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문제 정의
- 지금까지 PM10이 폐의 상피세포에 작용하면 여러 가지 염증성 사이토카인의 생성을 증가시킨다는 것이 여러 연구에서 증명되었지만 폐섬유모세포에는 어떤 작용을 하는지에 대한 연구는 미미하여, 본 연구에서는 황사에 포함된 PM10이 폐섬유모세포에 작용하여 ROS의 생성에 어떤 영향을 미치는지 알아보고 TGF-ß, NF-κB, PDGF-α, fibronectin의 생성을 변화시키는지 관찰하였다.
제안 방법
- NF-κB에 대한 실험은 MRC-5 세포를 분쇄한 후 ultracentrifuge를 시행하여 nuclear protein과 cytosol로 나눈 후 nuclear protein에서 측정하였으며, 항체로는 p65 antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)를 사용하였다.
- 1%)에 1：10,000∼1：20,000으로 희석하여 membrane을 담가 1시간 동안 shaking하였다. PBST (Tween20 0.1%)로 세척한 후 WEST-SOL (Intron Inc., Seoul, Korea)을 사용하여 X-ray film에 감광시켰다. 감광된 film을 scan하여 density를 구하여 대조군과 비교하였다.
- PBST (Tween20 0.1%)를 이용하여 NF-κB, TGF-ß, PDGF-α, fibronectin 각각에 대한 일차 항체(Santa Cruz Biotechnology)을 1：700∼1：1,000으로 희석하였다.
- PM10을 가해주고 24시간 배양한 후 세포에 침투가 가능한 형광 탐촉자인 2’,7’-dichlordihydrofluorescin diacetate(DCF-DA) (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA)를 5 mM씩 가해준 후 20분간 배양하였다.
- TGF-ß, PDGF-α, fibronectin을 측정할 lysate는 Bradford assay를 통해 단백질이 30 μg이 되도록 계산하여 준비하였다.
- , Seoul, Korea)을 사용하여 X-ray film에 감광시켰다. 감광된 film을 scan하여 density를 구하여 대조군과 비교하였다.
- 공기 포집기(HV500F; Sibata, Tokyo, Japan)를 이용하여 분당 500 L로 하루 6시간씩 대기 분진을 필터(Pore size 0.25 μm; Millipore, Bedford, MA, USA)를 통해 포집하였다.
- 그 후 PBST (Tween20 0.1%)로 세척하고 각각에 대한 이차 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 PBST (Tween20 0.1%)에 1：10,000∼1：20,000으로 희석하여 membrane을 담가 1시간 동안 shaking하였다.
- 그 후 PBS로 배지에 남아 있는 CM-H2DCF-DA를 제거한 후 세포 내의 산화를 통해 생성된 2’,7’-dichlordihydrofluorescin (DCFH)의 형광을 fluorescence-activated cell sorting (FACS) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 그 후 PM10을 가해주지 않은 세포를 대조군으로 하고, 대조군을 제외한 각 well에 50, 100 μg/mL의 농도로 PM10을 가해준 후 24시간 동안 배양하였다.
- 그리고 각 표본의 형광 생성 정도를 confocal microscope (IX81; Olympus, Tokyo, Japan)를 이용하여 사진으로 찍었다.
- 세포가 90∼100% 배양되면 0.5% 우태아 혈청을 포함한 DMEM 배지로 교체하여 24시간 배양함으로써 세포 성장을 정지시키고(starvation) 성장주기를 동일화하였다.
- 실험동안 세포에 가해 줄 PM10의 농도는 각각 0, 50, 100 μg/mL로 정하였다.
대상 데이터
- . 그 중 가장 많은 성분은 SiO2로서 전체 중 48%를 차지하였고, 이 밖에 여러 가지 중금속 물질들이 포함되어 있었으며, 분석은 한국 요업 기술원(KICET)에 의뢰하였다(Table 1).
- 대기 시료의 포집은 2006년 봄철 황사 기간에 인천지역(인천시 남동구 구월동 가천의대 길병원 응급센터 옥상)에서 실시하였다. 공기 포집기(HV500F; Sibata, Tokyo, Japan)를 이용하여 분당 500 L로 하루 6시간씩 대기 분진을 필터(Pore size 0.
- 사람 태아 폐 섬유모세포인 MRC-5 cell (KCLB, Seoul, Korea)을 10% 우태아 혈청이 포함된 5.6 mM 포도당 함유 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (GiBCO BRL, Goithersburg, MD, USA) 배지에서 계대 배양하였다.
- 그 후 PBS로 배지에 남아 있는 CM-H2DCF-DA를 제거한 후 세포 내의 산화를 통해 생성된 2’,7’-dichlordihydrofluorescin (DCFH)의 형광을 fluorescence-activated cell sorting (FACS) (BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 측정한 세포 수는 각 표본당 20,000개로 하였다.
데이터처리
- 결과는 평균±표준편차로 표시하였다.
- 05인 경우에 통계학적으로 유의하다고 판단하였다. 대조군과 PM10 처리군과의 차이는 비모수적 방법인 Kruskall-Wallis test를 통해 검정한 후 Mann-Whitney test로 사후 검정하여 p값을 표시하였다.
- 결과는 평균±표준편차로 표시하였다. 분석은 SPSS version 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 프로그램을 이용하였고 p＜0.05인 경우에 통계학적으로 유의하다고 판단하였다. 대조군과 PM10 처리군과의 차이는 비모수적 방법인 Kruskall-Wallis test를 통해 검정한 후 Mann-Whitney test로 사후 검정하여 p값을 표시하였다.
성능/효과
- MRC-5 cells에 황사기간에 채집한 PM10을 0, 50, 100 μg/mL의 농도로 처리하고 24시간 후의 NF-κB의 생성 결과를 보면 PM10을 처리했을 때가 처리하지 않은 대조군에 비해 NF-κB 발현이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(Figure 4).
- MRC-5 cells에 황사기간에 채집한 PM10을 처리하고 24시간 후에 세포 내 ROS를 FACS로 측정한 결과를 보면 각 농도에서 대조군보다 의미 있게 증가하지 않았다(PM10 0 μg/mL 113.01±83.4, PM10 50 μg/mL 92.48±70.46, p=0.674, PM10 100 μg/mL 106.80±88.73, p=0.916)(Figure 1).
- MRC-5 cells에 황사기간에 채집한 PM10을 처리하고 24시간 후의 PDGF-α 생성 결과를 보면 PM10의 농도가 50 μg/mL일 때 대조군에 비해 의미 있는 차이를 보여주지 않았으며, PM10의 농도가 100 μg/mL일 때는 오히려 유의하게 감소하였다(PM10 50 μg/mL 101.94±8.13 of control, p=0.487, PM10 100 μg/mL 97.50±1.81 of control, p=0.037) (Figure 5).
- MRC-5 cells에 황사기간에 채집한 PM10을 처리하고 24시간 후의 TGF-ß 생성 결과를 보면 각 농도에서 대조군보다 의미 있게 증가하지 않았다 (PM10 50 μg/mL 101.43±6.99 of control, p=1.000, PM10 100 μg/mL 97.91±26.40 of control, p=1.000) (Figure 3).
- MRC-5 cells에 황사기간에 채집한 PM10을 처리하고 24시간 후의 fibronectin 발현 결과를 보면 PM10의 농도가 50 μg/mL일 때 대조군에 비해 유의하게 증가하였다 (PM10 50 μg/mL 113.27±8.65 of control, p=0.005).
- The measured ROS in MRC-5 cells after 24 hours incubation with PM10 were not increased (PM10 0 μg/mL 113.01±83.4, PM10 50 μg/mL 92.48±70.46, p=0.674, PM10 100 μg/mL 106.80± 88.73, p=0.916).
- 그 증가 기전은 아직 밝혀지지 않았지만 미세먼지의 내독소, 또는 미세먼지에 포함된 철과 같은 중금속 성분이 관여된다고 주장하는 연구들도 있다18,19. 결론적으로 황사의 미세먼지는 폐 섬유모세포에서 NF-κB의 발현을 통해 fibronectin의 증가를 유발할 것이라고 예측된다. 다만 폐 섬유모세포가 황사의 미세먼지(PM10)에 의하여 자극을 받았을 시에 NF-κB가 활성화되면서 어떤 신호전달과정에 의하여 cytokine이나 growth factor의 발현이 증가되어 fibronectin의 발현이 증가하는지는 향후 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 세포외기질의 구성성분인 fibronectin은 collagen과 같은 물질에 대한 접착력이 강하여 증가 시 세포외기질이 축적되어 기도의 재형성(remodeling)을 유발한다. 그러므로 이 결과는 황사의 미세먼지가 폐로 흡인되었을 때 폐에 세포외기질을 축적할 수 있고 나아가 섬유화를 유발할 가능성이 있음을 시사한다. 미세먼지가 폐에 손상을 일으켜 소기도의 섬유화와 재형성을 유발하는 데는 NF-κB의 활성화가 중요하다는 것이 여러 연구에서 밝혀졌는데15, 본 연구에서도 황사의 미세먼지를 MRC-5에 가하면 NF-κB의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- 본 연구의 주요한 결과는 황사 기간에 포집한 미세먼지(PM10)는 50 μg/mL의 농도에서 폐섬유모세포인 MRC-5세포에 가해주면 24시간 incubation 후에 fibronectin의 양이 유의하게 증가했다는 것이다.
후속연구
- 결론적으로 황사의 미세먼지는 폐 섬유모세포에서 NF-κB의 발현을 통해 fibronectin의 증가를 유발할 것이라고 예측된다. 다만 폐 섬유모세포가 황사의 미세먼지(PM10)에 의하여 자극을 받았을 시에 NF-κB가 활성화되면서 어떤 신호전달과정에 의하여 cytokine이나 growth factor의 발현이 증가되어 fibronectin의 발현이 증가하는지는 향후 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
- 또한 이전의 연구에서 폐섬유모세포에 과산화수소(hydrogen peroxide)를 직접 가해서 활성산소를 발생시키면 TGF-ß1이 증가한다는 연구결과가 있었으나14, 본 연구에서는 황사의 미세먼지(PM10)를 MRC-5 세포에 가했을 때 ROS와 함께 TGF-ß도 증가시키지 않는 것으로 나타났는데, 본 연구에서 이들이 증가하지 않은 것은, 폐 섬유모세포는 PM10에 대하여 직접 노출 시에도 저항성이 크기 때문으로 사료되고, 이로 인해 ROS의 형성에 크게 변화가 없으면서 TGF-ß나 PDGF-α의 발현도 증가시키지 않은 것으로 추측되나, 이 과정에서 CTGF같은 다른 사이토카인이나 성장인자(growth factor) 등의 경로가 존재할 수 있을 가능성이 있기 때문에, 이의 증명을 위해서는 TGFß이외의 다른 성장인자들에 대한 추가적인 연구가 필요할 것이다.
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