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문제 정의
- 정상군에 비해 대조군과 용매대조군은 유의하게 높았고, 양성대조군과 백작약 열수추출물 도포군은 대조군과 용매대조군에 비해 유의하게 낮았다. 이를 통해 백작약 열수추출물이 자외선에 의해 생성된 MMP의 발현을 억제시키는 효과가 있음을 확인하였으며 이와 같은 결과는 육안적, 조직학적 결과를 뒷받침해 준다.
- 피부조직의 MMP-3 발현량을 측정한 결과 정상군에 비해 대조군과 용매대조군은 유의하게 높은 반면, 양성대조군과 백작약 열수추출물 도포군은 대조군과 용매대조군에 비해 유의하게 낮았다. 이를 통해 백작약 열수추출물이 자외선에 의해 생성된 MMP의 발현을 억제시키는 효과가 있음을 확인하였으며 이와 같은 결과는 육안적, 조직학적 소견을 뒷받침해 준다.
제안 방법
- 상층액을 취한 후 isopropyl alcohol을 500 μL 첨가한 다음 15,000 rpm, 4°C, 15분간 원심분리 후 상층액은 제거하고 70% ethanol 1 mL을 첨가하여 RNA pellet을 washing하고 15,000 rpm, 4°C, 2분간 원심분리하여 나온 상층액은 제거하고 남은 RNA pellet을 실온에서 건조 후 diethylpyrocarbonate (DEPC)로 희석하여 260 nm에서 OD값을 측정하여 RNA를 정량하였다. 280 nm에서 OD값을 측정하고 absorbance ratio (A260/A280)가 1.8~2.0 사이인지 확인하였다.
- 4주째 되는 날에 에테르로 가볍게 마취를 하고 디지털 카메라로 사진 촬영을 한 후 replica를 떠서 도립현미경으로 주름의 형태를 관찰하였다.
- BioNEER사의 cycleScript RT PreMix kit에서 제공하는 protocol에 따라 total RNA 양이 0.1~1 μg/μL가 되도록 RNA sample을 넣고 DEPC를 20 μL까지 채운 후 30°C에서 1분간, 50℃에서 4분간 12 cycle 반응시키고 95°C에서 5분간 가열하여 반응을 종결시켰다.
- Primer는 대조군으로 GAPDH (57°C, 35 cycle), 실험군으로 MMP-3 (60°C, 35 cycle)를 사용하였으며 사용된 primer들의 염기서열은 Table 1과 같다.
- Retinoic acid는 polyethylene glycol에 0.01%로 희석하여 1일 2회, 주 6일, 4주 동안 매회 200 μL씩 도포하였다.
- Template 2 μL, forward primer와 reverse primer (10 pmole/L, BioNEER, Korea)를 각각 1.4 μL, 멸균된 증류수 15.2 μL를 섞고 PCR 반응(Bio-RAD, MycyclerTM thermal cycler, USA)을 실시하였다.
- Primer는 대조군으로 GAPDH (57°C, 35 cycle), 실험군으로 MMP-3 (60°C, 35 cycle)를 사용하였으며 사용된 primer들의 염기서열은 Table 1과 같다. Tris-acetate ethylenediaminetetra acetic acid(TAE) buffer를 이용하여 1.5% agarose gel에 전기 영동시켜 ethidium bromide에 염색한 후 수세하고 UV를 조사하여 DNA band를 확인하였고 Gel Logic 100 Imaging System (Kodak, USA)을 이용하여 발현량을 수치화하여 통계처리 하였다.
- 광노화 유발과 병행하여 백작약 열수추출물 (0.130 g/kg BW/day), 용매, saline은 1일 2회, 주 6일, 4주 동안 매회 200 μL씩 도포하였다.
- 실험군은 정상군(normal group, N): 아무런 처치를 하지 않은 군, 대조군(control group, C): 자외선 조사+Sq-OOH 도포+saline 도포군, 용매대조군(vehicle control group, VC): 자외선 조사+Sq-OOH 도포+용매 (100% 에탄올+jojoba oil+물) 도포군, 양성대조군(positive control group, PC): 자외선 조사+Sq-OOH 도포+0.01% retinoic acid 도포군, 실험군(experimental group, E): 자외선 조사+Sq-OOH 도포+백작약 열수추출물 도포군, 총 5개군으로 나누어 실험하였다.
- 사육실은 온도 22±1°C, 상대습도 50±5%, 조명주기 12시간씩 명암을 유지하였다. 실험동물은 실험 4주째 되는 날 에테르로 마취한 후 피부를 적출한 후 일부는 10% 중성 포르말린 용액에 고정하여 조직학적 검사에 사용하였고나머지는 냉동 보관하여 효소활성 측정 및 유전자 발현분석에 사용하였다.
- 추출물 무 첨가구에는 시료 대신 ethanol 1 mL를 첨가하여 동일하게 실험하고 추출물 첨가구에 대한 흡광도의 감소비율로 전자공여능을 나타내었다. 양성 대조군으로 합성 항산화제인 BHT (dibutylated hydroxytoluene)를 동일한 방법으로 실험하여 추출물이 가지는 환원력과 비교하였으며, 다음 식으로 전자공여능(%)을 구하였다.
- 이에 본 연구는 hairless 마우스에 UVB를 반복적으로 조사하고 squalene monohydroperoxide (SqOOH)를 반복 도포하여 피부노화를 유발시키고, 이와 병행하여 백작약 열수추출물을 도포하여 피부의 육안적, 조직학적, 생화학적 분자생물학적 관찰을 통하여 피부노화 억제 효과를 확인하였다.
- 자외선 조사장치의 광원은 302 nm의 UVB를 방출하는 sunlamp를 사용하였다. 자외선 조사량은 UV-radiometer로 측정하였으며, 마우스를 자외선 조사용 cage에 가둔 후 등 부위에 균등하게 120 mJ/cm2의 광량으로 격일 간격으로 1주일에 3회, 4주 동안 조사하였다. 피부거침과 주름형성을 촉진하기 위하여 Sq-OOH를 1일 2회, 주 6일, 4주 동안 매회 100 μL씩 도포하였다.
- 절취한 피부조직을 실온에서 10% 중성 포르말린용액에 24시간 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투과정을 거친 다음 파라핀으로 포매하고 4 μm 두께로 절편을 만들어 Van Gieson 용액으로 감별염색, 탈수, 투명, 봉입 후 진피층 내 교원섬유의 형태 및 양을 광학현미경으로 관찰하였다.
- 절취한 피부조직을 실온에서 10% 중성 포르말린용액에 24시간 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투과정을 거친 다음 파라핀으로 포매하고 4 μm 두께로 절편을 만들어 Verhoeff 용액에 염색 후 수세, ferric chloride 2%로 감별 수세 후 sodium thiosulfate에 처리하여 Van Gieson 용액으로 감별염색 후 피부 진피층 내 탄력섬유의 변화, 소실 등을 광학현미경으로 관찰하였다.
- 피부거침과 주름형성을 촉진하기 위하여 Sq-OOH를 1일 2회, 주 6일, 4주 동안 매회 100 μL씩 도포하였다.
대상 데이터
- BioNEER사의 Accupower PCR PreMix kit를 구입하여 사용하였다. Template 2 μL, forward primer와 reverse primer (10 pmole/L, BioNEER, Korea)를 각각 1.
- Hydrogen peroxide는 Junsei 사(Japan)의 제품을, hematoxylin, bovine serum albumin, retinoic acid, polyethylene glycol은 Sigma 사 (USA)의 제품을, squalene은 Acros 사(USA)의 제품을 사용하였으며 그 외 일반시약들은 특급품을, 조조바 오일(jojoba oil)은 Desert Whale 사(USA)의 제품을 사용하였다.실험기기 중 자외선 조사장치는 UVB sunlamp(UVM-225D, Mineralight Lamp UVP, USA)를, 자외선 측정장치는 UV-radiometer (HD 9021, Delta OHM, Italy)를 사용하였고 시료추출은 초고속 감압 저온 추출기(COSMOS-660, 경서 기계 산업, 한국)를 사용하였다.
- 경북 의성에서 재배한 유기농 백작약 600 g을 구입하여 물 6 L를 가하여 초고속 감압 저온 추출기로 열수 추출한 후 5 L의 양을 얻었다. 5 L의 양을 농축 용기에 담아 2 L로 농축하였고 파우치 진공포장 후 냉장 보관하여 실험에 사용하였다.
- 4%였다. 백작약 열수추출물 10 mL+jojoba oil 1 mL+100% 에탄올 2.5 mL+물 6.5 mL 비율로 혼합하여 백작약 열수추출물 시료로 사용하였다.
- Hydrogen peroxide는 Junsei 사(Japan)의 제품을, hematoxylin, bovine serum albumin, retinoic acid, polyethylene glycol은 Sigma 사 (USA)의 제품을, squalene은 Acros 사(USA)의 제품을 사용하였으며 그 외 일반시약들은 특급품을, 조조바 오일(jojoba oil)은 Desert Whale 사(USA)의 제품을 사용하였다.실험기기 중 자외선 조사장치는 UVB sunlamp(UVM-225D, Mineralight Lamp UVP, USA)를, 자외선 측정장치는 UV-radiometer (HD 9021, Delta OHM, Italy)를 사용하였고 시료추출은 초고속 감압 저온 추출기(COSMOS-660, 경서 기계 산업, 한국)를 사용하였다. Replica 표본관찰은 inverted microscope (Axiovert 200, Carl Zeiss, Germany), 조직표본관찰은 light microscope (CX41, Olympus, Japan)를 사용하였다.
- 실험동물은 6주령 SKH-1 hairless mouse (Charles-River, Japan)를 분양받아 1주일간 사육실에서 적응시킨 후 실험 전 기간 동안 사료와 물은 자유로이 공급하였다. 사육실은 온도 22±1°C, 상대습도 50±5%, 조명주기 12시간씩 명암을 유지하였다.
- 자외선 조사장치의 광원은 302 nm의 UVB를 방출하는 sunlamp를 사용하였다. 자외선 조사량은 UV-radiometer로 측정하였으며, 마우스를 자외선 조사용 cage에 가둔 후 등 부위에 균등하게 120 mJ/cm2의 광량으로 격일 간격으로 1주일에 3회, 4주 동안 조사하였다.
데이터처리
- Values with different superscripts in the same row are significantly different (p⁄0.05) by Duncan’s multiple range test.
- 각 그룹 간의 차이를 검증하기 위하여 Duncan’s multiple range test를 이용하여 사후분석을 실시하였고 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
- 통계적 분석은 SPSS WIN (v14.0)를 이용하여 정상군, 대조군, 용매대조군, 양성대조군, 백작약 열수추출물 도포군 간의 차이를 비교하기 위하여 일원 배치분산분석 (one-way ANOVA)으로 검증하였다. 각 그룹 간의 차이를 검증하기 위하여 Duncan’s multiple range test를 이용하여 사후분석을 실시하였고 p값이 0.
이론/모형
- 실험기기 중 자외선 조사장치는 UVB sunlamp(UVM-225D, Mineralight Lamp UVP, USA)를, 자외선 측정장치는 UV-radiometer (HD 9021, Delta OHM, Italy)를 사용하였고 시료추출은 초고속 감압 저온 추출기(COSMOS-660, 경서 기계 산업, 한국)를 사용하였다. Replica 표본관찰은 inverted microscope (Axiovert 200, Carl Zeiss, Germany), 조직표본관찰은 light microscope (CX41, Olympus, Japan)를 사용하였다.
- 백작약 열수추출물에 대한 전자공여능은 Blois(1958)의 방법으로 측정하였다. 동결건조시킨 백작약 열수추출물 분말을 100, 500, 1,000 μg/mL의 농도로 ethanol에 녹여 조제하고 1 mL를 test tube에 취하였다.
- 피부조직 중 CAT 활성도는 hydrogen peroxide를 기질로 하여 환원되는 정도를 파장 240 nm에서 그 흡광도를 읽고 분자흡광계수(E=0.04 mM-1cm-1)를 이용하여 활성을 산출하는 Aebi (1974)의 방법에 준하였다. 활성도 단위는 피부조직 중에 함유된 단백질 1 mg이 1분 동안 반응하여 감소되는 hydrogen peroxide 양을 nmole로 표시하였다.
- 피부조직 중 SOD의 활성도는 hematoxylin 자동산화의 억제정도를 관찰하는 Martin et al. (1987)의 방법에 따라 0.1 mM EDTA가 함유된 50 mM 인산완충액(pH 7.5)에 10 μM hematoxylin 및 효소액을 가해 25°C에서 반응시켜 생성된 hematein을 560 nm에서 측정하여 효소의 활성도를 산정하였다.
- 피부조직 중 XO의 활성도는 xanthine을 기질로 사용하여 30°C에서 20분간 반응시켜 생성된 요산을 292 nm에서 흡광도를 측정하는 Stripe and Della(1969)의 방법에 준하여 측정하였다.
- 피부조직 중 단백질 함량은 Lowry et al. (1951)의 방법에 따라 bovine serum albumin을 표준품으로 사용하여 측정하였다.
성능/효과
- 백작약 열수추출물의 in vitro에서 항산화능을 측정한 결과 양성대조군인 BHT와 같이 백작약 열수추출물은 농도-의존성 반응을 보였으며, 1,000 ppm에서 약 75%의 높은 전자공여능을 보여 항산화능이 매우 우수한 것으로 확인되었다. In vivo에서의 항산화 능을 알아보기 위해서 유해산소 대사효소 활성변동을 측정한 결과, 대조군의 경우 정상군에 비해 XO 활성의 유의한 증가와 함께 SOD와 CAT 활성의 감소를 나타내 UVB 조사와 Sq-OOH 도포로 인해 활성산소의 생성을 높게 하고 이들 생성된 활성산소를 제거하기 위해 해독계 효소가 많이 사용됨으로써 항산화 방어기구의 불균형을 가져와 산화스트레스가 심함을 알 수 있었다. 반면, 백작약 열수추출물 도포군은 대조군에 비해 XO 활성은 유의하게 낮았고 SOD와 CAT 활성은 현저하게 높게 나타나 우수한 항산화 효과가 있음을 확인하였다.
- 조직학적 소견에서, 대조군은 피부 진피층 내 교원섬유가 파괴되어 밀도가 엉성하고 배열이 불규칙적이고 양도 많이 줄어있는 반면, 양성대조군과 백작약 열수추출물 도포군은 대조군에 비해 교원섬유의 밀도가 조밀하고 배열도 규칙적으로 나타났다. 또한, 대조군은 다량의 변성되어 엉긴 탄력섬유가 군데군데 축적되어 있었고 양성대조군과 백작약 열수추출물 도포군은 대조군에 비해 변성되어 엉긴 탄력섬유의 양이 줄어 있었다. 이와 같은 조직학적 소견은 육안적인 주름양상의 차이를 뒷받침해 주는 결과로써 백작약 열수추출물이 피부주름 억제/개선에 효과적임을 확인할 수 있었다.
- In vivo에서의 항산화 능을 알아보기 위해서 유해산소 대사효소 활성변동을 측정한 결과, 대조군의 경우 정상군에 비해 XO 활성의 유의한 증가와 함께 SOD와 CAT 활성의 감소를 나타내 UVB 조사와 Sq-OOH 도포로 인해 활성산소의 생성을 높게 하고 이들 생성된 활성산소를 제거하기 위해 해독계 효소가 많이 사용됨으로써 항산화 방어기구의 불균형을 가져와 산화스트레스가 심함을 알 수 있었다. 반면, 백작약 열수추출물 도포군은 대조군에 비해 XO 활성은 유의하게 낮았고 SOD와 CAT 활성은 현저하게 높게 나타나 우수한 항산화 효과가 있음을 확인하였다. 이와 같은 결과는 조직학적 관찰에서 백작약 열수추출물 도포군이 대조군에 비해 피부 손상을 적게 초래한 일련의 결과와 부합한다.
- 양성대조군인 BHT와 같이 백작약 열수추출물은 농도가 증가함에 따라 활성이 증가하는 농도-의존성 반응을 나타냈다. 백작약 열수추출물은 1,000 ppm에서 약 75%의 높은 전자공여능을 보여 항산화능이 매우 우수한 것으로 확인되었다.
- 백작약 열수추출물의 in vitro에서 항산화능을 측정한 결과 양성대조군인 BHT와 같이 백작약 열수추출물은 농도-의존성 반응을 보였으며, 1,000 ppm에서 약 75%의 높은 전자공여능을 보여 항산화능이 매우 우수한 것으로 확인되었다. In vivo에서의 항산화 능을 알아보기 위해서 유해산소 대사효소 활성변동을 측정한 결과, 대조군의 경우 정상군에 비해 XO 활성의 유의한 증가와 함께 SOD와 CAT 활성의 감소를 나타내 UVB 조사와 Sq-OOH 도포로 인해 활성산소의 생성을 높게 하고 이들 생성된 활성산소를 제거하기 위해 해독계 효소가 많이 사용됨으로써 항산화 방어기구의 불균형을 가져와 산화스트레스가 심함을 알 수 있었다.
- 유해산소를 생성하는 효소인 XO는 정상군에 비해 대조군은 유의하게 높았다. 백작약 추출물 도포군은 정상군과 유의한 차이가 없었으며 대조군, 용매대조군, 양성대조군에 비해 유의하게 낮았다. 유해산소를 제거하는 효소인 SOD와 CAT는 대조군, 용매대조군, 양성대조군은 정상군에 비해 감소하였고, 백작약 열수추출물 도포군은 정상군과 비슷한 수치를 나타내었다.
- 본 연구에서 육안적인 피부 주름 양상과 피부노화 관련지표들을 분석한 결과를 종합해 보면, 백작약 열수추출물은 피부주름 개선에 있어서 효능이 검증된 retinoic acid와 비슷한 수준으로 피부노화 억제/개선 효과가 있는 것으로 확인되었다. 따라서 백작약 열수추출물은 피부노화 억제/개선 물질로서의 이용가능성이 높을 것으로 생각된다.
- 정상군은 탄력섬유의 형태가 일정하고 배열이 규칙적인 반면, 대조군은 변성되어 엉긴 교원섬유가 군데군데 다량으로 축적되어 있는 elastosis 소견을 보였다. 양성대조군과 백작약 열수추출물 도포군은 대조군에 비해 변성된 탄력섬유의 양이 많이 줄어있음을 확인하였다.
- 적출한 피부조직에서 유해산소 대사효소 활성변동을 측정한 결과는 Table 2와 같다. 유해산소를 생성하는 효소인 XO는 정상군에 비해 대조군은 유의하게 높았다. 백작약 추출물 도포군은 정상군과 유의한 차이가 없었으며 대조군, 용매대조군, 양성대조군에 비해 유의하게 낮았다.
- 백작약 추출물 도포군은 정상군과 유의한 차이가 없었으며 대조군, 용매대조군, 양성대조군에 비해 유의하게 낮았다. 유해산소를 제거하는 효소인 SOD와 CAT는 대조군, 용매대조군, 양성대조군은 정상군에 비해 감소하였고, 백작약 열수추출물 도포군은 정상군과 비슷한 수치를 나타내었다. 이와 같은 결과는 백작약 열수추출물이 활성산소의 생성을 줄이고 생성된 활성산소의 제거를 촉진시키는 효과가 있음을 의미한다.
- 또한, 대조군은 다량의 변성되어 엉긴 탄력섬유가 군데군데 축적되어 있었고 양성대조군과 백작약 열수추출물 도포군은 대조군에 비해 변성되어 엉긴 탄력섬유의 양이 줄어 있었다. 이와 같은 조직학적 소견은 육안적인 주름양상의 차이를 뒷받침해 주는 결과로써 백작약 열수추출물이 피부주름 억제/개선에 효과적임을 확인할 수 있었다.
- 1과 같다. 정상군과 비교할 때 대조군은 주름 능선의 두께가 굵고 간격이 넓으며 주름이 깊게 형성된 반면, retinoic acid를 도포한 양성대조군과 백작약 열수추출물 도포군은 상대적으로 주름 능선의 두께가 얇고 간격이 좁으며 주름이 얕게 형성되어 있어 비교적 정상군에 가까운 양상을 띠고 있었다. Lee et al.
- 5와 같다. 정상군에 비해 대조군과 용매대조군은 유의하게 높았고, 양성대조군과 백작약 열수추출물 도포군은 대조군과 용매대조군에 비해 유의하게 낮았다. 이를 통해 백작약 열수추출물이 자외선에 의해 생성된 MMP의 발현을 억제시키는 효과가 있음을 확인하였으며 이와 같은 결과는 육안적, 조직학적 결과를 뒷받침해 준다.
- 2와 같다. 정상군은 교원섬유의 밀도가 조밀하고 배열이 규칙적인 반면, 대조군은 교원섬유가 파괴되어 밀도가 엉성하고 양이 많이 줄어들어 있었다. 양성대조군과 백작약 열수추출물 도포군은 정상군에 가까운 양상을 보였다.
- 피부 주름의 양상을 비교하기 위하여 replica를 떠서 도립현미경으로 관찰한 결과 UVB 조사와 Sq-OOH를 도포한 대조군은 깊이가 깊고 선이 굵은 주름이 형성되었고 retinoic acid를 도포한 양성대조군과 백작약 열수추출물을 도포한 실험군은 주름의 선이 얇고 깊이가 얕게 나타났다. 조직학적 소견에서, 대조군은 피부 진피층 내 교원섬유가 파괴되어 밀도가 엉성하고 배열이 불규칙적이고 양도 많이 줄어있는 반면, 양성대조군과 백작약 열수추출물 도포군은 대조군에 비해 교원섬유의 밀도가 조밀하고 배열도 규칙적으로 나타났다. 또한, 대조군은 다량의 변성되어 엉긴 탄력섬유가 군데군데 축적되어 있었고 양성대조군과 백작약 열수추출물 도포군은 대조군에 비해 변성되어 엉긴 탄력섬유의 양이 줄어 있었다.
- 피부 주름의 양상을 비교하기 위하여 replica를 떠서 도립현미경으로 관찰한 결과 UVB 조사와 Sq-OOH를 도포한 대조군은 깊이가 깊고 선이 굵은 주름이 형성되었고 retinoic acid를 도포한 양성대조군과 백작약 열수추출물을 도포한 실험군은 주름의 선이 얇고 깊이가 얕게 나타났다. 조직학적 소견에서, 대조군은 피부 진피층 내 교원섬유가 파괴되어 밀도가 엉성하고 배열이 불규칙적이고 양도 많이 줄어있는 반면, 양성대조군과 백작약 열수추출물 도포군은 대조군에 비해 교원섬유의 밀도가 조밀하고 배열도 규칙적으로 나타났다.
- 피부조직의 MMP-3 발현량을 측정한 결과 정상군에 비해 대조군과 용매대조군은 유의하게 높은 반면, 양성대조군과 백작약 열수추출물 도포군은 대조군과 용매대조군에 비해 유의하게 낮았다. 이를 통해 백작약 열수추출물이 자외선에 의해 생성된 MMP의 발현을 억제시키는 효과가 있음을 확인하였으며 이와 같은 결과는 육안적, 조직학적 소견을 뒷받침해 준다.
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