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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 사염화탄소 투여로 유발된 흰쥐의 간 손상에 어떠한 면역조절 효과를 나타내는지 확인하고자 흰쥐에 황금 추출물을 투여하여 급성 장기 손상에서 단백질 발현을 확인함과 동시에 면역학적 변화를 관찰하였다.
- 본 연구는 흰쥐에 황금 추출물을 4주간 투여하여 사염화탄소로 유발된 흰쥐에서의 면역 조절 효과를 확인하기 위해 수행되었으며, 간의 면역력을 증강시키는 물질을 찾기 위해 조직 중 liver에서의 면역학적인 효과를 보았다.
제안 방법
- 3회 washing 완충용액으로 세척한 후, TMB를 분주하였다. 10~15분간 incubation 후 ELISA reader로 450 ㎚에서 측정하였으며, 생성량은 표준물질의 반응으로부터 얻어진 표준곡선을 이용하여 환산하였다.
- 실험군은 난괴법에 의해 모두 6마리씩 3군 (control군, CCl4군, CCl4+황금추출물 (SBW)군)으로 나누어 실험하였다. 1주일간 예비사육한 후 control군을 제외한 2군에 대해 간 섬유화 유발을 위해 사염화탄소 (0.5 ㎖/㎏ 체중)를 con oil과 50 : 50의 비율로 희석하여 주 3회 피하주사 하였다. 황금추출물은 체중 당 (㎏) 200 ㎎ 비율로 주 5회 경구 투여하였다.
- NO2−의 농도는 sodium nitrite (NaNO2)를 사용하여 흡광도를 측정한 후 얻은 표준곡선과 비교하여 산출하였다.
- 4 g으로 모든 군에서 실험기간이 지남에 따라 증가하는 것을 나타내었고, 실험식이 섭취군이 대조군에 비해 약간의 증가를 보였다. 사염화탄소 투여에 대한 황금 추출물 섭취가 장기무게에 미치는 효과를 알아보기 위하여 간과 비장의 무게를 측정하였다. 간의 무게는 각각 8.
- 이상적인 항온항습 환경 (22 ± 2℃, 55 ±5%)으로 유지하고, 12시간씩 밤과 낮을 자동 조절하여 적응시켰다. 실험군은 난괴법에 의해 모두 6마리씩 3군 (control군, CCl4군, CCl4+황금추출물 (SBW)군)으로 나누어 실험하였다. 1주일간 예비사육한 후 control군을 제외한 2군에 대해 간 섬유화 유발을 위해 사염화탄소 (0.
- 이상적인 항온항습 환경 (22 ± 2℃, 55 ±5%)으로 유지하고, 12시간씩 밤과 낮을 자동 조절하여 적응시켰다.
- 총 4주에 걸쳐 실험을 진행하였고, 그 후 12시간 절식 후 rat 을 ether로 마취시킨 후 희생을 통하여 혈액을 채취하였으며 간은 적출하여 생리식염수로 세척한 뒤 −70℃에 보관하며 분석에 사용하였다.
- 5 ㎖/㎏ 체중)를 con oil과 50 : 50의 비율로 희석하여 주 3회 피하주사 하였다. 황금추출물은 체중 당 (㎏) 200 ㎎ 비율로 주 5회 경구 투여하였다. 총 4주에 걸쳐 실험을 진행하였고, 그 후 12시간 절식 후 rat 을 ether로 마취시킨 후 희생을 통하여 혈액을 채취하였으며 간은 적출하여 생리식염수로 세척한 뒤 −70℃에 보관하며 분석에 사용하였다.
대상 데이터
- CCl4 (carbon tetrachloride), con oil은 Sigma (Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Lysis buffer (T-PER® Tissue Protein Extraction Reagent)는 Thermo scientific에서 구입하였다.
- Lysis buffer (T-PER® Tissue Protein Extraction Reagent)는 Thermo scientific에서 구입하였다.
- 전라남도 영암에 위치한 천수당 한약방에서 여수산 황금을 구입하였다. 황금 뿌리 100 g을 절편하여 round flask에 넣고 1 L의 증류수를 가한 후 80℃에서 3시간 동안 환류냉각기로 열수 추출하였다.
- 평균체중 120 ± 10 g의 4주령 Sprague-Dawley (SD)계 rat을 (주) Orient로부터 구입하여, 1주일간 식이와 식수는 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 항체 TNF-α, STAT1, pSTAT1, STAT6, pSTAT6는 Cell Signaling Technology에서 IL-4, IFN-γ, GATA-3, T-bet은 Santa Cruz Biotechnology Inc. (California, USA)에서 iNOS는 upstate biotechnology에서 구입하여 사용하였고, 그 외 일반 시약은 Sigma에서 구입하였다.
데이터처리
- 본 연구의 실험결과는 mean ± SE으로 나타내었으며, 각 group간의 통계적 유의성 검증은 SPSS program (ver. 14.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 사용하여 p < 0.05 수준에서 Duncan의 다중비교법을 이용하여 결정하였다.
이론/모형
- CCl4에 의해 손상된 간과 면역기관으로부터 생성된 nitrite를 측정하기 위하여 griess 반응을 이용하였다. 이 방법은 griess 시약의 diazo기가 nitrite를 만나면 분홍색으로 변하게 되는 색의 반응을 이용한 것이다.
- Sandwich ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)법(Lim et al., 2000)을 이용하여 측정하였다. 측정 방법은 50 mM carbonate-bicarbonate buffer와 IgA, IgE 일차항체를 96 well plate의 각 well에 분주한 후 37℃에서 2시간 incubation한다.
- 그 후에 bio rad protein assay방법으로 단백질을 정량하여 100 ug의 단백질을 취했다. western blot법 (Burnette WN, 1981)을 이용하여 측정하였다.
성능/효과
- 17 uM/㎖로 대조군인 CCl4군에 비해 실험식이 섭취군에서 NO 생성 억제를 관찰할 수 있었다. NO 생성 억제기작에 관한 iNOS 단백질의 관련성을 조사하기 위하여 immunoblot analysis를 이용하여 iNOS 단백질의 발현을 조사한 결과, 사염화탄소로 유도된 대조군과 실험식이 섭취군에서 iNOS 단백질이 감소되었고 반대로 정상군에서 늘어난 것을 확인하였다. 즉, iNOS에서 NO를 경유하는 기작에서 iNOS는 미세한 염증 반응을 나타내었고 NO의 생성능에서는 확실한 염증 억제 반응을 확인하였다.
- Th1 임파구로의 분화를 촉진시키는 전사인자인 IFN-γ와 STAT1 그리고 T-bet의 발현은 대조군이 정상군에 비해 높은 발현을 나타내었고, 실험식이 섭취군에서의 발현량이 낮게 나타났으나 pSTAT1의 발현은 반대로 대조군에서 높게 나타났다.
- Th1 임파구로의 분화를 촉진시키는 전사인자인 IFN-γ와 STAT1 그리고 T-bet의 발현은 대조군이 정상군에 비해 높은 발현을 나타내었고, 실험식이 섭취군에서의 발현량이 낮게 나타났으나 pSTAT1의 발현은 반대로 대조군에서 높게 나타났다. Th2 임파구로의 분화를 촉진시키는 전사인자인 IL-4와 pSTAT6 그리고 GATA-3의 발현량은 정상군에 비해 대조군에서 높은 발현을 나타냈고, 실험식이 섭취군에서 발현량이 줄어드는 것을 볼 수 있었다. 하지만 STAT6에서는 정상군에서 대조군과 실험식이 섭취군보다 높은 발현을 나타내었다.
- 간의 무게는 각각 8.4 ± 1.1, 9.1 ± 1.9, 10.6 ± 1.5 g으로 사염화탄소를 투여한 대조군이 정상군에 비해 높았으며, 실험식이 섭취군이 정상군과 대조군보다 높았다.
- 그러나 실험 종료 평균체중이 421.2 ± 17.6, 360.8 ± 36.6, 377.0 ± 31.4 g으로 모든 군에서 실험기간이 지남에 따라 증가하는 것을 나타내었고, 실험식이 섭취군이 대조군에 비해 약간의 증가를 보였다.
- , 2007). 본 실험에서 IL-4, STAT6, pSTAT6 그리고 GATA-3의 발현 정도를 보면 대조군인 사염화탄소 유발군이 정상군보다 높게 발현되었고, 황금 추출물 섭취군이 대조군에 대해 발현량이 줄어든 것을 확인할 수 있었다. 위와 같은 실험결과는 지속적인 사염화탄소와 황금 추출물의 투여로 인해서 면역반응이 일어났음을 알 수 있었다.
- 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 생성을 알아본 결과 각각 5.583 ± 0.14, 10.92 ± 0.86, 7.95 ± 0.17 uM/㎖로 대조군인 CCl4군에 비해 실험식이 섭취군에서 NO 생성 억제를 관찰할 수 있었다.
- 염증단계에 중추적 역할을 하고 있는 cytokine인 TNF-α 발현량은 정상군보다 사염화탄소로 유도한 대조군에서 높은 발현을 보였고, 실험식이 섭취군에서 발현량이 감소하는 것을 나타내었다.
- 이상의 결과를 종합하면 흰쥐에서 사염화탄소의 유도가 immunoglobulin의 생성과 여러 cytokine들의 발현량을 증가시키는 것을 확인할 수 있었으며 황금 추출물에는 사염화탄소로 유발된 간독성에 대하여 항염증에 효과가 있는 것으로 사료된다.
- 이에 IFN-γ, STAT1, pSTAT1 그리고 T-bet의 발현량을 보았을 때 정상군에 대해 사염화탄소 유발군에서 높은 발현을 보였고, 황금 추출물 섭취군에서는 발현량이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.
- NO 생성 억제기작에 관한 iNOS 단백질의 관련성을 조사하기 위하여 immunoblot analysis를 이용하여 iNOS 단백질의 발현을 조사한 결과, 사염화탄소로 유도된 대조군과 실험식이 섭취군에서 iNOS 단백질이 감소되었고 반대로 정상군에서 늘어난 것을 확인하였다. 즉, iNOS에서 NO를 경유하는 기작에서 iNOS는 미세한 염증 반응을 나타내었고 NO의 생성능에서는 확실한 염증 억제 반응을 확인하였다.
- , 1993). 천연물로부터 NO 생성 저해를 알아보기 위해 griess 시약을 이용해 실험한 결과, 정상군에 대해 사염화탄소 투여군에서 NO 생성량이 증가한 것을 볼 수 있었고, 실험식이 섭취군에서는 생성량이 감소하는 것을 볼 수 있었다. 이는 황금 추출물이 사염화탄소 투여로 인해 생성된 NO를 억제시킴으로서 항염증 효과를 나타낼 것으로 생각된다.
- 혈청 IgA 농도는 정상군, 대조군, 실험식이 섭취군에서 각각 116.593 ± 0.048, 131.148 ± 0.053, 115.852 ± 0.045 ng/㎖로 측정되었으며, 사염화탄소로 유도된 군이 다른 군에 비해 생성량이 높았다.
- 혈청 IgE 농도는 정상군, 대조군, 실험식이 섭취군에서 각각 2.694 ± 0.004, 2.906 ± 0.007, 2.024 ± 0.005 ng/㎖로 사염화탄소를 유도한 군에서 다른 군보다 높았으며, 황금 추출물을 섭취한 실험식이 섭취군에서 낮았다.
후속연구
- 체액성 면역반응물질인 면역글로불린은 전체 혈청 단백질의 15~20%를 구성하고 있고 항체활성을 가진 당단백질 (glycoproteins)이다. 황금 추출물 투여군이 혈청에서 antiallergic factor로 작용하는 IgA와 염증에 관여하는 IgE의 생산량의 감소로 면역저하의 예방뿐만 아니라 알러지 반응도 예방이 가능할 것으로 보인다.
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