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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 streptozotoin 유도 당뇨 쥐에게 당귀추출물을 투여하여 혈당, 인슐린 함량 및 각종 당대사 관련 효소의 활성도를 조사하여 혈당 강하 효과가 밝혀져 있는 인삼류와 더불어 참당귀의 이용 가능성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- 1 ml를 넣고 섞은 후, 상온에서 1시간 반응 직후 2,500 rpm에서 15분간 원심분리하여 얻은 침전물의 방사능을 gamma counter를 사용하여 측정하였다. 2.5～100 mlTU/ml insulin 표준용액으로 표준곡선을 작도하고 모든 실험은 3회 반복하여 insulin 농도를 산출하였다.
- 5 mM citrate buffer(pH 4.5)에 녹인 streptozotocin(50 mg/kg body weight)을 1회 쥐의 복강에 주사하여 췌장의 β-세포를 파괴시켜 인슐린 결핍의 영구 당뇨(Insulin dependent diabetes mellitus: IDDM)를 유도하였다.
- 50% EtOH, 100% EtOH 및 물을 용매로 추출된 3종류의 당귀 추출물의 혈당 및 인슐린 농도에 미친 영향을 알아보기 위하여 streptozotocin로 당뇨를 유발시킨 후 3종류의 당귀 추출물(5 mg/kg body weight)을 3주간 5군(Normal군, STZ군, STZ+ 50% EtOH군, STZ+100% EtOH군, STZ+H2O군)으로 나누어 구강 투여 전과 후의 혈당치 및 인슐린 농도를 비교한 결과는 Table 1에 제시된 바와 같다. 절식 16시간 후 STZ군의 평균혈당량(391 mg/dl)은 정상군(62 mg/dl)에 비해 유의적으로 높은 수준을 보였으나, STZ+50% EtOH군(104 mg/dl), STZ+100% EtOH군(132 mg/dl)인 참당귀 에탄올 추출물 투여군들의 경우는 STZ군에 비해서는 유의적으로 감소되었고, 정상군보다는 높았지만 정상 수준에 가깝게 감소된 결과를 보였다.
- Glucokinase의 활성을 측정하기 위해 반응생성물인 glucose-6-phosphate가 glucose-6-phosphate dehydrogenase에 의해 산화될 때 생성되는 NADPH량을 340 nm에서의 흡광도로 측정하였는데, 50 mM Tris-HCl buffer(pH 7.5), 100 mM glucose, 5 mM MgCl2, 5 mM ATP, 0.1 mM NADP+ 및 glucose-6-phosphate dehydrogenase가 0.2 unit가 되도록 조정하였다. Glucose-6- phosphate에 glucose-6-phosphatase가 반응할 때 생성되는 인산을 정량함으로써 간의 glucose-6-phosphatase 효소 활성을 측정하였으며, 6-phosphogluconate dehydrogenase 효소 활성은 50 mM potassium phosphate buffer(pH 7.
- Glucose 산화과정인 hexose monophosphate shunt 관련 효소인 glucose-6-phosphate dehydrogenase와 6-phosphogluconate dehydrongenase 효소 활성 변화를 살펴보았다. Glucose-6- phosphate dehydrogenase 활성의 경우, Normal군(400 unit/mg), STZ군(51 unit/mg), STZ+50% EtOH군(38 unit/mg), STZ+100% EtOH군(69 unit/mg), STZ+H2O군(54 unit/mg)의 활성을 나타내었으며, 6-phosphogluconate dehydrongenase의 효소 활성의 경우는 Normal군(40 unit/mg), STZ군(5 unit/mg), STZ+50% EtOH군(3 unit/mg), STZ+100%EtOH군(4 unit/mg), STZ+H2O군(6 unit/ mg)의 결과를 보임으로써 정상군과 비교하여 효소 활성 개선에 전혀 영향을 미치지 못한 것으로 보여진다.
- 2 unit가 되도록 조정하였다. Glucose-6- phosphate에 glucose-6-phosphatase가 반응할 때 생성되는 인산을 정량함으로써 간의 glucose-6-phosphatase 효소 활성을 측정하였으며, 6-phosphogluconate dehydrogenase 효소 활성은 50 mM potassium phosphate buffer(pH 7.6), 10 mM MgCl2, 1 mM NADP+, 5 mM 6-phosphogluconate 등으로 구성된 반응액을 사용하여 측정하였다. pH 7.
- STZ+50% EtOH군, STZ+100% EtOH군 및 STZ+H2O군은 STZ 주사 후 7일째 날에, 시료 추출물을 1 g/l 의 농도로 물에 녹여, 시료 추출물이 5 mg/kg Body weight 되는 양을 catheter로 매일 1회씩 경구 투여하면서 3주간 사육하였다. Normal군과 STZ군은 시료 추출물 대신 동일 부피의 물을 매일 경구 투여하면서 3주간 사육하였다. 사육은 screen- bottomed cage 내에서 수행하고, 사육실의 환경조건으로 온도 및 습도는 각각 20～25℃, 50～60%를 유지하고, 명암은 12시간 간격으로 점등 및 소등을 반복하였다.
- STZ+50% EtOH군, STZ+100% EtOH군 및 STZ+H2O군은 STZ 주사 후 7일째 날에, 시료 추출물을 1 g/l 의 농도로 물에 녹여, 시료 추출물이 5 mg/kg Body weight 되는 양을 catheter로 매일 1회씩 경구 투여하면서 3주간 사육하였다.
- Streptozotocin 유도 흰쥐에서 참당귀(Angelica gigas Naki) 추출물의 혈당 강하 효능을 알아보고자 당뇨 유발 쥐에게 50% EtOH, 100%EtOH, H2O 당귀 추출물을 투여한 후, 혈당, 혈청 insulin, 당대사 관련 간효소인 glucokinase, glucose-6- phosphate dehydrogenase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, acetyl CoA carboxylase의 활성을 조사하였다.
- 간은 적출 전에 간문맥에 0.9%(w/v) NaCl 용액을 주사하여 혈액을 제거한 다음 적출하였으며, 적출한 간은 면도칼로 다진 후 teflon-pestle wheaton elvehjem(Samsung PMC, Daegu, Korea)으로 조직을 파쇄하고 100 mM Tris/HCl, 5 mM EDTA, 10 mM β-mercaptoethanol을 함유한 150 mM KCl 용액(pH 7.4)을 사용하여 20%(w/v) 조직 파쇄액을 제조하였다.
- 6에서 glucose-6-phosphate를 기질로 사용하였을 때 측정되는 효소 활성은 glucose-6-phosphate dehydrogenase와 6-phosphogluconate dehydrogenase의 효소 활성 총합이다. 따라서, glucose-6-phosphate dehydrogenase 효소 활성은 두 효소의 전체 활성과 6-phosphogluconate dehydro-genase의 효소 활성의 차이 값으로 산출하였다. Acetyl CoA carboxylase의 활성 측정을 위해 50 mM Tris/HCl(pH 7.
- 본 실험에 사용한 실험동물은 4주령 Sprague Dawley계 수컷 흰쥐로 (주)오리엔트 바이오(Seoul, Korea)에서 구입하여, 1주일간 사육하여 안정화시킨 후 250～300 g 정도 되는 건강한 쥐들을 선별 5마리씩 그룹화 하여 정상대조군(Normal 군, 당귀 추출물 무투여), streptozotocin 당뇨병 유발군(STZ군), streptozotocin 당뇨병 유발 후, 50% EtOH 당귀 추출물 투여군(STZ+50% EtOH군), streptozotocin 당뇨병 유발 후, 100% EtOH 당귀 추출물 투여군(STZ+100% EtOH군), streptozotocin 당뇨병 유발 후, 물 당귀 추출물 투여군(STZ+H2O군)으로 구분하여 동물실험을 수행하였다.
- 사육 6일째 16시간 절식시켜, 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하여 혈당을 검사하고, 혈당치가 240 mg/dl 이상인 쥐만을 골라 당뇨 유발군으로 선별하였다.
- 실험군을 16시간 절식 후, 채혈한 혈액을 3,000 rpm, 4℃에서 15분간 원심 분리하여 얻은 혈청으로부터 혈당과 인슐린을 측정하였다. 간은 적출 전에 간문맥에 0.
- 2 ml 가하여 반응을 중지시켰다. 이를 5,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 scintillation vial에 옮긴 후, 85℃로 가온하여 60분간 건조시켜, 1 ml의 증류수에 녹이고 cocktail solution(PPO 10 g, POPOP 0.25 g, naphthalene 100 g, dioxane 1 l에 10 ml를 가한 후 tricarb liquid scintillation counter로 방사능을 측정하여 acetyl CoA에 전이된 14CO2 및 생성된 malonyl CoA를 측정함으로써 acetyl CoA carboxylase 효소 활성을 정량하였다.
- Glucose는 glucoseoxidase와 peroxidase의 짝지은 효소반응을 이용하여 생성된 산화형의 o-dianisidine의 흡광도를 425 nm에서 측정하여 정량하였다(Joo 등 1993). 표준곡선은 25～150 mg% 농도의 glucose 표준용액을 이용하였고, 혈청은 같은 부피의 10%(w/v) TCA로 처리하여 원심분리 후 변성된 단백질 침전물을 제거한 상등액의 glucose를 정량하였다.
- 혈청의 insulin 농도는 125I-insulin kit(Shibayagi, Shibukawa, Japan)를 이용하여 radioimmuno assay를 수행하였다.
대상 데이터
- 각각의 추출액은 모아서 여과지(Whatman No.1, London, England)로 여과한 뒤, 감압농축기를 이용하여 45℃에서 최대한 농축한 다음, 동결건조기(Savant SC 100A, Holbrook, NY, USA)를 이용하여 건조 분말화하여 폴리에틸렌 병에 보관하면서 실험시료로 사용하였다.
- 참당귀 추출물은 물과 50% EtOH(v/v), 100% EtOH(v/v) 등 3종류의 용매를 이용하여 제조하였다.
- 한국 경북 영양산 참당귀(Angelica gigas Naki)의 건조 뿌리를 2006년 2월 28일 한국 금산군 인삼약령시장에서 구입하여 추출 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 7) Values with different superscripts within the column are significantly different ad p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- 모든 결과는 SAS package(ver. 12.0)을 이용하여 평균과 표준편차로 표시하였고, 유의성 검정은 분산분석(ANOVA) 및 다중범위검정(Duncan's multiple rang test)을 사용하여 5% 수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 당대사 조절 시험에 필요한 동물의 사육은 Joo 등(1993)의 방법에 준하여 수행하였다.
성능/효과
- 당대사 관련 효소 가운데 glucose-6-phosphate dehydrogenase와 glucose-6-phosphate dehydrogenas는 효과가 나타나지 않았으나, glucokinase의 경우는 STZ+50% EtOH 추출물 투여군이 정상군보다는 낮았지만 STZ군에 비해서는 활성이 유의적으로 높아졌다. Acetyl CoA carboxylase 활성도의 경우는 STZ군에 비해 모든 참당귀 투여군들에서 유의적인 활성 증가가 나타났다.
- 참당귀 추출물의 STZ-유발 당뇨 쥐에서 당대사 관련 간 효소 활성을 확인하고자 간 효소 활성을 분석한 결과는 Table 2와 같다. Glycogen 합성 관련 효소인 glucokinase 활성을 살펴보면, STZ군(17 unit/mg)은 Normal군(56 unit/mg)의 30% 수준으로 낮은 활성을 유지하고 있었고, STZ+50% EtOH군(27 unit/mg)과 STZ+100% EtOH군(21 unit/mg)은 Normal군과 비교 시 48%와 38% 수준의 활성을 나타내므로써 glucokinase 활성개선에 효과를 보인 것으로 생각된다. 그러나 STZ+H2O군(11 unit/mg)은 STZ군과 비교 시 오히려 활성이 감소됨으로써 물 추출은 효과가 없는 것으로 나타났다.
- STZ군에게 3종류의 당귀 추출물을 투여함으로써 혈당량이 감소한 이유가 insulin의 생성에 의한 것인지를 확인하기 위해 평균 혈청 insulin 농도를 측정한 결과, Normal군은 3.94 ng/ml, STZ군은 1.45 ng/ml이었다. 이에 반해 STZ+50% EtOH군과 STZ+100% EtOH군의 insulin 함량은 STZ군과 유사하게, STZ+H2O group은 STZ군에 비하여 극도로 낮게 측정됨으로써 당귀 추출물이 insulin의 증강에는 전혀 영향을 주지 못했음을 알 수 있었다.
- 각각의 시료에 의한 혈당 강하율을 계산하면 STZ+50% EtOH군은 73%, STZ+100% EtOH군은 66%로 streptozotocin 유발 쥐에게 흑삼의 혈당 강하율 74%(Kim & Kang 2009)와 STZ+50% EtOH군은 유사한 수준이었고, EtOH과 STZ+100% EtOH군은 다소 낮은 수준이었다.
- Glycogen 합성 관련 효소인 glucokinase 활성을 살펴보면, STZ군(17 unit/mg)은 Normal군(56 unit/mg)의 30% 수준으로 낮은 활성을 유지하고 있었고, STZ+50% EtOH군(27 unit/mg)과 STZ+100% EtOH군(21 unit/mg)은 Normal군과 비교 시 48%와 38% 수준의 활성을 나타내므로써 glucokinase 활성개선에 효과를 보인 것으로 생각된다. 그러나 STZ+H2O군(11 unit/mg)은 STZ군과 비교 시 오히려 활성이 감소됨으로써 물 추출은 효과가 없는 것으로 나타났다.
- 절식 16시간 후 STZ군의 평균혈당량(391 mg/dl)은 정상군(62 mg/dl)에 비해 유의적으로 높은 수준을 보였으나, STZ+50% EtOH군(104 mg/dl), STZ+100% EtOH군(132 mg/dl)인 참당귀 에탄올 추출물 투여군들의 경우는 STZ군에 비해서는 유의적으로 감소되었고, 정상군보다는 높았지만 정상 수준에 가깝게 감소된 결과를 보였다. 단, STZ+ H2O군(307 mg/dl)의 경우는 STZ군과 유사한 수준으로 혈당 강하에 효과가 없는 것으로 나타났다. 각각의 시료에 의한 혈당 강하율을 계산하면 STZ+50% EtOH군은 73%, STZ+100% EtOH군은 66%로 streptozotocin 유발 쥐에게 흑삼의 혈당 강하율 74%(Kim & Kang 2009)와 STZ+50% EtOH군은 유사한 수준이었고, EtOH과 STZ+100% EtOH군은 다소 낮은 수준이었다.
- Insulin의 경우는 참당귀 추출물 투여에 따른 유의차가 없었다. 당대사 관련 효소 가운데 glucose-6-phosphate dehydrogenase와 glucose-6-phosphate dehydrogenas는 효과가 나타나지 않았으나, glucokinase의 경우는 STZ+50% EtOH 추출물 투여군이 정상군보다는 낮았지만 STZ군에 비해서는 활성이 유의적으로 높아졌다. Acetyl CoA carboxylase 활성도의 경우는 STZ군에 비해 모든 참당귀 투여군들에서 유의적인 활성 증가가 나타났다.
- 최근 Yuan 등(2008)은 제 2형 당뇨병 모델인 db/db mouse를 이용한 실험에서 홍삼을 포함한 생약복합물의 혈당 저하 효과를 확인하였으며, 이러한 혈당 저하 효과는 insulin의 민감성 증가와 간 조직의 peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-αmRNA와 지방조직의 PPAR-γmRNA 단백질 발현 의 증가를 통한 지방대사 조절작용으로 혈당 강하 효과를 나타낸 것으로 해석된다. 따라서 본 실험의 참당귀 추출물 투여군들에서 인슐린 농도는 증가하지 않았지만 혈당이 강하된 것은 인슐린 분비 촉진보다는 부분적으로 인슐린 민감성 증대에 기인하였음을 배제할 수 없으며, 간에서 포도당 이용 촉진 또는 당대사 관련 효소 활성의 개선이 그 요인으로 작용한 것으로 판단된다.
- 29 nmole/min/mg protein으로 Normal군 수준까지 회복되었다. 이러한 결과로부터 참당귀 추출물은 당뇨 유발 쥐의 저하된 acetyl CoA carboxylase 활성 회복에 기여하며, 지방 합성을 용이하도록 작용하는 것으로 판단되었다.
- 즉, STZ군의 효소 활성과 비교된 참당귀 추출물의 투여에 의한 활성 증가의 효과는 glucose-6-phosphate dehydrogenase와 6-phosphogluconate dehydrongenase 모두에서 확인되지 않았다. 이러한 결과로부터 참당귀 추출물은 저하된 glucose-6-phosphate dehydrogenase와 6-phosphogluconate dehydrongenase 활성의 회복에 영향을 주지 못함으로써 포도당 산화과정인 hexose monophosphate pathway를 통한 포도당 소비에는 기여하지 못함이 확인되었다.
- 45 ng/ml이었다. 이에 반해 STZ+50% EtOH군과 STZ+100% EtOH군의 insulin 함량은 STZ군과 유사하게, STZ+H2O group은 STZ군에 비하여 극도로 낮게 측정됨으로써 당귀 추출물이 insulin의 증강에는 전혀 영향을 주지 못했음을 알 수 있었다. 따라서 참당귀 추출물 투여에 의한 혈당량 강하 결과는 insulin이 아닌 다른 원인에 의한 것으로 생각되는데, 이러한 결과는 Kim & Kang(2009)의 제 1형 당뇨 유발 쥐를 이용한 흑삼 추출물 실험에서 insulin의 증가가 확인되지 않았다는 보고와 일치하였고, Joo 등(1993)에 의한 당뇨유발 쥐의 혈중 insulin 농도가 인삼 사포닌 혼합물 투여로 증가되었다는 결과와는 상반되었다.
- O군)으로 나누어 구강 투여 전과 후의 혈당치 및 인슐린 농도를 비교한 결과는 Table 1에 제시된 바와 같다. 절식 16시간 후 STZ군의 평균혈당량(391 mg/dl)은 정상군(62 mg/dl)에 비해 유의적으로 높은 수준을 보였으나, STZ+50% EtOH군(104 mg/dl), STZ+100% EtOH군(132 mg/dl)인 참당귀 에탄올 추출물 투여군들의 경우는 STZ군에 비해서는 유의적으로 감소되었고, 정상군보다는 높았지만 정상 수준에 가깝게 감소된 결과를 보였다. 단, STZ+ H2O군(307 mg/dl)의 경우는 STZ군과 유사한 수준으로 혈당 강하에 효과가 없는 것으로 나타났다.
- Glucose-6- phosphate dehydrogenase 활성의 경우, Normal군(400 unit/mg), STZ군(51 unit/mg), STZ+50% EtOH군(38 unit/mg), STZ+100% EtOH군(69 unit/mg), STZ+H2O군(54 unit/mg)의 활성을 나타내었으며, 6-phosphogluconate dehydrongenase의 효소 활성의 경우는 Normal군(40 unit/mg), STZ군(5 unit/mg), STZ+50% EtOH군(3 unit/mg), STZ+100%EtOH군(4 unit/mg), STZ+H2O군(6 unit/ mg)의 결과를 보임으로써 정상군과 비교하여 효소 활성 개선에 전혀 영향을 미치지 못한 것으로 보여진다. 즉, STZ군의 효소 활성과 비교된 참당귀 추출물의 투여에 의한 활성 증가의 효과는 glucose-6-phosphate dehydrogenase와 6-phosphogluconate dehydrongenase 모두에서 확인되지 않았다. 이러한 결과로부터 참당귀 추출물은 저하된 glucose-6-phosphate dehydrogenase와 6-phosphogluconate dehydrongenase 활성의 회복에 영향을 주지 못함으로써 포도당 산화과정인 hexose monophosphate pathway를 통한 포도당 소비에는 기여하지 못함이 확인되었다.
- 참당귀 추출물이 혈당을 지방으로 전환시켜 혈당을 감소시키는데 관여하는 효소의 활성에 관여하는지를 알아보기 위해 acetyl CoA carboxylase 활성 변화를 측정한 결과, Normal군(0.3 nmole/min/mg protein)에 비해 STZ군(0.17 nmole/min/mg protein)에서 급격하게 감소하였지만, 당귀 추출물을 투여한 STZ+50% EtOH군, STZ+100% EtOH군 및 STZ+H2O군에서는 각각 0.3, 0.31 및 0.29 nmole/min/mg protein으로 Normal군 수준까지 회복되었다. 이러한 결과로부터 참당귀 추출물은 당뇨 유발 쥐의 저하된 acetyl CoA carboxylase 활성 회복에 기여하며, 지방 합성을 용이하도록 작용하는 것으로 판단되었다.
후속연구
- 정리해 보면, 참당귀 50% EtOH 추출물이 혈당 강하 효과가 가장 큰 것으로 보여지는데, 이는 streptozotocin 투여로 상승된 혈당이 참당귀 50% EtOH 추출물 투여로 강하되고, 당대사 관련 효소들의 활성 가운데 glucokinase와 acetyl CoA carboxylase 활성이 증가되었는데, 이는 참당귀 추출물의 성분이 직접 효소 활성에 관여하였거나 간접적으로 효소량의 조절이나 streptozotocin에 의한 췌장 손상의 완화에 관여함으로써 당질 대사에 긍정적인 효과를 발현한 것으로 사료되나, 췌장세포 관련 구체적인 후속 연구가 수행되어야 한다고 본다.
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