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문제 정의
- 본 연구는 황련과 단삼 2종 생약을 대상으로 HPLC-UV를 이용하여 지표성분의 분석법을 확립하였으며, 확립된 분석법을 이용해 생약의 표준화된 추출물을 확보하고 실온과 냉장의 보관조건에서 지표성분의 변화를 확인함으로써 독성시험에 사용하는 생약 추출물의 안정성을 확인하고자 하였다.
제안 방법
- − 2종의 생약의 열수 추출물을 동결건조한 분말의 안정성 실험을 위해 시료를 실온과 냉장에 5개월 보관하면서 0, 1, 2, 3, 5 개월에 각각의 시료를 설정된 HPLC 조건에서 분석하였다.
- −황련과 단삼의 생약추출물에 대한 안정성 자료를 얻고자, 각각의 추출물을 실온과 냉장에 보관하고 5개월간 일정 기간 간격 (1, 2, 3, 5 개월)으로 육안 관찰하고 유효성분 함량평가를 수행하였다.
- 2 kg의 MeOH 엑스를 얻었다. MeOH 엑스를 10% MeOH로 현탁하고 CH2Cl2, BuOH 및 H2O 순으로 계통 분획하여 각각 230 g, 1100 g, 840 g의 분획물을 얻었다. BuOH 분획물을 silica gel, MCI-CHP20 및 Sephadex LH-20 column chromatography와 CH2Cl2-MeOH의 용매를 사용하여 berberine, coptisine, palmatine을 분리하였다.
- − 2종의 생약의 열수 추출물을 동결건조한 분말의 안정성 실험을 위해 시료를 실온과 냉장에 5개월 보관하면서 0, 1, 2, 3, 5 개월에 각각의 시료를 설정된 HPLC 조건에서 분석하였다. 각각의 시료는 일정 양씩 3개의 EP-tube에 취하고 60분간 sonication 후 membrane filter로 여과한 후 HPLC로 분석하였다.
- −문헌 등의 자료를 토대로 지표물질을 선정하였고, Table I과 같은 조건으로 분석하였다. 각각의 지표성분은 검량선을 작성하여 생약 추출물의 함량을 평가하였다.
- BuOH 분획물을 silica gel, MCI-CHP20 및 Sephadex LH-20 column chromatography와 CH2Cl2-MeOH의 용매를 사용하여 berberine, coptisine, palmatine을 분리하였다. 물 분획물을 MCI-CHP20 및 Sephadex LH-20 column chromatography와 CH2Cl2-MeOH의 용매를 사용하여 epiberberine을 분리하였다.28)
- 각각의 성분은 HPLC-UV detector와 RP C-18 column으로 분석이 가능하였다. 추출생약재의 장기보존에 따른 안정성 시험을 위해 시료는 실온과 냉장고에 보관하였고, 실험기간은 각각 5개월간 HPLC로 분석하여 각각의 peak의 pattern과 함량으로 2종 생약의 안정성을 확인하였다. 이러한 생약 시료의 표준화와 안정성 결과는 독성시험 결과의 신뢰성을 확보하고 생약의 유통과정의 효율적 품질 관리 개선에도 활용이 가능하다고 기대된다.
대상 데이터
- − berberine, coptisine, palmatine 및 epiberberine은 황련 (Coptidis Rhizoma)에서 분리하여 사용하였고, tanshinone I, tanshinone II, cryptotanshinone 및 dihydrodanshinone은 단삼 (Salviae Miltiorrhizae Radix)에서 분리한 화합물을 안동대학교 손건호 교수님에게 제공받아 사용하였다.
- −본 연구에 사용한 2종의 생약, 황련과 단삼은 유통되는 생약을 기원별, 산지별로 구입하여 기원, 성상, 색상, 냄새 등을 기준으로 생약감별 자문위원회 (한국생명공학연구원, 이형규 박사; 충남대학교, 김영호 교수; 한국화학 연구원, 유시용 박사; 충남대학교, 배기환 교수; 대구가톨릭대학교, 민병선 교수)의 감별을 거쳐 선별하였고 선정된 시료는 대구가톨릭대학교 약학대학 표본실에 보관되어 있다(황련, CUD-3171-1; 단삼, CUD-2617-1).
- −생약 추출물 100 mg에 70% MeOH 10 mL를 가하여 HPLC분석용 시료로 사용하였다. Coptisine, palmatine, berberine, epiberberine, tanshinone I, tanshinone II, cryptotanshinone 및 dihydrodanshinone 각각 70% MeOH로 1 mg/mL 농도로 녹여 표준액으로 사용하였다. 분석용 표준액과 검액은 membrane filter로 여과한 후 사용하였다.
- HPLC system은 Gilson사의 306 pump, 811C dynamic mixer, UV/VIS-156 detector, 231 XL sample injector 및 GILSON UniPoint data를 사용하였으며 column은 Agilent Technologies사의 Agilent Eclipse XD8-C18(5 μm, 4.6×150 mm)를 사용하였다.
- HPLC 용매는 Burdick & Jackson사의 Methanol 및 acetonitrile을 사용하였고, H2O는 Milli-Q로 처리한 물을 사용하였다.
- 생약재의 독성실험을 위한 추출물은 식약청고시 2003-17, 표준탕제 제조법에 따라 추출 제조하였다. 추출물의 함량분석을 위해 황련의 지표성분은 epiberberine, coptisine, palmatine 및 berberine으로, 단삼의 지표성분은 dihydrotanshinone, cryptotanshinone, tanshinone I 및 tanshinone II로 선정하였다. 각각의 성분은 HPLC-UV detector와 RP C-18 column으로 분석이 가능하였다.
- −본 연구에 사용한 2종의 생약, 황련과 단삼은 유통되는 생약을 기원별, 산지별로 구입하여 기원, 성상, 색상, 냄새 등을 기준으로 생약감별 자문위원회 (한국생명공학연구원, 이형규 박사; 충남대학교, 김영호 교수; 한국화학 연구원, 유시용 박사; 충남대학교, 배기환 교수; 대구가톨릭대학교, 민병선 교수)의 감별을 거쳐 선별하였고 선정된 시료는 대구가톨릭대학교 약학대학 표본실에 보관되어 있다(황련, CUD-3171-1; 단삼, CUD-2617-1). 황련 (Coptidis Rhizoma)과 단삼 (Salviae Miltiorrhizae Radix) 모두 중국산을 사용하였다. 각 생약은 식품의약품안전청 고시 2003-17, 안전성 유효성심사규정에 준한 표준탕제 제조법에 따라 열수추출하고 이를 농축한 후 동결 건조하여 사용하였다.
이론/모형
- 황련 (Coptidis Rhizoma)과 단삼 (Salviae Miltiorrhizae Radix) 모두 중국산을 사용하였다. 각 생약은 식품의약품안전청 고시 2003-17, 안전성 유효성심사규정에 준한 표준탕제 제조법에 따라 열수추출하고 이를 농축한 후 동결 건조하여 사용하였다.27)
- 생약재의 독성실험을 위한 추출물은 식약청고시 2003-17, 표준탕제 제조법에 따라 추출 제조하였다. 추출물의 함량분석을 위해 황련의 지표성분은 epiberberine, coptisine, palmatine 및 berberine으로, 단삼의 지표성분은 dihydrotanshinone, cryptotanshinone, tanshinone I 및 tanshinone II로 선정하였다.
성능/효과
- 1) 본 연구에서는 2종의 생약에 대표적인 생리활성을 보이며 주성분인 황련 (Coptidis Rhizoma)에서는 coptisine, palmatine, berberine 및 epiberberine을 지표성분으로, 단삼 (Salviae Miltiorrhizae Radix)은 tanshinone I, tanshinone II, cryptotanshinone 및 dihydrodanshinone을 지표성분으로 각각 설정하였다 (Fig. 1). 각각의 지표성분 HPLC 분석은 Table I의 조건으로 4가지 성분이 resolution 2 이상으로 완전히 분리되어 성분의 농도 결정에 방해를 받지 않았다.
- 규격을 설정하여 관리하는 생약은 대한약전에 130종과 생약규격집에 385종으로 총 515종의 한약재가 수재되고 관리되고 있으나 이들의 인체에 대한 안전성 연구는 매우 미흡한 실정이다.1) 특히 마두령 (Aristolochiae Fructus)은 쥐방울과 (Aristolochiaceae)의 쥐방울덩굴 (Aristolchia contorta) 과실로 뱀독의 해독제나 진통, 소염제 등으로 사용되었던 생약재이다. 마두령의 주성분은 aristolochic acid으로 알려져 있으며 최근 여러 동물 실험에서 발암성, 유전독성 및 신장독성이 확인되었고, 사람에게서도 aristolochic acid가 다량 함유된 다이어트 제재를 장기 복용한 경우 신장독성과 발암성이 보고되면서 생약재의 독성에 대한 관심이 높아지고 있어 생약에 대한 과학적이고 체계적인 안전성 평가자료 확보가 절실히 필요하다.
- BuOH-soluble fraction과 물층을 silica gel, MCI-CHP20 및 Sephadex LH-20 column chromatography를 반복실시하고 일부 분획물은 MeOH로 재결정하여 4종의 화합물을 분리하였다. 4종의 화합물은 1H-NMR과 13C-NMR spectroscopic data로 coptisine, palmatine, berberine, epiberberine임을 확인할 수 있었으며 이들의 NMR data는 문헌에 보고된 data와 일치하였다.29-30)
- 단삼의 추출물 HPLC 분석 결과 dihydrotanshinone, cryptotanshinone, tanshinone I 및 tanshinone II가 상기의 분석조건에서 검출되었고, 4가지 성분 중 dihydrotanshinone이 주요성분으로 확인 되었으며 tanshinone II는 시험에 사용한 단삼에서는 검출되지 않았다. 5개월 동안 실온과 냉장 조건에서 보관한 시료도 추출 시 분석한 시료의 chromatogram과 차이가 없으며 성분함량도 일정하여 단삼의 물 추출물은 안정성이 확보되었다.
- 31) 그러나 황련의 분석에서 주로 4가지 성분이 검출되었고 다른 성분은 상기의 HPLC 분석조건에서 검출되지 않아 4가지 성분이 황련의 주요 alkaloid 임을 확인하였다. 5개월 동안 실온과 냉장 조건에서 보관한 시료도 추출 시 분석한 시료의 함량에는 차이가 없어 황련의 물 추출물은 안정함을 확인할 수 있었다. 단삼의 추출물 HPLC 분석 결과 dihydrotanshinone, cryptotanshinone, tanshinone I 및 tanshinone II가 상기의 분석조건에서 검출되었고, 4가지 성분 중 dihydrotanshinone이 주요성분으로 확인 되었으며 tanshinone II는 시험에 사용한 단삼에서는 검출되지 않았다.
- 5개월 동안 실온과 냉장 조건에서 보관한 시료도 추출 시 분석한 시료의 함량에는 차이가 없어 황련의 물 추출물은 안정함을 확인할 수 있었다. 단삼의 추출물 HPLC 분석 결과 dihydrotanshinone, cryptotanshinone, tanshinone I 및 tanshinone II가 상기의 분석조건에서 검출되었고, 4가지 성분 중 dihydrotanshinone이 주요성분으로 확인 되었으며 tanshinone II는 시험에 사용한 단삼에서는 검출되지 않았다. 5개월 동안 실온과 냉장 조건에서 보관한 시료도 추출 시 분석한 시료의 chromatogram과 차이가 없으며 성분함량도 일정하여 단삼의 물 추출물은 안정성이 확보되었다.
- 각각의 지표성분 HPLC 분석은 Table I의 조건으로 4가지 성분이 resolution 2 이상으로 완전히 분리되어 성분의 농도 결정에 방해를 받지 않았다. 상기의 분석 조건으로 각 지표성분의 검량선을 작성한 결과 r2이 0.995 이상으로 높은 직선성이 확인되었다 (Table II).
- 지표성분의 함량은 Fig. 2와 Table III과 같으며 황련의 추출물 HPLC 분석 결과 epiberberine, coptisine, palmatine 및 berberine이 분석조건에서 검출되었고, 4가지 성분 중 berberine이 주요성분으로 확인 되었다. 대한약전에서 황련의 berberine의 함량은 4.
후속연구
- 추출생약재의 장기보존에 따른 안정성 시험을 위해 시료는 실온과 냉장고에 보관하였고, 실험기간은 각각 5개월간 HPLC로 분석하여 각각의 peak의 pattern과 함량으로 2종 생약의 안정성을 확인하였다. 이러한 생약 시료의 표준화와 안정성 결과는 독성시험 결과의 신뢰성을 확보하고 생약의 유통과정의 효율적 품질 관리 개선에도 활용이 가능하다고 기대된다.
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