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문제 정의
- 오령지가 RAW 264.7 cell에서 염증성 매개물질에 대한 영향을 조사하기 위하여 염증성 세포활성물질의 생성을 조사하였다. 오령지를 전처리한 후 LPS로 자극하여 ELISA 방법으로 IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α를 측정한 결과 오령지 추출물이 염증성 세포활성물질들을 농도 의존적으로 억제함을 알 수 있었다(Fig.
- 오령지가 in vivo상에서도 사이토카인의 억제 효과가 있음에 착안하여, 실제로 이런한 사이토카인 억제가 shock를 억제할 수 있는지 실험하였다. 오령지를 경구 투여한 마우스를 보면 완벽히 차단하지 못했지만 endotoxin shock를 억제하고 있음을 보여준다(Fig.
- 이때 사용되는 LPS에 의해 몸 내부에서는 IL-6, TNF-a, interferone 등이 생산되는데, 이러한 사이토카인에 의해 우리의 장기나 조직이 손상을 입어 shock를 유발하게 한다. 우리는 오령지가 사이토카인 억제 효과가 큰 것에 착안하여 in vivo상에서도 억제하는 지 알아보았다. Fig.
- 그러나 아직 오령지에 대한 연구는 많이 이루어지지 않았으며, 오령지의 항염증성 작용에 대한 명확한 관찰과 그 기전에 대한 규명이 이루어지지 않고 있다. 이에 우리는 염증 반응에 대한 기초적 접근을 하였다.
제안 방법
- 6주된 C57BL/6 마우스 암컷 10마리에 오령지를 500 mg/kg의 농도로 5일(1회/1일)간 경구투여 하였다. 오령지는 동결건조하여 DW로 녹인 후 필터 하였다.
- 동일한 양의 단백질을 샘플링 버퍼(4X)를 같이 넣어 섞은 다음 그 샘플을 10% SDS-PAGE에 전기영동한 후 맴브레인에 옮기고 나서 5% skim milk로 2 hrs blocking 하였다. ERK, p38, JNK의 phosphorylation과 Ik-Ba을 ECL detection 용액 (Amersham)으로 확인하였다.
- LPS (500 ng/ml)로 RAW 264.7 cell를 자극하기 전 오령지 추출물을 1시간 동안 전 처리한 후 그리스 시약을 이용하여 측정하였다. NO의 기질인 L-알기닌은 L-시트룰린과 일산화질소로 변하는데, 이는 빠르게 안정된 이산화질소, 아질산염, 질산염으로 변한다.
- PCR반응이 끝난 후 1 X 샘플링 buffer를 섞은 뒤 1.5% agarose gel에 10 ㎕씩을 넣고 전기영동한 후 자외선을 이용하여 반응을 확인하였다.
- 7 cell를 자극하기 전 오령지 추출물을 1시간 동안 전 처리 하였다. Pro-inflammatory cytokine의 염증매개물질의 생성에 미치는 약물의 효과를 검증하기 위해서 LPS로 자극한 후 24시간 뒤 이들 염증 매개물을 세포 상층액에서 ELISA법으로 정량하였다.
- RAW 264.7 cell을 60 mm culture dish에 5×106 cells/ml로 세포를 배양하고 serum free media(RPMI 1640)으로 12시간 starvation 시킨 후 오령지(500 mg/ml)으로 전처리 하고 1시간 뒤에 LPS (500 ng/ml)로 자극하여 cold PBS로 3회 세척한 후 시간별로(0, 15, 30, 60 min) cell을 harvest하여 cell을 얻은 뒤 원심분리(5,000 rpm, 5 min)하여 그 상층액을 버리고 cell pellet을 수거하였다.
- 간단히 설명하면 지수성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 2×105로 개대하였고, 여러 가지 농도로 AETD로 처리하였다.
- 이에 오령지가 LPS로 유도한 대식세포의 활성화를 억제하는 효과를 검증하고자 NO, 전염증성 사이토카인(IL-1b, IL-6, IL-10, TNF-a)의 발현을 실험하였고, mitogenactivated protein kinases (MAPKs) family인 extracelluar signal-regulated kinase (ERK 1/2), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) 및 p38에 미치는 영향을 조사하였으며, inhibitory kappa B a (Ik-Ba)를 조사하였다. 또한 in vivo에서 LPS로 유도한 endotoxin shock 실험도 병행하였다.
- 오령지는 동결건조하여 DW로 녹인 후 필터 하였다. 마지막 경구투여가 끝난 1시간 뒤 endotoxin shock를 유발한 LPS (serotype;055.B5)를 Lethal dose (37.5 mg/kg)로 마우스에게 주사하였다. 주사 후 24시간마다 마우스의 생존율을 체크하였다.
- 오령지는 동결건조하여 DW로 녹인 후 필터 하였다. 마지막 경구투여가 끝난 후 1시간 뒤 endotoxin shock를 유발한 LPS (setoyype;055.B5)를 Lethal dose (37.5 mg/kg)로 마우스에게 주사하였다. 주사 3시간 후에 마우스의 혈청을 얻어, ELISA 방법으로 측정하였다.
- 오령지가 항염증 효과에 미치는 영향을 조사하기 위하여 먼저 오령지가 RAW 264.7 cell에서 LPS에 의한 NO 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 오령지를 다양한 농도로 전 처리하고 LPS로 자극하였다.
- 7 cell에서 LPS에 의한 NO 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 오령지를 다양한 농도로 전 처리하고 LPS로 자극하였다. 24시간 후에 세포 상층액에서 NO의 생성을 측정한 결과 LPS로 자극한 대조군에 비해 오령지 추출물을 전 처리한 군에서 농도 의존적으로 NO 생성이 감소하고 있음을 알 수 있다(Fig.
- 오령지의 세포독성에 관해 알아보기 위하여 RAW 264.7 cell에 오령지를 농도 의존적으로 처리하여 24시간 후에 세포의 생존률을 측정하였다. Fig.
- 장기나 조직으로 부터의 과도한 cytokine의 분비는 endotoxin shock를 유발하여 사망을 초래한다. 오령지의 싸이토카인 분비 억제는 shock 억제에 응용이 가능할 것을 추측하여 survival rate를 측정하였다. 실제로 IL-6, TNF, interferone Knock out 마우스에서 endotoxin shock를 억제한다고 보고되어 있다26).
- 이에 오령지가 LPS로 유도한 대식세포의 활성화를 억제하는 효과를 검증하고자 NO, 전염증성 사이토카인(IL-1b, IL-6, IL-10, TNF-a)의 발현을 실험하였고, mitogenactivated protein kinases (MAPKs) family인 extracelluar signal-regulated kinase (ERK 1/2), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK) 및 p38에 미치는 영향을 조사하였으며, inhibitory kappa B a (Ik-Ba)를 조사하였다. 또한 in vivo에서 LPS로 유도한 endotoxin shock 실험도 병행하였다.
- 그 샘플의 빛의 흡수는 스펙트로 포토메터(MD, USA)로 540 nm에서 측정하였다. 일산화질소의 농도는 아질산염의 표준커브로부터 계산하였다.
- 5 mg/kg)로 마우스에게 주사하였다. 주사 후 24시간마다 마우스의 생존율을 체크하였다.
- 2 %의 naphthyl ethylenediamine dihydrochloride + 60 % acetic acid) 아질산염과 화학 반응하여 보라색의 아조염을 형성하고 이것은 일산화질소의 농도와 일치하기 때문에, 아조염의 농도로부터 아질산염의 농도를 측정하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 즉 그리스 시약을 상기 대조군과 실험군의 샘플 각각에 100 ㎕씩을 첨가하였다. 그 샘플의 빛의 흡수는 스펙트로 포토메터(MD, USA)로 540 nm에서 측정하였다.
대상 데이터
- Anti-mouse IL-6, TNF-α, IL-10, IL-1b antibodies, 재조합 IL-6, TNF-α,IL-10, IL-1b는 R & D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입했다.
- 모든 동물은 원광대학교 동물관리규칙에 의해 관리되어졌다. C57BL/6 6주령 암컷을 오리엔트(성남, 한국)에서 구입하여 사용하였다. 모든 마우스는 규격화된 마우스장에서 23±2℃에서 유지되었다.
- Anti-mouse IL-6, TNF-α, IL-10, IL-1b antibodies, 재조합 IL-6, TNF-α,IL-10, IL-1b는 R & D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입했다. Endotoxin shock실험에 사용된 LPS (Sero type ; 055, B5)는 SIGMA (St. Louis, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급 이상으로 사용하였다.
- Fetal bovine serum (FBS), RPMI-1640, penicillin-streptomycin 등의 세포 배양용 시약들은 Gibco BRL (Grand Island, USA)사에서 배양조는 Corning (Rochester, USA)사에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 sodium dodesyl sulfate (SDS), acrylamide, bisacrylamide, LPS, Tris-HCl 등은 SIGMA (St.
- Fetal bovine serum (FBS), RPMI-1640, penicillin-streptomycin 등의 세포 배양용 시약들은 Gibco BRL (Grand Island, USA)사에서 배양조는 Corning (Rochester, USA)사에서 구입하였다. 실험에 사용된 시약 중 sodium dodesyl sulfate (SDS), acrylamide, bisacrylamide, LPS, Tris-HCl 등은 SIGMA (St. Louis, USA)에서 구입하였으며, 실험에 사용된 항체인 anti-phospo-ERK1/2, antiphospo-p38, anti-Ik-Ba, anti-phospo-JNK는 Cell signaling사에서 구입하였다. Anti-mouse IL-6, TNF-α, IL-10, IL-1b antibodies, 재조합 IL-6, TNF-α,IL-10, IL-1b는 R & D Systems (Minneapolis, MN, USA)에서 구입했다.
- 실험에 사용한 오령지는 옴니허브(서울, 한국)에서 구입하였다.
데이터처리
- 실험결과에 대한 통계처리는 Students’ t-test에 준하였고 p-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- RAW 264.7 cell의 생존율은 밀집세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자주빛 formazan 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 MTT분석법으로 측정했다. 간단히 설명하면 지수성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 2×105로 개대하였고, 여러 가지 농도로 AETD로 처리하였다.
- Tri-zol로 추출한 RNA는 MML-V reverse transcriptase의 protocol을 사용하여 cDNA로 합성하였다. 역전사 반응을 위하여 total RNA (1mg)에 0.
- 5 mg/kg)로 마우스에게 주사하였다. 주사 3시간 후에 마우스의 혈청을 얻어, ELISA 방법으로 측정하였다.
성능/효과
- 오령지를 다양한 농도로 전 처리하고 LPS로 자극하였다. 24시간 후에 세포 상층액에서 NO의 생성을 측정한 결과 LPS로 자극한 대조군에 비해 오령지 추출물을 전 처리한 군에서 농도 의존적으로 NO 생성이 감소하고 있음을 알 수 있다(Fig. 2).
- MAPKs는 세포활성물질의 생성 조절 및 다양한 생물학적 기능을 조절한다고 알려져 있다. LPS로 자극된 RAW 264.7 cell에서는 p38, ERK, JNK의 활성이 증가하지만, 오령지를 전처리 했을 경우에 ERK는 억제하지 못했지만, p38, JNK의 활성이 억제되었다(Fig. 5). LPS는 NF-kB를 활성화 시켜서 각종 염증성 cytokine을 분비한다.
- 본 연구에서 오령지의 물 추출물이 in vivo 및 in vitro상에서 IL-1b, IL-6, TNF-a 등을 억제하여 염증 작용을 억제함을 보여주었다.
- 오령지가 Ik-Bα의 분해를 억제했고, MAPK 구성요소 중에서 JNK와 p38의 인산화를 억제하였다.
- 오령지가 RAW 264.7 cell에서 전염증성 세포활성물질을 단백질 수준에서 억제하였에 착안하여(Fig. 3), mRNA수준에서도 전염증성 인자들을 억제함을 알아보기 위해 오령지를 전처리한 후 LPS로 자극하여 IL-1b, IL-6, IL-10, TNF-α의 mRNA를 측정한 결과 IL-1b, IL-6, IL-10, TNF-α를 대조군에 비해 실험군이 억제됨을 알 수 있었다(Fig. 4).
- 오령지가 in vivo상에서도 사이토카인의 억제 효과가 있음에 착안하여, 실제로 이런한 사이토카인 억제가 shock를 억제할 수 있는지 실험하였다. 오령지를 경구 투여한 마우스를 보면 완벽히 차단하지 못했지만 endotoxin shock를 억제하고 있음을 보여준다(Fig. 7).
- 오령지를 전처리한 후 LPS로 자극하여 ELISA 방법으로 IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α를 측정한 결과 오령지 추출물이 염증성 세포활성물질들을 농도 의존적으로 억제함을 알 수 있었다(Fig. 3).
- 이러한 실험 결과들로 보아 오령지가 대식세포에서 JNK와 p38의 인산화를 저해하고 Ik-Bα의 분해를 억제하여 전염증성 cytokine들의 발현을 억제하여 NO의 생산을 억제하였다고 생각된다. 오령지의 이와 같은 작용은 신체 내 모든 면역질환과 생식기ㆍ호흡기ㆍ소화기 등의 염증에 효과적일 것이라고 생각된다.
후속연구
- 따라서 NO, PGE2, TNF-a, IL-1β 및 IL-6, IL-10과 같은 염증 매개물질을 억제하는 물질을 발견한다면, 각종 면역질환 및 인체질환의 치료에 도움이 될 것이다16,17).
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