연구배경: Uteroglobin (UG)은 폐를 비롯한 우리 몸의 대부분의 표피세포에서 생성되는 면역조절능을 가진 분비단백이다. UG의 과발현은 cyclooxygenase (COX)-2의 발현의 감소 및 암세포의 성장억제와 관련이 있다. Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO)는 kynurenine pathway를 통해 tryptophan을 이화시키는 효소로서, 국소적으로 tryptopha을 고갈시키고 tryptophan 대사물을 생성 함으로써 T 세포의 면역반응을 억제시키는 데 기여한다. 방 법: 본 연구에서는 여러 비소세포폐암세포주, 특히 A549에서 COX-2와 IDO의 발현양상 및 UG transduction 이 COX-2 및 IDO의 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. 결 과: A549와 H460에서 구조적으로 COX-2와 IDO가 모두 발현되었고, COX-2 및 IDO의 발현은 UG transduction에 의해 감소되었다. A549에 IFN-$\gamma$를 투여했을때 COX-2 및 IDO의 발현이 약간 증가하였고, 이는 UGtransduction 시행 후 다시 감소하였다. 그러나, A549에 UG transduction 시행하여 감소된 COX-2, IDO의 발현은 IFN-$\gamma$ 투여 후에도 증가하지 않았다. A549 COX-2 sense와 A549 COX-2 anti-sense (siRNA 감염) 세포주 모두에서 COX-2의 발현여부와 상관없이 IDO가 발현되었고, UG transduction으로 인해 IDO의 발현이 감소하였다. 결 론: 이러한 결과는 UG의 세포성장억제 기능이 COX-2를 통한 기전과는 독립적으로 IDO의 면역관용 기전과 관련될 가능성이 있음을 시사한다.
연구배경: Uteroglobin (UG)은 폐를 비롯한 우리 몸의 대부분의 표피세포에서 생성되는 면역조절능을 가진 분비단백이다. UG의 과발현은 cyclooxygenase (COX)-2의 발현의 감소 및 암세포의 성장억제와 관련이 있다. Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO)는 kynurenine pathway를 통해 tryptophan을 이화시키는 효소로서, 국소적으로 tryptopha을 고갈시키고 tryptophan 대사물을 생성 함으로써 T 세포의 면역반응을 억제시키는 데 기여한다. 방 법: 본 연구에서는 여러 비소세포폐암 세포주, 특히 A549에서 COX-2와 IDO의 발현양상 및 UG transduction 이 COX-2 및 IDO의 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. 결 과: A549와 H460에서 구조적으로 COX-2와 IDO가 모두 발현되었고, COX-2 및 IDO의 발현은 UG transduction에 의해 감소되었다. A549에 IFN-$\gamma$를 투여했을때 COX-2 및 IDO의 발현이 약간 증가하였고, 이는 UGtransduction 시행 후 다시 감소하였다. 그러나, A549에 UG transduction 시행하여 감소된 COX-2, IDO의 발현은 IFN-$\gamma$ 투여 후에도 증가하지 않았다. A549 COX-2 sense와 A549 COX-2 anti-sense (siRNA 감염) 세포주 모두에서 COX-2의 발현여부와 상관없이 IDO가 발현되었고, UG transduction으로 인해 IDO의 발현이 감소하였다. 결 론: 이러한 결과는 UG의 세포성장억제 기능이 COX-2를 통한 기전과는 독립적으로 IDO의 면역관용 기전과 관련될 가능성이 있음을 시사한다.
Background: Uteroglobin (UG) is a secretary protein that has strong immunomodulatory properties, and which is synthesized in most epithelia including lung tissue. Overexpression of UG is associated with decreased expression of cyclooxygenase (COX)-2 and suppression of cancer cell growth. Indoleamine...
Background: Uteroglobin (UG) is a secretary protein that has strong immunomodulatory properties, and which is synthesized in most epithelia including lung tissue. Overexpression of UG is associated with decreased expression of cyclooxygenase (COX)-2 and suppression of cancer cell growth. Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) catalyzes tryptophan along the kynurenine pathway, and both the reduction in local tryptophan and the production of tryptophan metabolites contribute to the immunosuppressive effects of IDO. Methods: In this study, we investigated the pattern of expression of COX-2 and IDO, and the effect of UG transduction in the expression of COX-2 and IDO in several non-small cell lung cancer cell lines, especially A549. Results: Both COX-2 and IDO were constitutionally expressed in A549 and H460 cells, and was reduced by UG transduction. In A549 cells, the slightly increased expression of COX-2 and IDO with the instillation of interferon-gamma (IFN-$\gamma$) was reduced by UG transduction. However, the reduced expression of COX-2 and IDO by UG transduction was not increased with IFN-$\gamma$ instillation in A549 cells. In both the A549 COX-2 sense and the A549 COX-2 anti-sense small interfering RNA (siRNA)-transfected cells, IDO was expressed; expression was reduced by UG transduction, irrespective of the expression of COX-2. Conclusion: The results suggest that the anti-proliferative function of UG may be associated with the immune tolerance pathway of IDO, which is independent of the COX-2 pathway.
Background: Uteroglobin (UG) is a secretary protein that has strong immunomodulatory properties, and which is synthesized in most epithelia including lung tissue. Overexpression of UG is associated with decreased expression of cyclooxygenase (COX)-2 and suppression of cancer cell growth. Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) catalyzes tryptophan along the kynurenine pathway, and both the reduction in local tryptophan and the production of tryptophan metabolites contribute to the immunosuppressive effects of IDO. Methods: In this study, we investigated the pattern of expression of COX-2 and IDO, and the effect of UG transduction in the expression of COX-2 and IDO in several non-small cell lung cancer cell lines, especially A549. Results: Both COX-2 and IDO were constitutionally expressed in A549 and H460 cells, and was reduced by UG transduction. In A549 cells, the slightly increased expression of COX-2 and IDO with the instillation of interferon-gamma (IFN-$\gamma$) was reduced by UG transduction. However, the reduced expression of COX-2 and IDO by UG transduction was not increased with IFN-$\gamma$ instillation in A549 cells. In both the A549 COX-2 sense and the A549 COX-2 anti-sense small interfering RNA (siRNA)-transfected cells, IDO was expressed; expression was reduced by UG transduction, irrespective of the expression of COX-2. Conclusion: The results suggest that the anti-proliferative function of UG may be associated with the immune tolerance pathway of IDO, which is independent of the COX-2 pathway.
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문제 정의
본 연구에서는 먼저, 비소세포폐암 세포주에서 COX-2, IDO의 발현양상 및 UG transduction이 COX-2, IDO의 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. 다음으로, COX-2를 항상 발현시킨 암세포주와 COX-2 발현을 억제한 암세포주에서 UG transduction에 의한 IDO의 발현 양상의 변화를 살펴봄으로써 UG와 IDO 사이의 직접적인 관련성을 보고자 하였다.
방법: 본 연구에서는 여러 비소세포폐암 세포주, 특히 A549에서 COX-2와 IDO의 발현양상 및 UG transduction 이 COX-2 및 IDO의 발현에 미치는 영향을 살펴보았다.
본 연구에서는 먼저, 비소세포폐암 세포주에서 COX-2, IDO의 발현양상 및 UG transduction이 COX-2, IDO의 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. 다음으로, COX-2를 항상 발현시킨 암세포주와 COX-2 발현을 억제한 암세포주에서 UG transduction에 의한 IDO의 발현 양상의 변화를 살펴봄으로써 UG와 IDO 사이의 직접적인 관련성을 보고자 하였다.
제안 방법
siRNA transfection은 A549 세포주가 well의 70%가 찰 때까지 키운 후 50 nmol의 COX-2 gene-specific siRNA를 HiPerFect Transfection 시약과 섞으면서 부드럽게 세포에 주입하여 48∼72시간 동안 감염시키는 과정으로 진행하였다.
각각의 세포주를 1×106/mL으로 플레이트에 준비한 후 한 플레이트의 세포를 떼어, 살아있는 세포의 수를 측정하였다.
각각의 세포주를 37℃, 5% CO2 조건 하에서 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (60 μg/mL), streptomycin (100 μg/mL)이 첨가된 RPMI 1640 배지에 배양하였다.
비소세포폐암 세포주인 A549를 control 군, Ad-UG transduction을 시행한 군, IFN-γ (1,000 U) instillation을 시행한 군, IFN-γ instillation 12시간 후 Ad-UG transduction을 시행한 군, Ad-UG transduction 36시간 후 IFN-γ instillation을 시행한 군으로 나누어서 배양한 후 단백질을 추출하고 Western 분석법을 통해 COX-2 및 IDO의 발현 양상을 분석하였다.
비소세포폐암 세포주인 A549를 아무 처리도 하지 않은 대조군, Ad-UG transduction을 한 군, IFN-γ (1,000 U) instillation을 한 군, IFN-γ instillation 12시간 후에 Ad-UG transduction을 한 군, Ad-UG transduction 36시간 후에 IFN-γ instillation 한 군으로 나누어 배양한 후 단백질을 추출하여 Western 분석법을 통해 COX-2 및 IDO의 발현 양상을 분석하였다.
충분히 배양된 A549를 비롯한 각각의 세포주 및 Ad-UG transduction 시행 후 추가 배양한 A549 세포주를 whole lysis buffer (0.1% NP-40, 5 mM EDTA, 50 mM Tris [pH 7.5∼8.0], 250 mM NaCl, 50 mM NaF)를 이용하여 총세포 단백을 추출하였다.
대상 데이터
COX-2가 항상 발현하도록 A549에 COX-2를 transfection한 A549 COX-2 sense 세포주와 A549에 small interfering RNA (siRNA)를 transfection해 COX-2의 발현을 억제시킨 A549 COX-2 anti-sense 세포주를 배양하여 사용하였다. siRNA transfection은 A549 세포주가 well의 70%가 찰 때까지 키운 후 50 nmol의 COX-2 gene-specific siRNA를 HiPerFect Transfection 시약과 섞으면서 부드럽게 세포에 주입하여 48∼72시간 동안 감염시키는 과정으로 진행하였다.
비소세포폐암 세포주인 A549가 COX-2를 항상 발현하도록 한 COX-2 sense 세포주에서 COX-2와 함께 IDO의 발현도 관찰되었다. 여기에 Ad-UG transduction을 했을때 COX-2와 IDO의 발현이 모두 감소하였다(Figure 3A).
세포주는 비소세포폐암 세포주인 A549, H460, H157을 사용하였다. 각각의 세포주를 37℃, 5% CO2 조건 하에서 10% fetal bovine serum (FBS), penicillin (60 μg/mL), streptomycin (100 μg/mL)이 첨가된 RPMI 1640 배지에 배양하였다.
이론/모형
젤 상의 단백질을 nitrocellulose membrane으로 이동시키고, 이 membrane을 blocking solution (5% skim milk in 1×PBS/ Tween 20)으로 1시간 동안 block시킨 후 IDO와 COX-2, actin에 대한 1차 항체를 12시간 동안 반응시켰다. 세척 후에 2차 항체를 반응시킨 후 면역 신호의 검출은 ECL Western blotting detection system (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 이용하였다.
성능/효과
그러나, A549에 UG transduction 시행하여 감소된 COX-2, IDO의 발현은 IFN-γ 투여 후에도 증가하지 않았다. A549 COX-2 sense 와 A549 COX-2 anti-sense (siRNA 감염) 세포주 모두에서 COX-2의 발현여부와 상관없이 IDO가 발현되었고, UG transduction으로 인해 IDO의 발현이 감소하였다.
IDO의 발현과 COX-2의 발현의 연관성을 보기 위해 비소세포폐암 세포주인 A549를 IFN-γ로 자극하여 COX-2, IDO의 발현을 증가시킨 군과 IFN-γ instillation 후 UG transduction을 한 군을 비교했을 때 IFN-γ instillation 후 UG transduction을 한 군에서 COX-2 및 IDO가 모두 감소 되었다.
IFN-γ instillation을 먼저 시행한 후 UG transduction을 시행한 군의 경우 IFN-γ instillation만 시행한 군에 비해 COX-2 및 IDO의 발현이 모두 감소하였다.
결과: A549와 H460에서 구조적으로 COX-2와 IDO 가 모두 발현되었고, COX-2 및 IDO의 발현은 UG transduction에 의해 감소되었다. A549에 IFN-γ를 투여했을때 COX-2 및 IDO의 발현이 약간 증가하였고, 이는 UG transduction 시행 후 다시 감소하였다.
결론: 이러한 결과는 UG의 세포성장억제 기능이 COX-2를 통한 기전과는 독립적으로 IDO의 면역관용 기전과 관련될 가능성이 있음을 시사한다.
이렇듯 COX-2와 IDO의 발현 사이에 관련성이 있음이 제기되고 있으며, 본 연구에서도 A549, H460에서 UG transduction으로 인해 COX-2와 IDO의 발현이 함께 감소하는 결과를 보였다. 그러나, 본 연구에서는 COX-2가 항상 발현되도록 처치한 A549뿐 아니라 siRNA transfection을 통해 COX-2의 발현을 억제한 A549에서도 UG transduction으로 인해 IDO의 발현이 감소하는 결과를 보였다. 이러한 결과는 UG의 세포성장억제 기능이 COX-2 를 통한 기전과는 독립적으로 IDO의 면역관용 기전과 관련될 가능성이 있음을 시사한다.
첫 번째는 tryptophan 대사물에 의한 면역저하가 있는데, IDO가 활성화되면서 tryptophan으로부터 Kynurenines 및 Kynurenine 유도체인 3-hydroxyanthranilic acids나 quinolinic acids가 생성되고, 이러한 대사산물이 면역 T 세포(CD4+)의 증식을 억제하고, apoptosis를 유발함으로써 면역저하에 기여한다14. 두 번째는 IDO 효소활성의 결과로 면역 T 세포의 증식에 필요한 tryptophan이 국소적으로 부족하게 되어 T 세포의 세포주기를 정지시키고, T 세포의 anergy를 야기함으로써 면역저하를 유발한다. IDO 에 의한 면역 저하는 종양 주위뿐만 아니라 종양세포가 유출되는 림프절에서도 일어나게 되는데, 종양세포에 접촉한 IDO를 발현하는 수지상세포(dendritic cells)가 림프 절에 도착하면 직접 종양에 반응하는 면역 T 세포를 억제하고 무기력화시킬 뿐만 아니라, IDO를 발현하지 않는 수지상세포와 반응하는 주위의 면역 T 세포의 반응도 억제 시킨다.
그러나, 본 연구에서는 COX-2가 항상 발현되도록 처치한 A549뿐 아니라 siRNA transfection을 통해 COX-2의 발현을 억제한 A549에서도 UG transduction으로 인해 IDO의 발현이 감소하는 결과를 보였다. 이러한 결과는 UG의 세포성장억제 기능이 COX-2 를 통한 기전과는 독립적으로 IDO의 면역관용 기전과 관련될 가능성이 있음을 시사한다. 향후 IDO의 발현이 없었던 H157에서 UG transduction이 세포성장에 영향을 미치지 않음을 MTT assay 등을 통해 확인한다면, UG의 세포 성장억제와 IDO의 관련성을 좀 더 명확히 밝힐 수 있을 것이다.
또한 Basu 등23은 COX-2를 특이적으로 억제한 경우 종양의 미세환경에서 IDO의 발현이 감소함을 보고 하였다. 이렇듯 COX-2와 IDO의 발현 사이에 관련성이 있음이 제기되고 있으며, 본 연구에서도 A549, H460에서 UG transduction으로 인해 COX-2와 IDO의 발현이 함께 감소하는 결과를 보였다. 그러나, 본 연구에서는 COX-2가 항상 발현되도록 처치한 A549뿐 아니라 siRNA transfection을 통해 COX-2의 발현을 억제한 A549에서도 UG transduction으로 인해 IDO의 발현이 감소하는 결과를 보였다.
이번 연구에서 비소세포폐암 세포주인 A549, H460, H157에서 COX-2와 IDO의 발현 양상을 살펴보았을 때 A549, H460에서는 구조적으로 COX-2와 IDO가 발현되었 고, UG transduction에 의해서 COX-2 및 IDO의 발현이 모두 감소하였다. IDO의 발현이 없었던 H157에서도 COX-2가 발현되었고, UG transduction으로 인해 COX-2 의 발현이 감소하였다.
후속연구
(B) Transfection with COX-2 siRNA (50 nM) to A549 cell inhibited not IDO but COX-2. (C) A549 COX-2 sense cell transfected with siRNA (50 nM) had same result B. Uteroglobin suppressed IDO protein level both B and C. It need further study about IDO enzyme activity test with uteroglobin.
이러한 결과는 UG의 세포성장억제 기능이 COX-2 를 통한 기전과는 독립적으로 IDO의 면역관용 기전과 관련될 가능성이 있음을 시사한다. 향후 IDO의 발현이 없었던 H157에서 UG transduction이 세포성장에 영향을 미치지 않음을 MTT assay 등을 통해 확인한다면, UG의 세포 성장억제와 IDO의 관련성을 좀 더 명확히 밝힐 수 있을 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Uteroglobin는 무엇으로 이루어져 있나?
Uteroglobin (UG)은 70개 아미노산으로 구성된 두 개의 단백으로 이루어져 있고, 자궁, 폐, 유선, 전립선 등 여러 장기의 점막 세포에서 분비되며, 혈액, 뇨, BAL fluid 에서 검출된다. UG는 장기에 따라 많은 이름으로 불려지고 있는데, 폐의 경우 Clara cell에서 발견되어 Clara Cell 분비 단백질(CCSP)이라고 불려진다1.
Cyclooxygenase이란 무엇인가?
Cyclooxygenase (COX)는 아라키돈산을 프로스타노이드로 바꾸는 과정의 속도제한 효소(rate limiting enzyme) 이다. COX-1과 이성체로 존재하는 COX-2는 알레르기 매개물질 및 박테리아의 lipopolysaccharide의 자극 등에 의해 트롬복산이나 프로스타글란딘을 생성하여 염증 반응에 관여한다고 알려져 있었다.
Uteroglobin의 생물학적인 작용은 무엇인가?
UG는 장기에 따라 많은 이름으로 불려지고 있는데, 폐의 경우 Clara cell에서 발견되어 Clara Cell 분비 단백질(CCSP)이라고 불려진다1. 그 생물학적인 작용으로는 면역조절과 항염증작용을 하는 것이 알려져 있다. 최근의 연구에서 비소세포폐암 조직이나 세포주에서 UG 의 발현이 현저하게 감소해 있음이 보고되었고2, 반대로 암세포에서 UG를 과발현 시키면 암의 형질이 소실되고, 암세포 성장이 억제됨이 보고되었다3-5.
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