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문제 정의
- 오령지 물 추출물 (EFT)이 혈관 내피세포의 chemokine 생성에 미치는 효과를 조사하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
- 이에 저자는 오령지의 혈관내의 항염증효과를 chemokine level에서 실험적으로 구명하기 위해서 오령지 물 추출물(EFT)이 혈관 내피세포의 IL-8와 MCP-1 생성 및 단핵구 유입에 미치는 효과를 관찰하여 유의성 있는 결과를 얻은 바 이를 보고하는 바이다.
- 는 보고가 있었다. 한의학에서 오령지가 血脈을 通利하여 瘀血로 인한 血滯를 다스린다는데 착안하여 혈관염증에 미치는 기전을 조사하기 위하여 본 실험에 착수하였다.
제안 방법
- 200 μg/mL 농도의 EFT를 HUVEC 세포에 24 시간 전처리 한 다음 6 시간 TNF-α로 자극하고, 이들 세포로부터 mRNA를 분리하여 EFT가 IL-8 및 MCP-1 mRNA 발현에 미치는 효과를 RT-PCR 방법으로 조사하였다.
- 48-well chemotaxis chamber (Neuroprobe, MD, USA), 6.5 μg/mL fibronectin (Sigma, UK)이 양쪽 면에 코팅된 8-μm pore의 polyvinylpyrrolidone-free polycarbonate membrane을 이용한 Boyden chamber technique으로 단핵세포의 chemotactic response를 조사하였다.
- 5 μg RNA를 취하여 70℃에서 불활성화 시킨 다음 1X 1st strand buffer, 0.5 mM dNTP, 15 μg/μL Oligo(dT), 10 U/μL reverse transcriptase 및 2 U/μL RNase inhibitor와 혼합하여 42℃에서 40분 동안 reverse transcription(RT)을 수행하여 cDNA를 합성하고 다시 70℃에서 10분 동안 불활성화 시켰다.
- EFT를 농도별로 HUVEC 세포에 24 시간 전처리한 다음 12시간 TNF-α로 자극하고, 이들 세포를 단핵구 U937 세포와 함께 12 시간 배양하여 U937 세포가 HUVEC 세포로 유입되는 세포수를 조사하였다.
- EFT를 농도별로 HUVEC 세포에 24 시간 전처리한 다음 TNF-α로 자극하고 24 시간 후에 배양배지를 회수하여 IL-8 및 MCP-1 생성량을 ELISA 방법으로 조사하였다.
- EFT을 최소 50 μg/mL에서 최대 200 μg/mL까지 처리한 다음 24 시간 후에 이들 세포를 DAPI/rhodamine 염색하여 세포 독성 및 세포 수를 확인하였다.
- HUVEC 세포를 웰 당 1 × 105 개가 되도록 계측하여 4-웰에 seeding한 다음 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지를 이용하여 배양하였다.
- HUVEC 세포에서 오령지 추출물(EFT)의 세포독성을 고찰하였다. EFT을 최소 50 μg/mL에서 최대 200 μg/mL까지 처리한 다음 24 시간 후에 이들 세포를 DAPI/rhodamine 염색하여 세포 독성 및 세포 수를 확인하였다.
- HUVEC 세포의 자극에 의해 분비되는 chemokine (IL-8, MCP-1)의 양을 측정하기 위하여 ELISA (enzyme linked immunosorbant assay) kit를 이용하여 분석하였다. 모든 분석과정은 지침서의 순서에 따라 수행하였다.
- IL-8 및 MCP-1 유전자 발현을 확인하기 위하여 RT로부터 만든 cDNA를 1X PCR buffer, 0.2 mM dNTP, PCR primer 및 0.03 U/μL Taq Polymerase를 혼합하여 polymerase chain reaction (PCR, GeneAmp RNA PCR kit, Perkin-Elmer Corp., Weiterstadt, Germany)을 시켜 분석하였다.
- PCR 후 얻어진 생성물을 0.5 μg/mL EtBr (ethidium bromide)가 포함된 1.5% agarose gel 상에서 전기영동하여 각각 발현된 유전자의 band를 확인하였다.
- 자극 처리 후 70% Ethanol로 세포를 고정한 다음 PBS로 세척하고 DAPI를 처리하여 상온에서 10분 동안 염색하였다. 염색된 세포를 다시 PBS로 세척한 다음 형광현미경을 이용하여 조사하였다(PALM, Microlaser Technologies, Bernried, Germany).
- 단핵세포 (1 × 106 cells/mL)를 상층에 첨가하고 1시간 동안 37℃에서 배양한 후 membrane을 제거하여 methanol에 5분 동안 담가 세포를 고정하였다. 이들 세포를 haematoxylin으로 5분 동안 염색하고 Scots Tap water (magnesium sulfate, sodium bicarbonate를 함유하는 증류수)에 2시간 동안 담가 둔 후 세포의 수를 계측하여 비교하였다.
대상 데이터
- DAPI (4',6-diamidino-2-phenyl- indole)는 Molecular Probe 사 (Willow Creek Re., OR, USA)로부터 구입하고 FBS (fetal bovine serum)는 U.S. Bio-Technologies 사로부터 구입하여 사용하였다.
- IL-8 및 MCP-1 ELISA Kit는 R&D 사로부터 구입하여 사용하였다.
- TNF-α (tumor necrosis factor-alpha) cytokine은 R&D (Minneapolis, MN, USA) 사로부터 구입하였고 IL-8 (interleukin-8) 및 MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) 항체는 Santa Cruz 사 (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. Sodium bicarbonate 및 기본 시약들은 Sigma 사 (St. Louis, Missouri, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 모든 세포배양 용기 및 튜브는 Falcon 사 (Becton Dikinson, San Jose, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- TNF-α (tumor necrosis factor-alpha) cytokine은 R&D (Minneapolis, MN, USA) 사로부터 구입하였고 IL-8 (interleukin-8) 및 MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) 항체는 Santa Cruz 사 (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- Louis, Missouri, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 모든 세포배양 용기 및 튜브는 Falcon 사 (Becton Dikinson, San Jose, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. IL-8 및 MCP-1 ELISA Kit는 R&D 사로부터 구입하여 사용하였다.
- 배양배지 (RPMI 1640), antibiotic/antimycotic 및 Trypsin-EDTA 는 Gibco/BRL (Grand Island, NY, USA)로부터 구입하였다. DAPI (4',6-diamidino-2-phenyl- indole)는 Molecular Probe 사 (Willow Creek Re.
- 본 연구에 사용된 약제 五靈脂(Extract of Faeces Trogopterori (EFT))는 원광대학교 익산 한방병원에서 구입하여 사용하였다. 약제 100 g과 3차 증류수 0.
- 인체 배꼽정맥 내피세포 (human umbilical vein endothelial cells ; HUVEC)를 Clonetics 사 (Cambrex Bio Science Rockland, USA)로부터 구입하여 10% FBS, antibiotic/antimycotic (100 U/mL penicillin, 25 μg/mL amphotericin D, 100 μg/mL streptomycin) 및 1.5% sodium bicarbonate가 첨가된 RPMI 1640 배지에서 95% 공기, 5% CO2, 습기가 충분한 37℃의 대기로 배양하였다.
- 전체 RNA를 Trizol reagent (Gibco/BRL)를 이용하여 분리하고 Gene Quant (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)로 정량하였다. 5 μg RNA를 취하여 70℃에서 불활성화 시킨 다음 1X 1st strand buffer, 0.
데이터처리
- 실험 결과는 mean ± S.D.로 표시하였으며 유의성 검정은 student's t-test에 의하였으며 p 값이 0.01 이하인 것만 유의성이 있는 것으로 하였다.
성능/효과
- EFT의 MCP-1 최대 억제효과는 농도 200 μg/mL과 24 시간 전처리 실험에서 관찰되었다.
- 2에 보인 결과와 같이 EFT는 IL-8 생성에 큰 변화를 주지 못했지만 MCP-1 생성을 유의하게 감소시켰다. MCP-1 생성 억제효과는 EFT의 농도에 의존하고(Fig. 2B), EFT의 전처리 시간에 의존함을 알 수 있었다(Fig. 3). EFT의 MCP-1 최대 억제효과는 농도 200 μg/mL과 24 시간 전처리 실험에서 관찰되었다.
- 또한 오령지 물 추출물을 농도별로 HUVEC세포에 전처리하고 12시간 TNF-α로 자극하여 단핵구 U 937 세포와 배양하여 실험한 결과 오령지 물추출물은 TNF-α 자극에 의한 U 937 세포의 유입을 농도의존적으로 유의하게 차단함을 나타내었다.
- 오령지 물 추출물은 농도별로 HUVEC 세포에 전처리한다음 TNF-α로 자극하고 24시간 후에 IL-8과 MCP-1 생성량을 관찰한 결과 IL-8생성에는 뚜렷한 변화를 관찰할 수 없었지만 MCP-1 생성은 유의하게 감소시켰다(Fig. 2).
- 이상의 실험결과로부터 오령지는 혈관 내피세포의 염증성 MCP-1 유전자 발현을 저해시켜 항염증 효과를 나타내는 것으로 판단된다. 오령지는 MCP-1 유전자 발현 저해효과 외에도 여러가지 다른 효과가 있을 것으로 추정되며 이들 효과에 대한 더 많은 연구가 요청된다.
- 1에 보인 바와 같이 HUVEC 세포는 EFT의 처리농도 및 처리시간에 의해 어떠한 영향도 받지 못했다. 즉, 세포독성으로 보이는 세포핵의 응집과 rhodamine 흡착 및 세포 수의 변화를 예측할 수 있는 세포핵 수에 있어서 유의한 변화를 관찰할 수 없었다.
- 4에 보인 결과와 같이 EFT는 TNF-α 자극에 의한 U937 세포의 유입을 유의하게 억제시켰다. 혈관내피 세포에서 단핵구 유입 억제 효과는 EFT의 농도에 의존적임을 알 수 있었다.
후속연구
- 이상의 실험결과로부터 오령지는 혈관 내피세포의 염증성 MCP-1 유전자 발현을 저해시켜 항염증 효과를 나타내는 것으로 판단된다. 오령지는 MCP-1 유전자 발현 저해효과 외에도 여러가지 다른 효과가 있을 것으로 추정되며 이들 효과에 대한 더 많은 연구가 요청된다.
- 이같은 결과는 단핵구가 혈관내피세포로 유입되는 것을 억제하는 오령지 물추출물의 효과가 IL-8 유전자발현과는 다른 기전에 의한 것임을 시사한다고 생각된다. 이상의 결과에서 오령지 물추출물은 혈관내피세포의 염증성 MCP-1유전자 발현을 저해시켜 항혈관염 효과를 나타내는 것으로 사료되며 향후 병태모델을 활용하여 in vivo 연구로 혈관염 억제효과를 구명하고 그 기전을 밝힌다면 혈관염 치료제 개발에 기여하리라 생각된다.
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