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문제 정의
- 본 연구에서는 TF의 유방암에 대한 항암효과를 알아보기 위하여 인체 유래 유방암 세포인 MCF-7 세포에 TF를 처리하고, 세포증식율과 증식 형태에 미치는 영향을 살펴보았다. 또한 Annexin V/PI double stain 방법을 통하여 어떤 type의 세포 사멸이 일어나는지 살펴보았으며, Caspase 3 와 Caspase 9의 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과, 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 TF의 유방암에 대한 항암효과를 알아보기 위하여 인체 유래 유방암 세포인 MCF-7 세포에 TF를 처리하고, 세포증식율과 증식 형태에 미치는 영향을 살펴보았다. 또한 Annexin V/PI double stain 방법을 통하여 어떤 type의 세포 사멸이 일어나는지 살펴보았으며, Caspase 3 와 Caspase 9의 발현에 미치는 영향을 관찰한 결과, 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
가설 설정
- 이상과 같이 임상에서 부인과 질환에 다용되고 있고, 위의 연구사례들을 볼 때 五靈脂(Trogopterorum Faeces, TF)가 인간 유래 유방암 세포의 사멸에 관여할 수 있을 것이라는 가설을 세우고 본 연구를 진행하였다.
제안 방법
- Highly water-soluble tetrazolium salt. WST -8 2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt(CCK-8kit)를 사용하여 살아있는 세포를 정량하는 방법을 사용하였다. 먼저 96-well plate에 측정하고자 하는 대상 세포주를 well당 5×103개의 분량으로 분주하고, 37℃, 5% CO2가 공여되는 환경에서 24시간을 배양하여 부착 및 안정화를 시행하였다.
- 먼저 96-well plate에 측정하고자 하는 대상 세포주를 well당 5×103개의 분량으로 분주하고, 37℃, 5% CO2가 공여되는 환경에서 24시간을 배양하여 부착 및 안정화를 시행하였다.
- 세척되고 세절된 상태로 구입된 五靈脂 50 g을 에탄올 500 ml를 이용하여 상온에서 24시간 추출한 다음, 다시 500 ml의 에탄올을 부어 재차 추출하였다. 모아진 추출액을 원심분리하여 찌꺼기는 버리고 상층액을 모은 다음, 와트만지(Watman paper)를 이용하여 2회 반복 여과 하였다. 여과가 끝난 추출액은 감압농축기(EYELA, Japan)를 이용하여 감압 농축된 다음 동결건조시켰다.
- 인간 유래 유방암 세포주인 MCF-7 cell은 한국세포주은행(서울, 한국)으로부터 냉동상태로 구입하여 사용하였다. 분주 받은 세포주는 해동시켜 배양액 속에 분주시킨 후, 3회 이상 계대 배양하여 실험실 환경 및 기타 배양 환경에 충분히 적응시킨 후 증식률(Doubling Time)이 구입처에서 제공한 자료와 거의 일치하게 되었을 때, 충분히 적응하였다고 생각하고 실험에 사용하였다.
- 상기한 이유로 TF가 일으키는 세포사멸의 형태가 어떤 것인지 살펴보기 위하여 Annexin V/PI double stain을 시행하였다. Annexin V는 실험실에서 다용되는 일종의 형광 probe로 세포 표면에 존재하는 phosphatidylserine(PS)나 phosphatidylethanolamine(PE)에 결합하며, PS나 PE는 apoptosis를 포함한 몇 가지 세포 사멸 과정에서 발견된다31-33).
- 세포 사멸의 종류를 판별하기 위하여, 세포에 시료를 처리한 다음 Annexin V와 PI를 처리하고, flow cytometry 기법으로 결과를 분석하였다. 실험과정을 간단히 요약하면, 6-well plate에 웰당 5×104개의세포를 분주하고, 24시간 동안 부착을 시행한 다음, 0 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml 농도의 시료를 처리하였다.
- 시료가 처리된 유방암 세포주를 수거하여, 세포를 용해시킨 다음 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질은 Bicinchoninic acid assay(BCA) 법을 이용하여 정량되었으며, 50 μg의 단백질이 SDS-polyacrylamide gel에 loading 되었다.
- 실험과정을 간단히 요약하면, 6-well plate에 웰당 5×104개의세포를 분주하고, 24시간 동안 부착을 시행한 다음, 0 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml 농도의 시료를 처리하였다.
- 를 보면 活血化瘀藥이 혈액순환을 촉진개선하고 혈관을 확장시켜 결체조직의 증식을 억제하여 종양의 성장 및 전이를 억제할 수 있다는 것을 알 수 있다. 이에 저자는 본 연구에서 五靈脂의 유방암에 대한 항암효과를 알아보기 위하여 인체 유래 유방암 세포인 MCF-7 세포에 TF를 처리하고, 세포증식율과 증식 형태에 미치는 영향을 살펴본 다음, Annexin V/PI double stain 방법을 통하여 어떤 type의 세포사멸이 일어나는지 살펴보았고, Caspase 3와 Caspase 9의 발현에 미치는 영향을 관찰하였다.
- 인체 유래 거대유방암 세포주인 MCF-7세포의 생육 배지로는 RPMI 1640배지에 10% fetal bovine serum와 penicillinstreptomycin(100 units/ml, 100 μg/μl)을 첨가하여 사용하였고, 세포주의 계대 배양은 2일 간격으로 시행하였다.
- 3시간 후, Micro-plate reader(Bio-rad, CA, USA)를 이용하여 450 nm파장에서 흡광도를 측정하였다. 정상 대조군으로는 약물을 첨가하지 않은 well을 사용하였고, 결과는 정상 대조군에 대한 백분율로 환산하여 나타내었다.
대상 데이터
- 세포 증식율 측정을 위한 Cell Count Kit-8(CCK-8) kit는 Dojindo(Kumamoto,Japan)에서 구입하여 사용하였으며, Annexin V/PI double staining kit는 BD pharmingen(CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Caspase 3, caspase 9, beta-actin의 1차 항체는 Cell Signaling Technology(MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 五靈脂(Trogopterorum Faeces, TF)는 날다람쥐과에 속한 동물인 하늘다람쥐(날쥐, Trogopterus xanthopes Milne-Edwards)의 분변을 건조한 것으로 동신대학교 부속 광주한방병원을 통하여 구입하여 정선한 후 사용하였다.
- 세포 배양을 위한 Roswell Park Mamorial Institute(RPMI) 1640 배지와 fetal bovineserum(FBS)는 Hyclone(UT, USA)에서, penicillin/streptomycin mix는 Invitrogen(NY, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포 증식율 측정을 위한 Cell Count Kit-8(CCK-8) kit는 Dojindo(Kumamoto,Japan)에서 구입하여 사용하였으며, Annexin V/PI double staining kit는 BD pharmingen(CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 세포 배양을 위한 Roswell Park Mamorial Institute(RPMI) 1640 배지와 fetal bovineserum(FBS)는 Hyclone(UT, USA)에서, penicillin/streptomycin mix는 Invitrogen(NY, USA)에서 구입하여 사용하였다. 세포 증식율 측정을 위한 Cell Count Kit-8(CCK-8) kit는 Dojindo(Kumamoto,Japan)에서 구입하여 사용하였으며, Annexin V/PI double staining kit는 BD pharmingen(CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. Caspase 3, caspase 9, beta-actin의 1차 항체는 Cell Signaling Technology(MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 시료가 투여된 군의 세포 증식 형태를 아무것도 처리되지 않은 정상군과 비교하기 위하여, 광학 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)이 이용되었으며, 그 결과는 배율×200의 사진으로 제시되었다.
- 인간 유래 유방암 세포주인 MCF-7 cell은 한국세포주은행(서울, 한국)으로부터 냉동상태로 구입하여 사용하였다. 분주 받은 세포주는 해동시켜 배양액 속에 분주시킨 후, 3회 이상 계대 배양하여 실험실 환경 및 기타 배양 환경에 충분히 적응시킨 후 증식률(Doubling Time)이 구입처에서 제공한 자료와 거의 일치하게 되었을 때, 충분히 적응하였다고 생각하고 실험에 사용하였다.
- 측정을 위해 사용된 기기는 유세포 분석기(BD bioscience, Heidelberg, Germany), 광학 현미경(Olympus, Japan)등이며, 시료의 조제를 위하여 원심 분리기(Vision, 한국), 감압농축기(EYELA, Japan), 동결건조기(삼원, 한국)가 사용되었다.
데이터처리
- 실험 성적은 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 각 실험군 간 평균의 차이를 검정할 때에는 Student's t-test로 검정하여 p-값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
- 실험 자료에 대한 통계적 분석은 통계 패키지인 SAS(The SAS System for Windows, ver. 6.12, SAS Institute, U.S.A.)를 이용하였다. 실험 성적은 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 각 실험군 간 평균의 차이를 검정할 때에는 Student's t-test로 검정하여 p-값이 0.
이론/모형
- The effects of TF on type of cell death were observed using Annexin V/PI double stain method. Cells were treated with 0 μg/ml(a), 50 μg/ml (b), 100 μg/ml (c) and 200 μg/ml(d) of TF for 24 hr.
- 추출된 단백질은 Bicinchoninic acid assay(BCA) 법을 이용하여 정량되었으며, 50 μg의 단백질이 SDS-polyacrylamide gel에 loading 되었다.
- 을 첨가하였다. 형광 측정은 FACS canto II(BD bioscience)을 이용하여 유세포분석법(flow cytometry)으로 시행하였다.
성능/효과
- 1. 인간 유래 유방암 세포주인 MCF-7세포의 증식율을 농도의존적으로 감소시켰으며, ID50은 177.2 μg/ml이었다.
- 2. 유방암 세포의 증식 밀도를 감소시켰으며, 그 양상은 세포 증식률에 미치는 영향과 유사하였다.
- 3. 농도의존적으로 Annexin V 양성인 apoptotic cell의 숫자를 증가시키는 경향을 보였다.
- 4. 농도의존적으로 effector caspase에 속하는 Caspase 3의 발현을 증가시켰다.
- PI와 Annexin V double negative인 Q3 영역은 살아있는 정상세포, PI only positive인 Q1 영역에 속하는 세포는 necrosis, PI와 Annexin V double positive 영역인 Q2는 late apoptosis, Annexin V only positive 영역인 Q4는 early apoptosis라는 가정 하에 각각의 영역에 해당하는 세포의 비율을 좀 더 자세하게 살펴본 결과 정상세포는 정상군에서 96.6%였던 것이 200 μg/ml 투여군에서 76.9%로 감소하였고, Q2와 Q4를 합한 total apoptosis는 2.6%에서 22.2%로 증가하였다.
- TF가 유방암세포에 유발하는 사멸의 종류를 구분하기 위하여, Annexin V/PI double stain을 시행한 결과 아무것도 처리하지 않은 정상군에서는 대부분의 세포가 Q3에 속해 있었으며(96.6%), TF의 농도가 증가함에 따라 Q3에 속하는 세포(live cell)는 감소하고, Q2(late apoptosis)와 Q4(early apoptosis)에 속하는 세포가 증가하는 경향을 보였다(Fig. 3).
- Vehicle만을 처리한 정상군에서는 특별한 변화를 관찰할 수 없었고(Fig. 2A), 농도가 증가함에 따라 세포 밀집도가 감소함을 알 수 있었으며, 이는 세포 증식률에서 나타낸 바와 유사한 경향을 보였다(Fig. 2). 특히, 200 μg/ml의 고농도 군에서 세포가 둥그렇게 위축되는 경향이 관찰되었으나, 전형적인 apoptosis의 형태는 관찰하기 어려웠다(Fig.
- 본 연구의 결과를 살펴보면, TF의 처리는 caspase 9과 caspase 3의 발현양을 농도의존적으로 증가시켰다(Fig. 4, 5). 이러한 결과는 TF가 일으키는 apoptosis가 TFNR, Fas와 같은 death receptor를 자극함으로써 caspase 9을 활성화시키고, 그 결과 궁극적으로 caspase 3를 활성화시켜 유방암 세포를 apoptosis에 이르게 한 것으로 해석된다.
- 본 연구의 결과에서 TF는 농도 의존적으로 Annexin V positive(Q2, Q4)세포를 증가시켰으나, PI only positive(Q1) 영역에 속하는 세포의 수에 특별한 영향을 미치지 않았다(Fig. 3). 이러한 결과는 TF가 유방암세포에 일으키는 세포사멸이 apoptosis임을 시사한다.
- 본 연구의 결과에서 TF는 투여 농도 100 μg/ml 이상에서 유의한 수준의 세포증식율 억제 효과를 보였으며, 50% growth inhibition 값(ID50)은 177.2 μg/ml이었다(Fig. 1).
- 이러한 경향은 세포 증식 밀도 및 형태 관찰 결과에서도 유사하게 나타났다. 세포 증식형태에 미치는 영향을 관찰한 결과 정상군에서는 특별한 변화를 관찰할 수 없었고, 처리 농도가 증가함에 따라 세포의 밀도가 감소하는 경향을 보였고, 또한, 고농도 투여군에서는 세포가 둥그렇게 위축되는 경향을 보이기도 하였다. 그러나, 전형적인 apoptosis의 형태를 찾기는 어려웠다(Fig.
- 유방암 세포에 시료를 처리하고, 단백질을 추출하여 caspase 3의 발현에 미치는 영향을 살펴본 결과 농도 의존적으로 caspase 3의 발현이 증가함이 관찰되었다(Fig. 4).
- 유방암 세포에 시료를 처리하고, 단백질을 추출하여 caspase 9의 발현에 미치는 영향을 살펴본 결과 농도 의존적으로 caspase 9의 발현이 증가함이 관찰되었다(Fig. 5).
- 4, 5). 이러한 결과는 TF가 일으키는 apoptosis가 TFNR, Fas와 같은 death receptor를 자극함으로써 caspase 9을 활성화시키고, 그 결과 궁극적으로 caspase 3를 활성화시켜 유방암 세포를 apoptosis에 이르게 한 것으로 해석된다. 다만, Caspase 3는 intrinsic pathway에 속하는 cytochrome c에 의해서도 활성화되는 등40) extrinsic과 intrinsic 두 가지 경로를 통하여 활성화될 수 있기 때문에 후속 연구를 통하여 좀 더 정확한 기전을 확인해야 할 것으로 생각된다.
- 이를 세포 사멸의 종류별로 구분해보면, 모든 군에서 세포 괴사(necrosis)에 의한 세포 사멸(Q1)은 큰 차이를 보이지 않았고, early apoptosis, late apoptosis 모두 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였다(Table 1).
- 이상을 정리하여 보면, TF는 인간 유래 유방암 세포 내에서 세포 표면에 존재하는 death receptor인 TNF-α receptor, Fas 등과 관계가 있는 caspase 9을 활성화시키고, 이어서 caspase 3를 활성화시켰다.
- 인간유래 유방암 세포에 시료를 처리하고 세포 증식률에 미치는 영향을 살펴본 결과 100 μg/ml 이상 처리군에서 유의한 수준의 세포 증식률 저하가 관찰되었다.
- 여과가 끝난 추출액은 감압농축기(EYELA, Japan)를 이용하여 감압 농축된 다음 동결건조시켰다. 최종적으로 얻어진 동결 건조 분말은 2.7 g으로 수율은 5.4%였으며, 실험에 사용될 때까지 냉동 보관하였다.
후속연구
- 이러한 결과는 TF가 일으키는 apoptosis가 TFNR, Fas와 같은 death receptor를 자극함으로써 caspase 9을 활성화시키고, 그 결과 궁극적으로 caspase 3를 활성화시켜 유방암 세포를 apoptosis에 이르게 한 것으로 해석된다. 다만, Caspase 3는 intrinsic pathway에 속하는 cytochrome c에 의해서도 활성화되는 등40) extrinsic과 intrinsic 두 가지 경로를 통하여 활성화될 수 있기 때문에 후속 연구를 통하여 좀 더 정확한 기전을 확인해야 할 것으로 생각된다.
- 이상의 결과로부터 五靈脂가 유방암세포에서 caspase 의존적인 apoptosis를 일으킴을 알 수 있었으며, 추후 유방암 치료에 활용될 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다.
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