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문제 정의
- 본 연구에서는 PRA가 악성흑색종 세포에 대하여 피부 탄력 유지와 관련 있는 Elastase 저해 활성을 가지는지, 또한, Melanin 생합성 저해를 통하여 피부 미백효과를 발휘할 수 있는지를 살펴보기 위하여 악성흑색종 세포인 B16F10 세포에 PRA를 처리하고 생존율과 생육 양상을 관찰하고, Melanin 생성량과 Tyrosinase 저해 활성, Elastase에 미치는 영향을 관찰하였다.
- 본 연구에서는 몇 가지 Elastase 중 가장 중요한 제 1형과 제 4형 Elastase에 대하여 PRA의 활성 억제효과를 관찰하였다. 본 연구의 결과에서 PRA은 Elastase type 1에 대하여 주목할 만한 억제 효과를 나타냈으나(Fig.
- 이는 세포 증식율 감소 기전 이외에 melanin 합성을 저해하는 또 다른 기전이 존재함을 암시한다. 이러한 결과들을 바탕으로, melanin 합성에 관여하는 Tyrosinase 활성에 미치는 영향을 관찰하였다.
- 이러한 선행 지식을 바탕으로 본 저자는 PRA가 피부 미백 및 주름에 어떠한 영향을 미치는지 살펴보기 위하여 완충액 내에서 직접적인 작용과 세포 내에서의 작용 두 가지 측면에서 연구를 진행하였다.
- 이에 저자는 악성흑색종 세포주인 B16F10 세포의 생존율에 미치는 영향을 관찰하고, melanin 색소 생성 저해, Tyrosinase 활성 저해능, 제 1형 및 4형 Elastase 억제에 미치는 영향을 관찰함으로써 PRA가 피부 미백 및 주름에 미치는 영향을 규명하고자 하였다.
제안 방법
- cell/well로 분주한 후, 부착 및 안정화를 위해 4시간 방치한 후, PRA를 처리하고 48시간 배양하였으며, 이후 Tyrosinase 유사활성 측정에서 언급한 것과 같이 단백질을 분리하여 활성측정 효소액으로 사용하였다. Elastase 유사활성은 in vitro에서의 유사활성 측정 방법과 동일하게 진행하였다.
- 현탁된 세포를 vortexing 한 후 1000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 활성측정 효소액으로 사용하였다. Tyrosinase 저해활성 측정을 위하여 96 well plate에 효소액 100 ㎕를 넣고 기질인 L-DOPA(2㎎/㎖) 200 ㎕를 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응을 진행시킨 뒤, Microplate Reader(Molecular Devices, USA)를 이용하여 475 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Tyrosinase의 활성도는 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 계산하였다15).
- melanin 생성량 측정은 Hosei 등13)의 방법을 변형하여 사용하였다. 간략히 정리하면, B16F10 세포를 배양하여 24 well plate에 각 well당 세포를 5×106 cell/well로 분주 한 후, 부착 및 안정화를 위하여 4시간을 배양하였다.
- 白芍藥의 피부 미백 및 주름에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 악성흑색종 세포인 B16F10에 처리하고 세포 증식율 및 Melanin 생성량, Tyrosinase 와 Elastase 저해 효과 등을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 의 방법으로 측정하였다. 간단히 소개하자면, 먼저 0.2 M의 Tris-HCl(Sigma, USA) buffer를 pH 8.0으로 적정하여 만든 후, 600 ㎕을 tube에 옮긴 후, 3.3 mM로 희석한 Succ-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide 180 ㎕을 첨가하고, 거기에 농도별로 희석된 PRA 추출물 300 ㎕를 넣어준 후, 1 ㎍/㎖로 희석된 Porcine pancreatic elastase 제 1형과 4형을 각각 60 ㎕씩 넣어주고, 실온에 10분간 방치한 후, p-nitroanilide의 생성량을 Microplate Reader를 이용하여 410 ㎚ 파장에서 측정하였다. Elastase 저해 활성은 다음 식에 따라 계산되며, IC50은 Elastase의 활성을 50% 저해하는데 요구되는 시료의 농도(㎍/㎖)로 표시하였다.
- 그 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT) 를 처리하여 MTT가 생존 세포의 효소작용에 의해 환원되도록 4시간을 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 각 well에 생성된 formazan 결정을 DMSO를 첨가하여 녹인 후 Microplate Reader(Bio-rad, USA)를 이용하여 540 ㎚에서 광도를 측정하였다.
- 세척되고 세절된 상태로 구입된 PRA 100 g을 증류수 1,500 ㎖과 함께 전기약탕기(대웅, 한국)로 100℃에서 3시간 동안 전탕하여 물추출을 시행하였다. 전탕한 추출물을 부직포로 거른 다음 동결건조기(삼원, 한국)를 이용하여 동결건조 분말을 얻었다.
- 세척되고 세절된 상태로 구입된 PRA 100 g을 증류수 1,500 ㎖과 함께 전기약탕기(대웅, 한국)로 100℃에서 3시간 동안 전탕하여 물추출을 시행하였다. 전탕한 추출물을 부직포로 거른 다음 동결건조기(삼원, 한국)를 이용하여 동결건조 분말을 얻었다. 최종적으로 얻어진 건조분말은 15.
대상 데이터
- 실험에 사용된 4,5-dimethy lthiazol-2yl-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT), Tris, N-succinyl-(L-Ala)3-p-nitroanilide, Elastase 1, Elastase 4, Tyrosinase, L-DOPA 등의 시약은 Sigma 제품(Sigma Chemical Co., USA)을 사용하였으며. 측정 기기로는 Microplate Reader(Bio-rad, USA) 등을 사용하였다.
- 악성흑색종 세포주인 B16F10의 생육 배지로는 RPMI 1640(Sigma, R4130) 배지를 사용하였고, 배지에는 10% fetal bovine serum(Gibco LOT. NO. 1006842, FBS)와 penicillin-streptomycin(100 units/㎖, 100 ㎍/㎕)을 첨가하였다. 실험기간 동안 세포주는 5% CO2 환경에서 배양하였다.
- 본 실험에서 사용된 白芍藥(PRA)으로는 미나리아재비과에 속하는 다년생 초본인 Paeonia latiflora Pall.의 뿌리를 건조한 것으로, 동신대학교 순천 한방병원에서 구입한 후, 정선하여 사용하였다.
- 인간 유래 악성흑색종(melanoma) 세포주인 B16F10 세포주는 한국세포주은행(KCLB, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다.
- , USA)을 사용하였으며. 측정 기기로는 Microplate Reader(Bio-rad, USA) 등을 사용하였다.
데이터처리
- 실험 자료에 대한 통계적 분석은 통계 패키지인 SigmaPlot 11.0 for windows program을 사용하여 실시하였으며, Student's t-test를 이용하여 P값이 0.05 미만 일 때 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
이론/모형
- B16F10 cells were attached 96 well plate, and added PRA as indicated concentrations respectively. After 48 hrs incubation, production levels of melanin were measured using MTT methods. Result are presented as mean±SD.
- B16F10 cells were added PRA as indicated concentrations respectively. After 48 hrs incubation, proliferation rates were measured using colorimetric methods. Result are presented as mean±SD.
- B16F10 cells were incubated with PRA for 48 hr in indicated concentrations. Inhibitory effects on elastase activities were measured using colorimetric methods. Values are represented as percentage of inhibitory rates.
- Inhibitory effects on tyrosinase activities were measured using colorimetric methods. Values are represented as percentage of inhibitory rates.
- PRA가 B16F10 세포 증식율에 미치는 영향 측정은 MTT assay12)를 통해 확인하였다. 간략히 정리하면, 96 well plate에 3×104 cell/㎖의 농도로 분주하여 배양기에서 37℃, 5% CO2를 유지하며 24시간 동안 pre-incubation시킨 후 25～800 ㎍/㎖의 농도로 약물을 처리하여 24시간 배양하였다.
- Tyrosinase 저해활성 측정은 Yagi 등14)의 방법에 따라 측정하였다. 반응구는 0.
- elastin 분해효소(Elastase) 저해 활성은 James 등16)의 방법으로 측정하였다. 간단히 소개하자면, 먼저 0.
성능/효과
- 5 ㎍/㎖ 및 250 ㎍/㎖ 투여군에서는 세포 증식율에 특별한 영향을 미치지 않은 상태에서 효과적인 melanin 생성 억제 작용을 발휘하였다. 1,000 ㎍/㎖ 투여군을 살펴보면, 세포 증식율의 감소와 증식 밀도 감소는 궁극적으로 세포 개체수의 감소를 가져와 상대적으로 melanin의 총량이 감소한 것처럼 보일 수 있다. 본 연구에서 세포 증식율이 대략 80% 정도까지 감소한데 비하여 melanin 생성량은 60% 정도까지 감소하였다.
- 1. 1,000 ㎍/㎖의 농도이상에서 유의한 수준으로 세포 증식율을 억제하였다.
- 2. 모든 투여군에서 Melanin 생성을 유의한 수준으로 억제하였다.
- 3. 시험관 내에서 Tyrosinase 활성 저해율은 미미하였다.
- 4. 세포 내에서 Tyrosinase 활성을 유의한 수준으로 감소시켰으며, IC50은 518.5 ㎍/㎖로 나타났다.
- 5. 시험관 내에서 Elastase type 1의 활성을 농도 의존적으로 저해하였으며, IC50은 480.5 ㎍/㎖로 나타났다.
- 6. 시험관 내에서 Elastase type 4의 활성을 농도 의존적으로 저해하였으나, 그 활성은 미미하였고, IC50은 910.7 ㎍/㎖로 나타났다.
- 이러한 결과는 PRA의 피부 미백 기능 증명에 중요한 단서가 될 것으로 생각된다. 62.5 ㎍/㎖ 및 250 ㎍/㎖ 투여군에서는 세포 증식율에 특별한 영향을 미치지 않은 상태에서 효과적인 melanin 생성 억제 작용을 발휘하였다. 1,000 ㎍/㎖ 투여군을 살펴보면, 세포 증식율의 감소와 증식 밀도 감소는 궁극적으로 세포 개체수의 감소를 가져와 상대적으로 melanin의 총량이 감소한 것처럼 보일 수 있다.
- 7. 세포 내에서 Elastase 유사 억제 활성을 농도 의존적으로 저해하였으나, 그 활성은 미미하였고, IC50은 939.5 ㎍/㎖로 나타났다.
- 1). B16F10 세포 증식율에 대한 결과를 살펴보면, 1,000 ㎍/㎖ 투여 군에서만 유의한 수준의 세포 증식율 감소가 관찰되었다.
- B16F10 세포에 PRA를 처리하고 melanin 생성량에 미치는 영향을 관찰한 결과, 62.5, 250, 1,000 ㎍/㎖군에서 나타난 melanin 색소량은 모든 군에서 유의한 감소를 나타냈다(Fig. 2).
- B16F10 세포에 농도별로 PRA를 처리하고 Tyrosinase 활성에 미치는 영향을 관찰한 결과, 62.5 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖, 1,000 ㎍/㎖의 PRA를 처리한 군에서 저해율이 각각 9.6±2.8%, 32.0±7.2%, 82.2±7.0%로 나타났으며 IC50은 518.5 ㎍/㎖로 계산되었다(Fig. 4).
- B16F10 세포에 농도별로 PRA를 투여하고 24시간 후, 세포 증식율을 측정한 결과, 1,000 ㎍/㎖ 이상에서 유의한 세포증식율 감소가 나타났다(Fig. 1).
- PRA 추출물의 Elastase 저해 활성을 관찰한 결과, PRA 추출물의 제 1형 Elastase에 대한 저해능은 62.5 ㎍/㎖, 125 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 1,000 ㎍/㎖에서 각각 7.4±3.5%, 16.0±9.4%, 41.5±16.1%, 69.1±17.2%, 86.2±20.1%로 나타났고, IC50은 480.5 ㎍/㎖로 계산되었다(Fig. 5A).
- PRA의 B16F10 세포 내에서 Elastase의 기질을 첨가하고 저해 활성을 관찰한 결과, PRA 추출물의 Elastase에 대한 저해능은 62.5 ㎍/㎖, 250 ㎍/㎖, 1,000 ㎍/㎖에서 각각 9.5±2.9%, 23.8±9.6%, 52.3±10.5%로 나타났고, IC50은 939.5 ㎍/㎖로 계산되었다(Fig. 6).
- 1,000 ㎍/㎖ 투여군을 살펴보면, 세포 증식율의 감소와 증식 밀도 감소는 궁극적으로 세포 개체수의 감소를 가져와 상대적으로 melanin의 총량이 감소한 것처럼 보일 수 있다. 본 연구에서 세포 증식율이 대략 80% 정도까지 감소한데 비하여 melanin 생성량은 60% 정도까지 감소하였다. 이는 세포 증식율 감소 기전 이외에 melanin 합성을 저해하는 또 다른 기전이 존재함을 암시한다.
- 본 연구의 결과에서 PRA는 B16F10 세포에 대하여 유효 농도 범위에서 특별한 세포 독성을 나타내지 않았다(Fig. 1). B16F10 세포 증식율에 대한 결과를 살펴보면, 1,000 ㎍/㎖ 투여 군에서만 유의한 수준의 세포 증식율 감소가 관찰되었다.
- 본 연구의 결과에서 PRA는 시험관 내에서 특별한 Tyrosinase 활성 저해 효과를 보이지 않았지만(Fig. 3), 악성 흑색종 세포 내에서는 주목할 만한 수준의 Tyrosinase 억제 활성을 보였다(Fig. 4). 이러한 결과는 PRA가 직접적인 Tyrosinase 억제 활성을 보이는 것이 아니라, 세포 내에 작동되는 특정 또는 여러 개의 intracellular signalling pathway를 억제하거나 가속화 함으로써 발생하는 2차적인 결과라고 해석될 수 있다.
- 본 연구의 결과에서 PRA는 유의한 수준으로 melanin 합성을 저해하였다(Fig. 2). 이러한 결과는 PRA의 피부 미백 기능 증명에 중요한 단서가 될 것으로 생각된다.
- 본 연구에서는 몇 가지 Elastase 중 가장 중요한 제 1형과 제 4형 Elastase에 대하여 PRA의 활성 억제효과를 관찰하였다. 본 연구의 결과에서 PRA은 Elastase type 1에 대하여 주목할 만한 억제 효과를 나타냈으나(Fig. 5A), Elastase type 4에 대하여서는 비교적 경미한 효과를 나타냈다(Fig. 5B). 직접적인 Elastase 억제 효과 연구 결과에 부가하여 B16F10 세포 내에서 Elastase 유사활성 효과를 검증한 결과 역시 IC50이 거의 1,000 ㎍/㎖에 가까워 매우 경미한 Elastase 억제 활성이 있는 것으로 분석되었다(Fig.
- 시험관 내에서 Tyrosinase 저해 활성을 관찰한 결과, 1,000 ㎍/㎖ 농도에서 15.0±2.3%의 저해율을 보였으며, The half maximal(50%) inhibitory concentration(IC50)은 구할 수가 없었다(Fig. 3).
- 이러한 결과로부터 PRA가 세포 내에서 알려지지 않은 어떤 기전을 통해 Tyrosinase와 Elastase 활성 억제 효과를 가짐을 알 수 있다. 따라서 추후 피부 미백 및 주름에 관한 연구에 본 연구결과가 활용될 수 있으며, 피부 미백과 항주름 효과를 가지는 기능성 화장품의 개발에 PRA가 원료 물질로서 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 이상의 결과를 정리하면, PRA는 Melanin 색소 생성을 억제하였고, 직접적으로 Tyrosinase의 활성을 억제하지 못한 반면, 세포 내에서는 효과적으로 Tyrosinase의 활성을 억제하였다. Elastase에 대하여서는 제 1형에 대하여 직접적으로 억제작용을 하였고, 제 4형 및 세포 내에서는 경미한 억제 효과를 나타냈다.
- 제 4형 Elastase에 대한 저해능은 각각 4.6±2.4%, 18.0±3.9%, 27.5±9.3%, 34.1±12.3%, 53.4±6.5%로 나타 제 1형에 비해 약한 효과를 보였으며 IC50은 910.7 ㎍/㎖로 계산되었다(Fig. 5B).
- 5B). 직접적인 Elastase 억제 효과 연구 결과에 부가하여 B16F10 세포 내에서 Elastase 유사활성 효과를 검증한 결과 역시 IC50이 거의 1,000 ㎍/㎖에 가까워 매우 경미한 Elastase 억제 활성이 있는 것으로 분석되었다(Fig. 6). 이는 PRA가 Elastase inhibitor로서 작용할 가능성을 확인하기 위한 기초 자료로 활용될 수 있고, 이를 규명하기 위한 후속 연구가 필요할 것으로 보인다.
후속연구
- 이러한 결과로부터 PRA가 세포 내에서 알려지지 않은 어떤 기전을 통해 Tyrosinase와 Elastase 활성 억제 효과를 가짐을 알 수 있다. 따라서 추후 피부 미백 및 주름에 관한 연구에 본 연구결과가 활용될 수 있으며, 피부 미백과 항주름 효과를 가지는 기능성 화장품의 개발에 PRA가 원료 물질로서 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 6). 이는 PRA가 Elastase inhibitor로서 작용할 가능성을 확인하기 위한 기초 자료로 활용될 수 있고, 이를 규명하기 위한 후속 연구가 필요할 것으로 보인다.
- 따라서 PRA는 이러한 Tyrosinase inhibitor들과는 다른 기전을 통하여 Tyrosinase의 활성을 억제할 것으로 생각된다. 추후 melanin 생성과정에 중요한 역할을 한다고 알려져 있는 microphthalmia-associated transcription factor(MITF), cAMP response element(CRE) 등37)과 같은 인자들에 대해 PRA가 어떤 영향을 미치는지에 대한 후속 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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