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문제 정의
- 본 연구에서는 고지방 식이로 유도된 비만 흰쥐에서 녹차추출물의 항산화 및 항염 효과에 대해서 알아보았다. 위의 결과들은 종합해 볼 때 EQS®의 비만으로부터 발생하는 산화적 스트레스에 대해 매우 의미 있는 항산화 효능을 확인하였다.
- 이에 본 연구에서는 항산화 효능을 가지고 있는 녹차에 식이섬유를 첨가시킨 Easy Quick diet-S®(EQS®)가 High fat 동물모델에서 항산화 효과 및 염증반응 cytokine 조절에 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 0.3 mM DPPH 에탄올 용액 1 ㎖에 표준시료로서 식이섬유를 함유한 EQS®를 첨가하여 에탄올로 3 ㎖ 맞춘 후 microplate reader (TECAN, Austria)를 이용하여 517 ㎚에서 최종농도 0.1 mM DPPH에 대한 흡광도의 감소를 측정하였다.
- 6 ㎏))하여 Rat의 체중 약 300 g에 대한 35 ㎍의 식이섬유를 투여하였다. 4주간 실험 종료 후 실험동물은 14시간 이상 절식 시킨 후 ether로 마취시키고 장기를 적출 하였다. 적출한 간 조직은 냉장 생리식염수로 세척하여 무게를 측정하고 액체질소에 급냉시킨 후 실험 전 까지 −70℃의 deep freezer에 보관하였다.
- 고지방으로 유도된 비만흰쥐에서 EQS®의 항산화 활성을 EGCG (Epigallocatechin gallate), 카테킨, 비타민 C와 비교하여 Table 6에 나타냈다. DPPH에 대해 흡광도를 50% 감소시키는데 필요한 항산화 물질의 농도(SC50)로 표현하였다. EGCG가 5.
- Glutathione의 함량측정은 Griffith의 방법을 응용하여 실시하였다 (Griffith et al., 1980). 간 조직을 sonicate homogenizer (60W with 0.
- MDA (malondialdehyde)의 함량측정은 Ohkawa 등의 방법을 응용하여 실시하였다 (Ohkawa et al., 1979). 간 조직을 sonicate homogenizer (60W with 0.
- RNA를 분리하기 위해 TRIZOL reagent (Invitrogen Life Technologies, USA)를 이용하여 total RNA를 분리하였다. RNA의 정량은 50배 희석한 후 UV/vis 분광광도계를 이용하여 260 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다.
- RNA의 정량은 50배 희석한 후 UV/vis 분광광도계를 이용하여 260 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. RT-PCR premix (Bioneer, Korea)와 sense primer와 antisense primer (Bioneer, Korea), RNA, DEPC 처리된 증류수를 넣어 최종부피가 50㎕가 되도록 한 후 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR은 cDNA 합성; 42℃, 60분, predenaturation; 95℃, 5분, denaturation; 95℃, 1분, annealing; 55~65℃, 1분, elongation; 72℃, 1분을 31 cycles 한 다음 인 0.
- RT-PCR premix (Bioneer, Korea)와 sense primer와 antisense primer (Bioneer, Korea), RNA, DEPC 처리된 증류수를 넣어 최종부피가 50㎕가 되도록 한 후 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR은 cDNA 합성; 42℃, 60분, predenaturation; 95℃, 5분, denaturation; 95℃, 1분, annealing; 55~65℃, 1분, elongation; 72℃, 1분을 31 cycles 한 다음 인 0.5 ㎍/㎖ 농도의 ethidium bromide (EtBr; Sigma Chemical Co, USA)이 포함된 1% agarose gel을 사용하여 50 volt에서 40분간 전기영동하여 UV에서 관찰하였다. TNF-α의 유전자 증폭을 위하여 Forward primer: 5'GCGACGTGGAACTGGCCAGAAG-3', Reverse primer: 5'- TCCATGCCGTTGGCCAGGAGG-3' (156 bp, Bioneer, Korea)를 사용하였다.
- , 1980). 간 조직을 sonicate homogenizer (60W with 0.5 second intervals for 1 min)를 이용하여 균질화한 뒤 10분 동안 centrifuge (3000 g, 4℃)한 후 상층액의 총 volume을 측정하였다. 상층액 0.
- , 1979). 간 조직을 sonicate homogenizer (60W with 0.5 second intervals for 1 min)를 이용하여 균질화한 뒤 균질액의 총 volume을 측정하였다. 조직 균질액 0.
- 고지방으로 유도된 비만흰쥐의 산화적 스트레스로 인해 발생하는 산화물인 지질과산화물의 농도 변화를 알아보기 위해 EQS® 투여후 malondialdehyde (MDA)를 측정한 결과는 Fig. 1에 나타내었다.
- 1X TBS-T로 5분간 각각 6번 씻어내고, horseradish peroxidase가 결합된 2차 항체를 실온에서 1시간 반응시킨 후, 다시 1X TBS-T로 5분간 각각 6번 씻어내었다. 그 후, ECL kit에 반응시키고, 현상 및 분석하였다 (Burnette et al., 1981).
- 녹차추출물에 더해 식이섬유와 비타민을 추가하여, 고지방 식이로 유도된 비만 흰쥐의 간에서 녹차성분의 항산화 및 항염증 활성 효과에 대해 연구하고자 녹차혼합물 (EQS®)을 사용하였으며 조성은 Table 1에 나타내었다.
- 식이조성은 Table 2에 나타내었다. 녹차추출물의 투여는 일주일에 5회 (1일 2회) 경구로 4주간 투여하였다. 이는 한국인 표준 체중표를 참조(20~29세의 여성(159 ㎝, 51.
- 생후 4주령의 수컷 Sprague-Dawley rat을 동물 사육실 (실내온도 22 ± 2℃, 상대습도 55 ± 5%, 12 hour light-dark cycle)에서 일주일간 적응시킨 후 체중에 따라 난괴법 (randomized complete block design)으로 그룹당 7마리씩 무 첨가군(control), 고지방 유도군(HF), 고지방 유도군에 녹차혼합물 투여군(HF + EQS®)의 3군으로 분리하였다.
- ) 섭취에 따른 흰쥐의 체중의 변화는 Table 3과 같다. 실험 시작하는 시점의 동물의 체중과 4주후 실험 종료 시 동물을 희생하기 전 체중을 각각 측정하였다. Control군에 비하여 고지방 사료로 유도한 군의 (HF) 체중이 유의적으로 증사하였다.
- 최근 비만을 만성적인 염증상태로 간주하고 있는 연구로 미루어 가장 중요한 pro-inflammatory cytokine의 하나인 tumor necrosis factor-α (TNF-α) protein의 발현을 immunoblotting analysis와 RT-PCR 방법으로 확인하였다.
대상 데이터
- TNF-α의 유전자 증폭을 위하여 Forward primer: 5'GCGACGTGGAACTGGCCAGAAG-3', Reverse primer: 5'- TCCATGCCGTTGGCCAGGAGG-3' (156 bp, Bioneer, Korea)를 사용하였다.
- Trichloroacetic acid, acetic acid volumetric standard (0.1N solution in water), 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), Lglutathione reduced는 Sigma사 제품을 이용했으며 sodium phosphate dibasic dodecahydrate (Na2HPO4·12H2O)는 Fluka 사 제품을 potassium phosphate monobasic (KH2PO4), sodium chloride (NaCl)는 Daejung사 제품을 TEP (1,1,3,3-tetraethoxypropane)는 Sigma사 제품을 malonaldehyde bis-(dimetyl acetal) 99%는 Aldrich사 제품을 4,6-digydroxy-2-mercaptopyrimidine, 98%는 Lancaster사 제품을 각각 이용하였다.
- 9%의 차가운 NaCl 1 ㎖와 n-butanol 5 ㎖를 넣고 10분간 교반 후 15분간 원심분리 (3000 g, 4℃)하여 상층액 200 ㎕씩 취하여 96 well plate에 옮겨 담아 microplate reader (TECAN, Austria)를 이용하여 532 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. standard로는 TEP (1,1,3,3 tetraethoxypropane, Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였다.
- 실험에 사용된 녹차혼합물은 식이섬유가 함유된 건강기능식품 EQ diet-S® (Easy Quick diet-S, EQS®)로, 주된 영양소는 녹차 추출물, 식이섬유 (폴리덱스트로스), 비타민 C 이다.
데이터처리
- 본 연구의 실험결과는 mean ± SD로 나타냈으며, 각 그룹간의 통계처리는 Duncan's multiple range test를 이용하였다.
이론/모형
- 5 ㎖ tube로 옮겼다. 단백질 농도는 Bradford protein assay에 의해 정량하였다. 20~30 ㎍의 lysate를 12~15% mini gel SDS-PAGE로 변성 분리하여, PVDF membrane (Millipore Corporation, MA, USA)에 300 mA로 60분간 transfer 하였다.
- 전자공여능 (EDA; electron donating abilities)을 측정하기 위하여 자유라디칼인 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 사용한 항산화 활성 측정방법을 이용하였다 (Xiong et al., 1996; Brand et al., 1995). 고지방으로 유도된 비만흰쥐에서 EQS®의 항산화 활성을 EGCG (Epigallocatechin gallate), 카테킨, 비타민 C와 비교하여 Table 6에 나타냈다.
- 항산화 활성은 DPPH법 (Brand et al., 1995)을 응용하여 시료의 라디칼 소거능을 측정하였다. DPPH는 짙은 자주색을 나타내며 그 자체가 질소 중심의 라디칼로서, 라디칼 전자의 비 편재화에 의해 안정화된 상태로 존재한다.
성능/효과
- EGCG가 5.5 µM로 가장 낮고 catechin 이 14 µM, 비타민 C가 22 µM로서 가장 높은데, 중량으로 나타내었을 경우 분자량의 차이로 인해 EGCG, catechin, 비타민 C가 각각 2.5 ㎎/L, 4.2 ㎎/L, 3.9 ㎎/L로 나타났다.
- EQS®군이 HF군에 비해 GSH의 활성양이 현저히 감소된 것으로 보아 EQS®의 섭취가 GSH를 감소시키는데 효능이 있음을 확인할 수 있다.
- EQS®를 투여한 군은 HF에 비해 MDA 수치가 유의적으로 감소하였다.
- Fig. 1에서와 같이 HF+EQS®군에서 MDA의 수치가 낮아진 것으로 보아 EQS®의 투여로 인해 간 조직내 지질과산화물의 생성을 감소시켜 세포 손상으로부터 보호될 것으로 사료된다.
- 따라서 EQS®가 DPPH에 미치는 Table 6의 결과로 보아 항산화 활성에 효능이 있음을 확인할 수 있었다.
- 식이섬유를 함유한 EQS®의 SC50 값을 이들 순수 항산화 물질과 비교하는 경우 12.2 ㎎/L로서 가장 낮은 항산화 활성을 보였으나, 단일물질이 아닌 복합 추출물로 보았을 때 상당히 좋은 활성을 보여준다.
- 위의 결과들은 종합해 볼 때 EQS®의 비만으로부터 발생하는 산화적 스트레스에 대해 매우 의미 있는 항산화 효능을 확인하였다.
- 이 결과로 EQS®의 섭취가 비만으로 유도된 MDA 수치를 감소시키는데 효능이 있음을 시사한다.
후속연구
- 이는 향후 EQS®가 비만에 의해 발생하는 질환과 간에서 지질과 산화, 자유 라디칼 소거능 및 관련 cytokine과 연관된 항산화 관련 질환의 예방 및 치료에 긍정적인 적용이 가능할 것으로 사료된다.
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