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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 한방자원 중에서 항균력이 우수한 영실을 이용하여 위염과 위궤양의 원인인자로 작용하는 H. pylori의 억제물질을 분리, 정제 및 구조 동정하고 정제 compound에 의한 H. pylori에 대한 억제효과를 확인함으로써 H. pylori에 대한 예방이나 치료를 위한 새로운 방법을 제시하기 위한 자료를 확보하고, 이들 천연물을 활용한 기능성 식품을 산업화 하기위한 소재 개발을 하고자 하였다.
제안 방법
- 건조된 영실 5 kg에 70% ethanol을 가하여 실온에서 24시간 추출한 후 원심분리(4,700× g, 15 min)하여 상징액과 침전물을 얻었고 이 침전물에 다시 70% ethanol을 가하여 위와 같은 추출과정을 4회 반복하였다.
- 융해점은 시료 1 mg을 취하여 미량융점 측정 장치를 이용하여 측정하였으며,〔α〕 D는 시료 5 mg을 Me2O 및 methanol에 용해하여 polarimeter (Jasco DIP-370, Japan)에 의해 측정하였다.
- 용출용매는 reverse phase type으로 ethanol 100%→H2O로 하여 용출 분취하고, 활성 분획물을 다시 C18 cartridge 컬럼을 이용하여 ACE 10%와 formic acid 90%로 하여 용출시켜 분리하였다.
- O 및 methanol에 용해하여 polarimeter (Jasco DIP-370, Japan)에 의해 측정하였다. IR spectrum은 할로겐화 알칼리 정제법을 이용하여 순수 분리된 시료 1 mg을 KBr 분말 100 mg과 잘 섞어 혼합한 후 압력을 가해 가압 정제를 만들어 측정하였다. NMR spectrum은 FT 방법(Pulse Fourier Transform method)을 이용하여 순수 정제물 10 mg을 측정 용매 CDCl3+DMSO-D6+D2O에 5~20% (W/V) 비율로 용해시키고 TMS 〔Tetramethylsilane;(CH3)4Si〕를 기준 물질로 하여 PMR (300 MHz, Bruker AM-300, Japan)로 측정하였다.
- Negative FAB Mass spectrum 측정은 고체 시료 1 mg을 감압상태(10-4~10-6 mmHg)에서 negative ion FAB-mass spectrum (Jeol JMS-PX 300, Japan)을 이용하여 화학적 분석법에 의해 측정하였다. 이때 측정 용매로서는 thioglycerol을 사용하였으며, 측정조건에서 emitter 전류는 22~28 eV이며, 이온원의 가속가압이 6~7 kV에서 질량분석을 하였다.
- 페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로 다양한 구조와 분자량을 가지며, phenolic hydroxyl (OH)기를 가지기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 결합하여 항산화효과 등의 생리활성기능을 가지는 것으로 알려져 있어[15] 영실 추출물에 함유된 페놀성 화합물의 함량을 조사하였다. 영실 추출물을 식품에 적용하기 위하여 인체에 유해하지 않으며 비교적 phenol성 물질 용해도가 높은 ethanol을 추출용매로 하여 Fig.
- 페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로 다양한 구조와 분자량을 가지며, phenolic hydroxyl (OH)기를 가지기 때문에 단백질 및 기타 거대 분자들과 결합하여 항산화효과 등의 생리활성기능을 가지는 것으로 알려져 있어[15] 영실 추출물에 함유된 페놀성 화합물의 함량을 조사하였다. 영실 추출물을 식품에 적용하기 위하여 인체에 유해하지 않으며 비교적 phenol성 물질 용해도가 높은 ethanol을 추출용매로 하여 Fig. 1에서와 같이 다양한 농도로 phenol성 물질을 추출하였다. 또한 시간에 따른 phenol성 물질의 용출량의 변화에서는 Fig.
- 영실 추출물을 이용한 H. pylori에 대한 항균활성은 70% 에탄올 추출물을 이용하여 측정하였다. 그 결과 Table 1과 같이 100 μg/ml 이하의 저농도에서는 영실의 항균활성이 나타나지 않았으며, 추출된 phenol성 물질을 150 μg/ml의 농도로 첨가하였을 때 12 mm, 200 μg/ml의 농도일 때 14 mm의 저해환이 나타났다(Fig.
- 건조된 영실 5 kg을 70% ethanol로 추출한 후 Sephadex LH-20 open column chromatography를 이용하여 70% ethanol 용매로 용출시켜, silica TLC plate를 이용하여 전개한 후 10% H2SO4로 발색시켜 phenol성 물질의 유무를 확인하고, 1차 분획하여 A, B, C, D, E 5가지 1차 분획물을 획득하고 phenol성 물질의 함량을 측정한 결과 Table 2와 같이 D 분획물에서 3139 μg/g으로 가장 높은 함량을 나타내었다.
- 1차 분획물 중 D 분획물을 이용하여 H2O, ethylacetate, butanol 등으로 용매분획하여 각 분획물의 생리활성을 측정하였다. 그 결과 Table 3과 같이 phenol성 물질의 함량이 ml 당 aqueous층에서 가장 높은 것으로 나타났으며, 각 용매 분획물의 H.
- 그 결과 Table 6과 같이 200 μg/ml의 농도에서 두개 이상의 compound가 함께 존재 할 때 8 mm 이상의 저해환을 나타내었으며 3개의 compound를 조합 한 compound 1+2+5 및 compound 1+3+5가 혼합되었을 때 비교적 높은 항균활성을 나타내어(Fig. 5) compound 1,2,3,5의 4가지 물질 구조를 동정하기로 하였다.
- pylori에 대한 항균활성을 측정한 결과, Table 5와 같이 compound 4를 제외한 모든 compound에서 200 μg/ml의 농도에서 8 mm의 저해환을 나타내었다. 정제물의 항균활성이 추출물의 항균활성보다 낮은 결과를 나타내어 각 compound의 시너지 효과를 알아보기 위해 각 compound를 일정비율로 혼합하여 항균활성을 실험하였다. 그 결과 Table 6과 같이 200 μg/ml의 농도에서 두개 이상의 compound가 함께 존재 할 때 8 mm 이상의 저해환을 나타내었으며 3개의 compound를 조합 한 compound 1+2+5 및 compound 1+3+5가 혼합되었을 때 비교적 높은 항균활성을 나타내어(Fig.
- H. pylori 최적배지 plate에 H. pylori 100 μl를 분주하여 멸균 유리봉으로 도말한 다음, 멸균된 disc paper (Φ 8 mm)를 올리고 0.45 μm membrane filter로 제균한 각 추출물 100 μl을 흡수시키고, 대조구로는 멸균수를 흡수시킨 후 37℃의 미호기성 조건에서 24시간 동안 배양한 다음, disc 주위의 clear zone 생성 유무를 확인하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 균주는 위, 십이지장궤양 원인균인 H. pylori로서 표준균주인 ATCC 43504를 사용하였다. H.
- 건조된 영실 5 kg에 70% ethanol을 가하여 실온에서 24시간 추출한 후 원심분리(4,700× g, 15 min)하여 상징액과 침전물을 얻었고 이 침전물에 다시 70% ethanol을 가하여 위와 같은 추출과정을 4회 반복하였다. 각각의 상징액을 모아 rotary evaporator (Eyela N-11, Japan)로 농축한 후 ethanol 추출물로서 정제를 위한 시료로 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 영실(찔레나무 열매, Rosa multiflora Thunberg fruit)은 시중 한약 건재상에서 구입한 것을 사용하였으며, 50℃ dry oven에서 건조한 후 40 mesh로 분쇄하여 4℃에서 저온저장하며 시료로 사용하였다.
이론/모형
- 총 페놀 화합물은 Folin-Denis 방법[9]으로 측정하였으며, 시료 1 ml에 95% ethanol 1 ml와 증류수 5 ml를 첨가하고 1 N Folin-ciocalteu reagent 0.5 ml를 넣어 잘 섞어주고, 5분간 방치한 후, Na2CO3 1 ml를 가한 후, 흡광도 725 nm에서 1시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.
- IR spectrum은 할로겐화 알칼리 정제법을 이용하여 순수 분리된 시료 1 mg을 KBr 분말 100 mg과 잘 섞어 혼합한 후 압력을 가해 가압 정제를 만들어 측정하였다. NMR spectrum은 FT 방법(Pulse Fourier Transform method)을 이용하여 순수 정제물 10 mg을 측정 용매 CDCl3+DMSO-D6+D2O에 5~20% (W/V) 비율로 용해시키고 TMS 〔Tetramethylsilane;(CH3)4Si〕를 기준 물질로 하여 PMR (300 MHz, Bruker AM-300, Japan)로 측정하였다. Negative FAB Mass spectrum 측정은 고체 시료 1 mg을 감압상태(10-4~10-6 mmHg)에서 negative ion FAB-mass spectrum (Jeol JMS-PX 300, Japan)을 이용하여 화학적 분석법에 의해 측정하였다.
- NMR spectrum은 FT 방법(Pulse Fourier Transform method)을 이용하여 순수 정제물 10 mg을 측정 용매 CDCl3+DMSO-D6+D2O에 5~20% (W/V) 비율로 용해시키고 TMS 〔Tetramethylsilane;(CH3)4Si〕를 기준 물질로 하여 PMR (300 MHz, Bruker AM-300, Japan)로 측정하였다. Negative FAB Mass spectrum 측정은 고체 시료 1 mg을 감압상태(10-4~10-6 mmHg)에서 negative ion FAB-mass spectrum (Jeol JMS-PX 300, Japan)을 이용하여 화학적 분석법에 의해 측정하였다. 이때 측정 용매로서는 thioglycerol을 사용하였으며, 측정조건에서 emitter 전류는 22~28 eV이며, 이온원의 가속가압이 6~7 kV에서 질량분석을 하였다.
성능/효과
- 그 결과 Table 1과 같이 100 μg/ml 이하의 저농도에서는 영실의 항균활성이 나타나지 않았으며, 추출된 phenol성 물질을 150 μg/ml의 농도로 첨가하였을 때 12 mm, 200 μg/ml의 농도일 때 14 mm의 저해환이 나타났다(Fig. 3).
- 앞의 실험 결과와 같이 H. pylori에 대한 항균활성이 가장 높게 나타난 aqueous층을 Sephadex LH-20을 이용하여 에탄올 100%→H2O의 용매 조건과 C18 cartridge 컬럼을 이용하여 ACE 10%와 formic acid 90%의 조건으로 용출, 정제하여 compound 1~5와 같이 5개의 compound를 얻었으며, 각 compound를 이용하여 H. pylori에 대한 항균활성을 측정한 결과, Table 5와 같이 compound 4를 제외한 모든 compound에서 200 μg/ml의 농도에서 8 mm의 저해환을 나타내었다.
- O, ethylacetate, butanol 등으로 용매분획하여 각 분획물의 생리활성을 측정하였다. 그 결과 Table 3과 같이 phenol성 물질의 함량이 ml 당 aqueous층에서 가장 높은 것으로 나타났으며, 각 용매 분획물의 H. pylori균에 대한 항균활성을 측정한 결과 aqueous층 분획물에서 13 mm의 저해환이 관찰되었다(Table 4).
- 71 ppm (brs)이 확인되었고, 13C-NMR에서 178 ppm (C-4), 164 ppm (C-7), 160 ppm (C-5), 156 ppm (C-9), 146 ppm (C-4'), 148 ppm (C-2), 145 ppm (C-3'), 136 ppm (C-3), 122 ppm (C-1'), 116 ppm (C-5'), 115 ppm (C-2'), 103 ppm (C-10), 98 ppm (C-6) 및 94 ppm (C-8) 등이 관찰되었다. 이상의 결과가 treatise on asian herbal medicines [14]에 나오는 분석결과와 일치하여 compound C는 quercetin으로 동정하였다(Fig. 6).
후속연구
- pylori와 유사한 14종류가 보고되어 있다. 우리나라 성인의 80% 정도가 이 균에 감염되었으나[16,23,25] 임상증상을 나타내지 않고 있다가, 어떠한 발병 촉진 인자에 의하여 만성적 위십이지장 궤양을 유발한다는 보고가 있어[19,22,26], H. pylori 자체에 대한 연구와 병행하여 H. pylori에 대한 예방이나 치료를 위한 새로운 방법이 시도될 필요가 있으며, 본 연구에 이용된 영실의 항균효과를 활용한 방안도 대안이 될 수가 있을 것이다.
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