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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 건강식품소재로써의 응용가치가 매우 높다고 볼 수 있는 진달래 꽃잎으로부터 H. 破困에 대한 항균 활성을 가지는 물질을 분리, 정제하고 동정하여 고부가 기능성 식품소재로 활용하고자 하였다.
제안 방법
- 용출용매는 60% EtOH 및 normal phase type 으로서 EtOH->HQ (lOOT)%)의 순으로 분당 20 ml의 유속으로 용출하여 TLC 상에서 phenol성 물질의 유무 및 종류를 확인하고 농축, 건조하였다. MCI-gel column은 다공성 poly- styren gel로써 흡착성을 이용하였으며, 용출용매는 일반적 인 revers type인 HQ^MeOHeFOO%)로 용출하여 TLC 상에서 phenol compound의 분리 정도를 확인하였다.
- 각각의 상징액을 모아 농축하여 rotary evapo- rator로 농축한 후 ethanol 추출물로서 분획을 위한 시료로 사용하였다.
- 건조된 진달래꽃에 0~100%까지 다양한 농도의 ethanol을 가하여 실온에서 24시간 추출한 후 원심분리 (10, 000 rpm, 15 min)하여 상징액과 침전물을 얻었고 이 침전물은 다시 최적추출조건인 60% ethanol을 가하여 위와 같은 추출과정을 2회 반복하였다. 각각의 상징액을 모아 농축하여 rotary evapo- rator로 농축한 후 ethanol 추출물로서 분획을 위한 시료로 사용하였다.
- 표준균주인 ATCC 43504를 사용하였다. 균의 배 양에는최적배지(special peptone 0.5 g, agar 0.75 g, NaQ 0.25 g, yeast extract 0.25 g, beef extract 0.2 g 및 pyruvic add 0.025g)를 사용하였으며 미호기성 조건을 유지시켜주기 위해서 10% CO2 incubator에서 습도는 95% 이상으로 유지하며 배 양하였으며, agar plate상에서 배양은 37℃로 48~72시간 동안 실시하였다. 또한 항균 활성 측정은 H.
- 025g)를 사용하였으며 미호기성 조건을 유지시켜주기 위해서 10% CO2 incubator에서 습도는 95% 이상으로 유지하며 배 양하였으며, agar plate상에서 배양은 37℃로 48~72시간 동안 실시하였다. 또한 항균 활성 측정은 H. pylori최적배지 plate에균분산액 100 ㎕를 분주하여 멸균 유리봉으로 도말한 다음,멸균된 disc paper (? 8 ^m)를 올리고 0.45 ㎛m membrane filter로 제균한 각 추출물을 vacuum evaporator로 농축한 후 멸균수로 희석하여 phenol 함량이 50-200 ㎍/100 ㎕가 되도록 조절한 후 각 추출물 100 ㎕를 disc paper에 흡수시키고, 대조구로는 멸균수를 흡수시킨 후 37℃의 미 호기성 조건에서 48시 간 동안 incubation한 다음, disc 주위의 clear zone 생성 유무를 확인하였다[19].
- 분석 시료 1 mg을 취해 48 시간 감압, 건조하여 완전히 수분을 제거하고 자동원소분석기로 시료에 함유된 C 및 H의 양을 분석하였으며, O는 분자량을 기준으로 계산치에 의해 환산하였다.
- 순수 분리된 시료 1 mg을 KBr 100 mg 분말과 잘 섞어 배합하고 압력을 가해 가압 정제를 만들어 측정하였다.
- 분리 하였다. 용출용매는 60% EtOH 및 normal phase type 으로서 EtOH->HQ (lOOT)%)의 순으로 분당 20 ml의 유속으로 용출하여 TLC 상에서 phenol성 물질의 유무 및 종류를 확인하고 농축, 건조하였다. MCI-gel column은 다공성 poly- styren gel로써 흡착성을 이용하였으며, 용출용매는 일반적 인 revers type인 HQ^MeOHeFOO%)로 용출하여 TLC 상에서 phenol compound의 분리 정도를 확인하였다.
- 융해점은 시료 1 mg을 취하여 미량융점 측정장치를 이용하여 측정하였으며, [a]D는 시료 5 mg을 MeQ 및 methanol 용해하여 polarimeter에 의해 측정하였다.
- 측정하였다. 이 때 측정 용매로써는 thioglycerol을 사용하였으며, 측정 조건에서 emitter 전류는 22~28 eV이며, 이온 원의 가속가압이 6~7 kV에서 질량분석을 하였다.
- 3과 같이 ethyl acetate 층과 butanol층에 서 각각 14, 18 mm의 H pylori균에 대한 저 해 환을 나타내 었다. 이 분획물들을 CHCh : BuOH : HQ : Acetic acid : MeOH = 50 : 30 : 10 : 5 :15 전개용매 조건으로 thin layer chromatography를 한 결과 ethyl acetate와 butanol 층에서 동등한 RT값을 나타내는 물질이 활성 물질인 것으로 추정되 었으며, butanol 층의 항균활성 이 가장 높아 butanol 층을 Sephadex LH 20 column으로 100% ethanol에서 0%까지 추출 용매로 하여 gradients, elution 하였다. 그 결과 Fig.
- 진달래 꽃을 60% ethanol로 추출하여 추출물의 H 에대한 저해활성의 측정과 저해물질의 분리 및 동정을 시행하였다. 또한 H pylori균에 대한 항균활성은 60% ethanol 추출물에서 phenol 화합물을 200 ㎍/ml 이상 주입하였을 때부터 22 mm이상의 dear zone0] 관찰되어 H.
- 진달래꽃 추출물의 추출 조건을 확립하기 위하여 0~100% 까지 다양한 농도의 ethanol을 추출용매로 하여 phenol성 물질의 용출량을 측정하였다. 그 결과 Fig.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 진달래꽃은 2007년 5월 경북 상주시 갑장산에서 채취하여 4℃ 저온저장 하면서 이용하였다.
- 실험에 사용한 균주는 위, 십이지장 궤양 원인균인 Hpylai 로서 표준균주인 ATCC 43504를 사용하였다. 균의 배 양에는최적배지(special peptone 0.
이론/모형
- 1H 및 13C-NMR spectrum은 FT 방법 (Pulse Fourier Transform method)을 이용하여 순수정제물 10 mg을 측정 용매 CDCI3+DMSO-D6-D2O에 5~20%(w/v)비율로 용해시키고 TMS (Tertamethylsilane: (CH3)4Si)를 기준 물질로 하여 H-NMR (300 MHz), C-NMR (75 MHz)로 측정하였다.
- IR spectrum은 할로겐화 알칼리 정제법을 이용하였다. 순수 분리된 시료 1 mg을 KBr 100 mg 분말과 잘 섞어 배합하고 압력을 가해 가압 정제를 만들어 측정하였다.
- 고체 시료 1 mg을 감압상태 (Iff4~ I* O mmHg) 에서 neg ative ion FAB-mass spectrum을 이용하여 화학적 분석법에 의해 측정하였다. 이 때 측정 용매로써는 thioglycerol을 사용하였으며, 측정 조건에서 emitter 전류는 22~28 eV이며, 이온 원의 가속가압이 6~7 kV에서 질량분석을 하였다.
- 총 페놀 화합물은 Folin-Denis 방법[6]으로 측정하였으며, 시료 1 ml에 95% ethanol 1 ml와 증류수 5 ml를 첨가하고 IN Folin-ciocalteu reagent 0.5 ml를 넣어 잘 섞어주고, 5분간 방치한 후, Nag 1 ml를 가한 후, 흡광도 725 nm에서 1시간 이내에 측정하여 gallic add를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.
성능/효과
- 4와 같았다. Compound A, B, C 단일물질로 실험하였을 때, disc method에 의한 clear zone0] 형성 되지 않았으며, phenol함량이 200 ㎍/100 ㎕일 때 compound A와 B, com-pound A와 C, compound B와 C를 혼합처 리 한 경우에도 H pylori에 대한 저해는 관찰되지 않았으며, compound A, B, C 세 가지 물질을 혼합하고 disc paper에 200 gg/0.1 ml의 농도로 하여 항균활성을 측정한 결과 첨가 농도별로 18 mm의 저해 환을 나타내 었다. Rosemary를 분리 정 제 하여 H pylori에 대한 항균활성 물질을 동정한 Yoon [23]의 연구 결과에서는 단일 물질로 분리 하였을 때 H *에 대한 항균활성이 높지 않고 여 러 가지 물질이 혼합되 었을 때 synergy effect에 의 해 H.
- H pykri 평판 최적배지 plate에서 항균활성을 측정한 결과 Table 1에서와 같이 0~30% ethanol 추출물에서 dear zone이 나타나지 않았으며 40% ethanol 추출물 200 ㎍/ml을 주입하였을 때부터 13 mm의 저해환이 나타나기 시작하였으며, 60% ethanol 추출물 200 ㎍/ml를 주입 하였을 때 가장 높은 항균력 (22 mm)을 나타내었다.
- 이 분획물들을 CHCh : BuOH : HQ : Acetic acid : MeOH = 50 : 30 : 10 : 5 :15 전개용매 조건으로 thin layer chromatography를 한 결과 ethyl acetate와 butanol 층에서 동등한 RT값을 나타내는 물질이 활성 물질인 것으로 추정되 었으며, butanol 층의 항균활성 이 가장 높아 butanol 층을 Sephadex LH 20 column으로 100% ethanol에서 0%까지 추출 용매로 하여 gradients, elution 하였다. 그 결과 Fig. 4와 같이 fraction 1에서 fraction 5까지 5가지 분획물을 얻을 수 있었으며, 각 분획물을 농축하여 항균활성을 측정한 결과 fraction 3과 fraction 4에서 항균활성을 나타내 어 이 두 분획물을 선택하여 구조적 이성질체 phenol류 분리가 용이한 MCLgel을 이용하여 reverse phase type인 HQ→EtOH로 농도를 증가 시키며 용출한 결과 compound A, B 및 C 등 3 종류의 com- pound를 분리하였으며, CHCG : BuOH : HQ : Acetic acid : MeOH = 50:30:10:5:15 전개용매 조건으로 thin layer chro- matography를 한 결과 Fig. 5와 같이 단일 물질로 확인되 었다.
- pylori저해활성을 나타낸 fraction D를 MCI-gel CHP-20 column을 이용하여 normal phase type 인 ethanol 100%에서0%로 농도를 감소시키며 용출한 결과 5개의 단일 물질 분획을 얻을 수 있었다. 그 중 세 가지의 물질에 대해 H.pylori저해활성 이 나타나 FAB-MS, 와 13C NMR 및 IR spectrum을 사용하여 구조 동정 한 결과 quercitrin (quercetin3CMhamnopyr- anoside), myricitrin (myricetin-3-O-rhamnopyranoside) 및quercetin인 것으로 확인되었다.
- pylori에 대한 항균 효과가 나타나는 것으로 판단되었다. 따라서, 진달래꽃 추출물로부터 단일물질로 분리하여 H. pylori 억제효과를 얻기는 어려우므로 추출물 그 자체를 활용하는 것이 항균효과와 가공비용의 절감 면에서 훨씬 유용할 것이라 사료되었다.
- 또한 H pylori균에 대한 항균활성은 60% ethanol 추출물에서 phenol 화합물을 200 ㎍/ml 이상 주입하였을 때부터 22 mm이상의 dear zone0] 관찰되어 H. pylori균에 대한 높은 항균력을 나타내었다. 저해물질의 분리는 Sephadex LH-20 col- umn을 이용하여 분리한 결과 6개의 fraction으로 분리되었으며, H.
- pylori균에 대한 높은 항균력을 나타내었다. 저해물질의 분리는 Sephadex LH-20 col- umn을 이용하여 분리한 결과 6개의 fraction으로 분리되었으며, H. pylori저해활성을 나타낸 fraction D를 MCI-gel CHP-20 column을 이용하여 normal phase type 인 ethanol 100%에서0%로 농도를 감소시키며 용출한 결과 5개의 단일 물질 분획을 얻을 수 있었다. 그 중 세 가지의 물질에 대해 H.
- 진달래꽃 500 g을 60% 에탄올로 추출한 후, Sephadex LH-20 column chromatography (Pamarcia. Co)를 이용하여 ethanol : distilled water (1:6, v/v)로 용출시키고, 용출액은 silica TLC plate를 이용하여 전개시 킨 후 10% Hjgd로 발색 시켜 확인한 결과 Table 2와 같이 A, B, C D, E, F로 6개의 분획물을 얻었으며, fraction D에서 H pylori균에 대한 억제 효과가 확인되었다(Fig. 2). 항균활성성분인 D fraction을 모아 농축, 동결건조 한 후 ethyl acetate, butanol, aqueous를 이용하여 용매 분획한 결과 Table 3, Fig.
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