였으나 배양 후반기에 서는 덱사메타손이 포함된 골형성 유도 배지에서보다 덱사 메타손이 포함되지 않은 배지에서 더 증식되는 양상을 나타내었다. 골막기원세포의 조골세포로의 분화과정과 관련하여서는 10 nM의 덱사메타손의 존재하에서 보다 100 nM 의 덱사메타손 존재하에서 알칼리성 인산분해효소의 발현 및 그 활성도가 증가되었다.
- 덱사메타손이 포함된 골형성 유도 배지중에서는 골막기원 세포의 증식은 100 nM의 덱사메타손 존재하에서 보다 10 nM의 덱사메타손 존재하에서 뚜렷하였으나 배양 후반기에 서는 덱사메타손이 포함된 골형성 유도 배지에서보다 덱사 메타손이 포함되지 않은 배지에서 더 증식되는 양상을 나타내었다. 골막기원세포의 조골세포로의 분화과정과 관련하여서는 10 nM의 덱사메타손의 존재하에서 보다 100 nM 의 덱사메타손 존재하에서 알칼리성 인산분해효소의 발현 및 그 활성도가 증가되었다. Von kossa 양성 골기질 정도 및 기질내 형성된 칼슘량도 10 nM의 덱사메타손의 존재하 에서 보다 100 nM의 덱사메타손 존재하에서 더 증가되었음을 관찰하였다.
- 골막기원세포의 조골세포로의 분화과정과 관련하여서는 10 nM의 덱사메타손의 존재하에서 보다 100 nM 의 덱사메타손 존재하에서 알칼리성 인산분해효소의 발현 및 그 활성도가 증가되었다. Von kossa 양성 골기질 정도 및 기질내 형성된 칼슘량도 10 nM의 덱사메타손의 존재하 에서 보다 100 nM의 덱사메타손 존재하에서 더 증가되었음을 관찰하였다.
- 나노몰 단위에서 더 다양한 농도의 덱사메타손이 적용되지는 않았지만, 본 연구를 통하여 세포배양과 관련된 일반적인 생리학적용량으로 적용될 경우, 덱사메타손은 골막기원세포의 분화를 촉진시키는 촉매제로 작용할 수 있음을 관찰하였으며 골막기원세포의 증식은 덱사메타손의 농도에 비례하지 않는 것을 알 수 있다.
- 2. 10 nM의 덱사메타손의 존재하에서 보다 100 nM의 덱사메타손 존재하에서 골막기원세포에서 발현되는 알칼리성 인산분해효소 및 그 활성도가 증가되었다.
- 3. Von kossa 양성 골기질 정도 및 골막기원세포에 의하여 형성된 기질내 칼슘의 정량화 정도는 10 nM의 덱사메타손의 존재하에서 보다 100 nM의 덱사메타손 존재하에서 증가된 양상을 나타내었다.
- 1. 골막기원세포는 덱사메타손이 존재하던, 존재하지 않던 배양 16일째까지 증식되는 양상을 나타내었으며 특히 100 nM의 덱사메타손의 존재하에서 보다 10 nM 의 덱사메타손 존재하에서 그 증식 양상이 증가되었다
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