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문제 정의
- 9-11) 본 논문에서는 모노올레인을 유화제로 이용하여 여러 가지 처방으로 W/O형 유제를 제조하였으며, 제조된 유제의 물리적 안정성을 Turbiscan®LAB을 이용하여 평가하여 그 결과를 보고하고자 한다.
- 이 실험은 GMO를 유화제로 사용하여 W/O 유제의 제조 가능성을 알아보고자 수행하였다. 기본적으로 유상인 Marcol 52와 수상인 PBS, 그리고 입자의 안정화제로 쓰인 poloxamer 407의 중량을 일정하게 한 후 GMO의 양을 변화시켜가며 제조한 유제의 안정성을 평가해 보았다.
제안 방법
- Table I의 조성에 따라 비커에 Marcol 52를 넣고, GMO를 40℃ 이상으로 가온하여 녹인 후 정해진 조성에 따른 GMO를 피펫을 이용하여 비커에 담긴 Marcol 52에 가하고 균일하게 용해하기 위해 교반기를 이용하여 1시간 정도 교반시켜 유상을 조제하였다. GMO를 취하여 Marcol 52에 넣을 때 40℃ 이상으로 가열한 이유는 녹는점을 고려하여 GMO가 액상을 유지하여 Marcol 52에 잘 섞이도록 하기 위해서이다.
- Turbiscan®LAB 후방산란으로 얻어진 자료를 바탕으로 제조된 시료의 30℃에서 시료 내부에 일어나는 변화를 분석해보았다.
- 광원이 위치한 Reading Head에서 시료가 담긴 cell의 아래쪽에서 위쪽으로 움직이며 분석 시 매 40 µm 간격으로 Scanning 하여 광원의 반대편(180°각도)에 위치한 투과탐지기(transmission detector) 및 입사각과 45° 각도 뒤쪽에 위치한 후방산란탐지기(backscattering detector)에서 측정된 값을 바탕으로 분산상의 입자크기와 분산상과 연속상의 부피 분율에 따른 투과 및 후방산란 된 빛의 양을 동시에 측정한다.
- 그로 말미암아 안정성에 대한 평가를 내리기 어려워 분산안정성 측정장치인 Turbiscan®LAB을 이용하여 GMO 비율의 변화에 따른 시료의 안정성을 비교해보았다.
- 이 실험은 GMO를 유화제로 사용하여 W/O 유제의 제조 가능성을 알아보고자 수행하였다. 기본적으로 유상인 Marcol 52와 수상인 PBS, 그리고 입자의 안정화제로 쓰인 poloxamer 407의 중량을 일정하게 한 후 GMO의 양을 변화시켜가며 제조한 유제의 안정성을 평가해 보았다.
- 실험에서는 광유(mineral oil)인 Marcol 52를 외상으로 하고, 내상은 수상인 PBS를 사용하였고 궁극적으로 W/O 유제가 형성되어야 하므로, 유제의 유형평가에 쓰이는 대표적이고 기본적인 방법인 희석법을 실시하여 W/O 유제가 형성되는 것을 관찰하였다. 비커를 준비하고 증류수를 채운 후 만들어진 시료를 피펫으로 5 mL을 취해 증류수가 들어 있는 흔들림 없이 안정화된 비커의 수면 위에 조심스럽게 떨어뜨린 후 일어나는 현상을 관찰하였다.
- 실린더형의 측정용 유리 셀(glass cell)에 시료를 20 mL 취해 넣고 Turbiscan®LAB을 이용하여 30℃ 항온조건에서 1시간 동안은 5분 간격으로, 나머지 3시간은 30분 간격으로 총 4시간씩 측정하여 단기간 중 시료 내부에서 일어나는 현상을 측정하였다.
- 실험에서는 광유(mineral oil)인 Marcol 52를 외상으로 하고, 내상은 수상인 PBS를 사용하였고 궁극적으로 W/O 유제가 형성되어야 하므로, 유제의 유형평가에 쓰이는 대표적이고 기본적인 방법인 희석법을 실시하여 W/O 유제가 형성되는 것을 관찰하였다. 비커를 준비하고 증류수를 채운 후 만들어진 시료를 피펫으로 5 mL을 취해 증류수가 들어 있는 흔들림 없이 안정화된 비커의 수면 위에 조심스럽게 떨어뜨린 후 일어나는 현상을 관찰하였다.
- 이렇게 준비된 유상에 교반기 Mixer의 head를 담근 후 실온에서 1,000rpm으로 교반시키면서 조제된 수상을 천천히 가한 후 3분 동안 추가로 교반하여 유제를 제조하였다. 유제를 제조한 후 유제의 내부입자를 균일한 크기로 잘게 부수기 위해 교반을 통해 준비된 유제에 균질화 장치(UltraTurrax®)의 head를 담근 후 6,500 rpm에서 3분간 입자를 균질화하였다.
- 유제를 원심분리 하는 이유는 중력에 대한 가속시험의 목적으로, 원심분리 후 상의 분리를 관찰함으로써 단시간에 유제의 중력에 대한 불안정화 정도를 판단할 수 방법이다. 준비된 시료를 피펫을 이용하여 10 mL를 취해 실린더에 옮겨 원심분리기에 넣고 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 가혹 테스트를 한 후 유제의 상 분리를 관찰하였다.
대상 데이터
- Marcol 52(mineral oil)는 ExxonMobil(Texas state. USA)로부터 구입하였다. Monoolein(glyceryl monooleate, 이하 GMO로 약함)은 acyl group(oleyl group)의 순도가 >99%이고, ester(monoglyceride)의 순도가 >97%인 제품으로서 Cognis(Germany)로부터 구입하였고, Poloxamer 407은 BASF(Lutrol F127, Germany)에서 구입하였다.
- Monoolein(glyceryl monooleate, 이하 GMO로 약함)은 acyl group(oleyl group)의 순도가 >99%이고, ester(monoglyceride)의 순도가 >97%인 제품으로서 Cognis(Germany)로부터 구입하였고, Poloxamer 407은 BASF(Lutrol F127, Germany)에서 구입하였다.
- 본 시험에서 유화제로 사용되는 모조올레인(이하 GMO)은 HLB값이 3.8이며, 이는 물보다는 유상에 더 잘 녹으며 W/O 유제에서 외상으로 쓰이는 Marcol 52에 균일하게 용해시켰다.
- 여기에 쓰인 poloxamer 407 수용액은 모노올레인을 이용한 큐보좀 제조 시 입자의 안정화제로 쓰이는 물질로 이번 실험에서 제조하는 W/O 유제에서도 입자의 안정화를 위해 사용되었다.12) 여러 연구에서 poloxamer 407 수용액은 특이한 유동학적 특징을 보이는 것으로 밝혀졌는데 sol-gel 변화온도가 체온보다 낮아 poloxamer 407 용액이 액상으로 투여된 후 겔이 되는 것으로 알려져있다.
- 유화 분산장치로는 Direct driven digital stirrer(SS-11D, YoungJi Hana Tech Co., Korea), 균질화 장치(homogenizer)로는 Ultra-Turrax® T18 basic(IKA® LTD., Japan), 원심분리기 MF-550(Hanil Science Industrial., Korea), 분산안정성 측정장치로는 Turbiscan®LAB(Formulaction Co., France)을 사용하였다.
이론/모형
- 다음으로 다중광산란법(multiple light scattering method)을 이용한 기기인 Turbiscan®LAB을 이용하여 시료를 희석하지 않고 실제 농도에서 일어날 수 있는 유제 내부의 현상을 측정하였다.
성능/효과
- 그 형태에 따라 외상이 유상이고 내상이 수상인 W/O 유제, 외상이 수상이고 내상이 유상인 O/W가 분산계로서 널리 쓰이며, 이런 분산상태를 유지하기 위해서는 유화제가 첨가되어야 하는데, 적절한 유화제가 적정량 첨가되었을 때 유제는 안정해질 수 있다.1,2) W/O 유제는 백신의 효능을 향상시키는 백신 보조제(adjuvant)로써 널리 사용될 수 있고, 이것은 백신 작용부위에서 서서히 항원을 방출함으로써 형질 세포(plasma cell)에서 항체생성을 유도하여 과민반응은 줄이고 백신의 효율성을 증가시키는 작용을 한다. 이때도 적절한 유화제가 적당량 쓰일 때, 백신으로 말미암은 부작용을 줄일 수 있으며, 특히 유화제로 쓰이는 계면활성제는 물리적인 탈지질(delipidation)작용을 통해 단백질과 세포막의 친화성을 높여 면역효율성도 획득할 수 있다.
- 2) 유제를 제조함에 있어서 그 안정성은 매우 중요한 요소이나, 안정성 평가는 생각만큼 쉽지 않다. 유제의 분리현상에 대한 연구는 비교적 많이 이뤄져 있고, 유제의 안정성 평가에 대한 여러 방법이 제시되었다.
- 일반적으로 유화제가 적게 사용되었을 때에는 그 유제는 불안정해지고, 반대로 유화제가 너무 과량으로 사용되었을 때에는 급격한 유착이나 응집이 증가하는 양상을 나타내는 것으로 알려져 있다.2) 이번 실험 결과에서도 수화시킬 때 독특한 입방상을 형성하는 GMO의 특성을 고려했을 때 W/O 유화제로 사용된 양이 늘어난 GP3이나 GP4 시료의 분산상의 계면에 존재하는 GMO 상호 간의 친화성이 증가되어 입자들이 서로 모이게 되어 불안정한 양상을 보이고 상대적으로 GP2 시료가 가장 안정한 양상을 보이는 것으로 생각된다. (Fig.
- 그러나 poloxamer 407을 GMO와 함께 유화제로 사용한 시료 GP1, GP2, GP3 또는 GP4의 경우는 유상의 분리 정도가 GMO의 양의 변화에 따라 변하는 양상을 육안으로 비교하기 어려웠고, 탁도(turbidity)가 높아 아래층에 가라앉은 비율도 육안으로 관찰하기 어려웠다. Poloxamer 407을 사용하지 않은 시료 G1은 원심분리를 거치지 않더라도 유화를 시킨 후 얼마 지나지 않아 분리가 일어나는 것으로 보아 단순히 GMO만을 유화제로 사용했을 때보다는 poloxamer 407을 유화제로써 함께 사용했을 때 비교적 안정한 유제를 얻을 수 있음을 알 수 있었다. 실제로 유화제가 단독으로 사용되었을 때보다 다른 유화제와 함께 사용된 유화제의 혼합물은 단일 유화제의 에너지 상태보다 낮은 에너지 상태를 나타내기 때문에 더욱 안정화되는 것으로 알려져 있다.
- Turbiscan®LAB을 이용한 자료를 분석하였을 때 시료 전체적인 변화양상을 살펴보면 일반적인 유중수형 유화제의 HLB 값의 범위인 3~6에 근접한 GP3이나 GP4 시료보다 HLB 값이 6.6~7.6인 범위의 유화제를 사용한 GP2 시료가 가장 안정한 것으로 나타났다.
- 이러한 중력에 대한 분리도를 관찰함으로써 기본적인 유제의 안정성을 평가할 수 있기 때문에 이번 실험에서는 중력에 대한 가속시험의 하나로 시료에 3,000 rpm에서 10분간 원심분리를 함으로써 단시간에 준비된 시료의 안정성을 판단할 수 있었다. 그 결과 poloxamer 407 없이 GMO만을 단독으로 사용한 시료(G1)는 확연하게 유상이 분리되는 것을 육안으로 관찰할 수 있었다. 그러나 poloxamer 407을 GMO와 함께 유화제로 사용한 시료 GP1, GP2, GP3 또는 GP4의 경우는 유상의 분리 정도가 GMO의 양의 변화에 따라 변하는 양상을 육안으로 비교하기 어려웠고, 탁도(turbidity)가 높아 아래층에 가라앉은 비율도 육안으로 관찰하기 어려웠다.
- 즉, 유화제로 둘러싸인 분산상인 수상 입자들이 그 비중에 의해 시료의 아래로 침전을 일으켰음을 알 수 있다. 둘째로, 시료의 중간 부분 (약 10 mm~40 mm)에서의 시간에 따른 후방산란 값(BS)이 시간이 지날수록 조금씩 작아지는 것은 입자사이즈의 증가를 의미하는 것으로 시료의 중간 부분의 내부에서 미세하게나마 입자들의 응집(coalescence)이나 유착(flocculation)이 일어나고 있다는 것으로 예측할 수 있다. 마지막으로 시간이 지날수록 시료의 하층부에선 후방산란 값이 다소 증가하는 것은 입자 내에서 photon의 mean free path (λ*)가 감소하는 것을 뜻하며 이는 하층부에서 입자밀도가 증가한다는 것을 의미하며 다시 한번 모든 시료에서 분산상인 수상 입자들의 비중에 의해 공통으로 입자의 침전(sedimentation)이 일어났다는 것을 알 수 있었다.
- 응집이나 유착을 막아 입자를 안정화시킬 수 있는 다른 부가적인 성분을 찾아 함께 유화제로 사용하면 W/O 유제에서 유화제로 응용될 수 있을 것으로 사료된다. 또한, 일반적으로 W/O 유제의 경우 그 탁도가 높아 육안으로 분산상의 내부현상을 관찰하고 안정성을 평가하는데 어려움이 따르나 다중광산란법(multiple light scattering method)을 이용한 Turbiscan®LAB은 시료를 희석하지 않고 보다 빠르게 그 안정성을 평가할 수 있어서 안정성 평가에 효율성을 높여줄 수 있음을 알 수 있었다.
- 마지막으로 시간이 지날수록 시료의 하층부에선 후방산란 값이 다소 증가하는 것은 입자 내에서 photon의 mean free path (λ*)가 감소하는 것을 뜻하며 이는 하층부에서 입자밀도가 증가한다는 것을 의미하며 다시 한번 모든 시료에서 분산상인 수상 입자들의 비중에 의해 공통으로 입자의 침전(sedimentation)이 일어났다는 것을 알 수 있었다.
- 그로 말미암아 안정성에 대한 평가를 내리기 어려워 분산안정성 측정장치인 Turbiscan®LAB을 이용하여 GMO 비율의 변화에 따른 시료의 안정성을 비교해보았다. 빛의 투과(transmission, T)와 후방산란(backscattering, BS)을 측정하였고, 이렇게 얻어진 자료를 분석하면 육안으로 관찰하여 시료의 안정성을 판단할 때보다 4배에서 최대 50배 정도 짧은 시간으로도 시료의 안정성을 판단할 수 있고 이를 근거로 시료의 장기적인 안정성까지 예측할 수 있었다.9) Fig.
- 증류수 수면에 떨어진 W/O 유제 방울이 물 위에 떠있는 이유는 물보다 비중이 작은 유상이 외상으로써, 내상인 수상을 둘러싸고 있기 때문이다. 실험에서 제조한 유제 또한 증류수보다 비중이 작은 Marcol 52가 PBS를 둘러싸고 있어서 원래 서로 섞이지 않는 Marcol 52와 비커의 증류수 사이의 계면장력에 의해 두 상이 섞이지 않고 증류수 위에 떠있는 것이 관찰되었다. 이것으로 제조된 시료는 W/O 유제가 형성된 것으로 판정하였다.
- W/O 유제의 경우, 시료가 불안정할수록 보존 시 연속상에 퍼져있던 분산상의 입자들이 중력에 의해 가라앉게 되어 외상인 유상이 분리되는 것을 관찰할 수 있다. 이러한 중력에 대한 분리도를 관찰함으로써 기본적인 유제의 안정성을 평가할 수 있기 때문에 이번 실험에서는 중력에 대한 가속시험의 하나로 시료에 3,000 rpm에서 10분간 원심분리를 함으로써 단시간에 준비된 시료의 안정성을 판단할 수 있었다. 그 결과 poloxamer 407 없이 GMO만을 단독으로 사용한 시료(G1)는 확연하게 유상이 분리되는 것을 육안으로 관찰할 수 있었다.
- 일반적으로 큐보좀 제조에 사용되는 GMO는 유중수형의 유화제로서 단독으로 사용했을 때는 그 유화능력이 떨어지나 큐보좀에서 안정화제로 사용된 poloxamer 407과 함께 사용되었을 때 유화능력이 증가함을 알 수 있었다. 하지만, GMO 자체의 친화성으로 인해 입자가 불규칙적으로 응집되거나 유착될 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
- 첫째로, 모든 시료의 마지막 측정시간인 4시간 05분에서의 측정된 후방산란 값 중 시료의 상층부(40 mm~45 mm)에서의 후방산란 된 빛의 양이 5분에 측정된 값에 비해 크게는 약 22%에서 작게는 약 5% 감소하는 양상을 보이는 것은 앞에서 언급한 식에 근거하여 입자 내에서 photon의 mean free path(λ*) 값이 증가했음을 의미하며 이것은 상층부에서 입자의 밀도가 감소하는 것을 의미한다.
- 마지막으로 시간이 지날수록 시료의 하층부에선 후방산란 값이 다소 증가하는 것은 입자 내에서 photon의 mean free path (λ*)가 감소하는 것을 뜻하며 이는 하층부에서 입자밀도가 증가한다는 것을 의미하며 다시 한번 모든 시료에서 분산상인 수상 입자들의 비중에 의해 공통으로 입자의 침전(sedimentation)이 일어났다는 것을 알 수 있었다. 특이적으로 두 번째 측정값이 나타내는 GP2 시료의 경우, 다른 시료와는 달리 측정 초기에 후방산란 값이 2시간 35분에 측정된 시점까지 기준점인 5분에 측정한 값에 비해 큰 값을 보이다가 3시간 05분 되는 시점에서 기준점보다 작은 값을 나타내기 시작하는 현상이 관찰되었다. (Fig.
후속연구
- 6-8) 모노올레인은 지질을 기제로 하기 때문에 생체적합 적이며 체내에서 쉽게 분해되므로 생체 내 투여 시 체내에 축적되지 않고 독성이 없는 장점이 있어 백신보조제의 유화제로써 응용할 수 있다. 또한, 기본적으로 물에 불용성을 띠며 기름에 잘 용해되고, HLB값이 3.8로 낮으며, 모노올레인의 양친매성 극성지질구조는 W/O 유제에서 유화제로 응용될 가능성을 보여준다.
- 하지만, GMO 자체의 친화성으로 인해 입자가 불규칙적으로 응집되거나 유착될 수 있다는 사실을 알 수 있었다. 응집이나 유착을 막아 입자를 안정화시킬 수 있는 다른 부가적인 성분을 찾아 함께 유화제로 사용하면 W/O 유제에서 유화제로 응용될 수 있을 것으로 사료된다. 또한, 일반적으로 W/O 유제의 경우 그 탁도가 높아 육안으로 분산상의 내부현상을 관찰하고 안정성을 평가하는데 어려움이 따르나 다중광산란법(multiple light scattering method)을 이용한 Turbiscan®LAB은 시료를 희석하지 않고 보다 빠르게 그 안정성을 평가할 수 있어서 안정성 평가에 효율성을 높여줄 수 있음을 알 수 있었다.
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