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문제 정의
- 5%이고 나머지 고형분의 60% 이상이 다당으로 알려져 있으므로(7, 29, 30), callus 열수 추출물의 당은 주로 다당과 같은 탄수화물 고분자라 생각되었다. 그러므로 이하에서는 건물 중량으로 추출물 고형분 의약 2/3를 차지하는 당에 대하여 검토하였다.
- 따라서 본 연구에서는 Aloe saponaria의 callus를 유도하였고, 아직 보고된 바 없는 callus의 열수추출에 의해 다당을 분리정제하여 그 특성을 조사, 규명하였으며, 이로부터 알로에 다당의 효율적 생산 수단으로서의 가능성을 살펴보고자 하였다.
제안 방법
- 구성당을 확인하기 위해 TLC 분석하였다. 즉, 소량의 시료를 IN H2SO4 용액에 용해하고 질소가스를 주입하여 밀봉한 다음, 100℃ 에서 10시간 동안 가수분해하였다.
- 2500 X g로 30분간 원심분리한 다음 상등액을 회수하여 회전증발기로 농축하였고, 이를 동결건조하여 추출 시료로 사용하였다. 농축된 추출 시료로부터 Sepharose CL-4B (Sigma-Aldrich, USA)를 사용한 gel permeation chromatography 에 의해 다당 분획을 얻었으며, 이 때, columne 2.5 X 65cm, flow rate는 16 mL/hr이었고, 0.1 M NaOH용액으로 용출하여 4 mL씩 분획하였다. 각 분획의 당 및 단백질 함량은 phenol-sulfuric acid 법(34)과 Lowry-Folin 법(35)으로 각각 측정하였다
- 높은 당 함량을 함유하는 callus 열수 추출물로부터 탄수화물 고분자 분획을 얻기 위해 Sepharose CL-4B를 사용하여 gel chromatography를 실시하였으며, 그 결과는 Fig. 2와 같다.
- 등이다(7). 따라서 알로에 callus 열수 추출물 (약 20% 수율)을 건조하여 얻은 시료의 일반성분을 분석하였으며, 그 결과는 Table 1과 같다.
- 1 M의 NaOH용액으로 평형 시켰다. 여기에 정제시료 및 표준당 [dextran (Sigma), Mw : 2,000, 000, 515,000, 162,000] 용액을 각각 충전한 후 0.1 M의 NaOH 용액으로 16 mL/hr의 속도로 용출하여 4 mL 씩 분획하였다 각 분획의 당 함량을 phenol-sulfuric acid 법(34)으로 정량하였고, 분자량과 용출부피를 도시하여 표준직선을 얻었으며, 이로부터 정제 다당 시료의 분자량을 산출하였다
- 용출액에서의 총 당 및 단백질의 농도를 측정하여 서로 다른 분자량을 갖는 2개의 분획 (Fr-I 및 Fr-II)을 얻었다. Fr I분획은 고분자 분획으로 소량의 단백질을 함유한 다당이었으며, 이후의 실험을 위해 Fr I 분획을 수집하였다.
- 2 cm/min. 이었으며, FID detector로 분석하였다.
-
분자량 측정
정제 다당 시료의 분자량은 Sepharose CL-4B를 column (2.5 X 65cm)에 충전하고, 0.1 M의 NaOH용액으로 평형 시켰다. 여기에 정제시료 및 표준당 [dextran (Sigma), Mw : 2,000, 000, 515,000, 162,000] 용액을 각각 충전한 후 0.
- 정제한 고분자 분획 Fr-I의 구성당을 조사하기 위해 산 가수분해하고, 각종 당, 아미노당 및 우론산을 표준물질로 TLC 하였으며, 그 결과를 Fig. 4에 나타내었다.
- 1에서와 같은 방법으로 실시하였다. 즉, Aloe saponaria의 조직배양으로 얻은 callus (10 g) 에 일정용량의 증류수 (100 mL)를 가하고 100℃ 에서 24시간 동안 환류 추출하였다. 2500 X g로 30분간 원심분리한 다음 상등액을 회수하여 회전증발기로 농축하였고, 이를 동결건조하여 추출 시료로 사용하였다.
- gas chromatography 하여 분석하였다. 즉, 시료의 소량을 0.1 N HC1 용액에 용해하고 질소가스를 충전한 다음 밀봉하여 100℃ 에서 5시간 동안 가수분해하였다. 가수분해 후 Ba(OH)2로 중화하여 원심분리하고 상등액을 회수한 후 회전증발기에서 농축하고 동결건조하였다.
- 한편, 고분자 다당 분획은 다시 투석막 (Sig血, MWCO : 12, 400)으로 투석한 다음 동결건조하였고, 이를 정제 다당 시료로 하였다.
- 한편, 정제한 고분자 분획의 구성당 조성은 다음과 같이, gas chromatography 하여 분석하였다. 즉, 시료의 소량을 0.
대상 데이터
- 가수분해 후 Ba(OH)2로 중화하여 원심분리하였으며, 상등액을 회수한 후 회전증발기로 농축하여 TLC 시료로 사용하였다. T* LC silica 처리된 plate (Merck)를 사용하였으며, 시료의 용출용매는 n-butanol, pyridine 및 0.1 N HCl (5:3:2, v/v)을 이용하였고, 발색제는 naphtho-resorcinol 용액을 사용하였다. 이 때, 표준물질로는 glucose를 비롯한 6종의 당류와 glucoseamine, glucuronic acid 및 galacturonic acid (Sigma)를 각각 사용하였다.
- 본 실험의 재료는 Aloe saponaria의 조직배양으로 얻은 crHus이었다. Callus는 Cho와 Lee의 방법(13)에 따라 다음과 같이 유도, 배양하였다.
- 1 N HCl (5:3:2, v/v)을 이용하였고, 발색제는 naphtho-resorcinol 용액을 사용하였다. 이 때, 표준물질로는 glucose를 비롯한 6종의 당류와 glucoseamine, glucuronic acid 및 galacturonic acid (Sigma)를 각각 사용하였다.
이론/모형
- 1 M NaOH용액으로 용출하여 4 mL씩 분획하였다. 각 분획의 당 및 단백질 함량은 phenol-sulfuric acid 법(34)과 Lowry-Folin 법(35)으로 각각 측정하였다
- 시료의 일반성분 (수분, 당, 단백질, 회분)을 분석하기 위해 수분과 회분 함량은 AOAC 법(36)으로 구하였으며, 당 함량은 phenol-sulfuric acid 법(34), 단백질은 Lowry-Folin 법(35)에 따라 각각 정량하였다
성능/효과
- Callus 추출물의 일반성분을 검토한 결과, 다당 53.2% (w/w), 단백질 7.3% (w/w), 회분 18.5% (w/w) 및 수분 21%를 함유하였다. Callus 추출물을 Sepharose CL-4B gel permeation chromatogrphy 하여 Fr-I 및 Fr-II 의 두 가지 당 분획을 얻었으며, 고분자 분획인 Fr-Ie 소량의 단백질을 함유하는 다당이었다 Fr-I 분획을 다시 투석하여 정제하였고, 이의 구성 단당 및 그 조성비를 각각 TLC 및 GC로 조사한 결과, glucose (77.
- 따라서 Aloe saponariae] callus 유래 다당은 구성 당비로 보면 maiman보다는 Gowda(32)가 보고한 ghi can에 가까우며 분자량도 더 커서 전 잎 (whole leaf) 유래의 다당과는 차이를 보였다. 따라서 intact Aloe saponaria 유래의 다당과는 다른 신규한 다당으로 생각되었으며, Silene vulgarise callus 유도시 배지조성이나 효소 처리에 따라 다당의 조성이 변하거나 수식 (modification) 된다는 보고(22, 24, 26) 사실을 고려할 때 추가 검토의 필요성이 있다고 판단되었다.
- 또 이를 보다 더 명확히 확인하기 위해 GC 분석한 결과에서도 Fig. 5에서와 같이, 역시 glucose, galactose 및 mannose가 검출되었으며, uronic acid도 미량 검출되었다. Gas liquid chromatogram의 면적으로부터 각 당의 함량비를 구한 결과는 Table 2와 같다.
- 이상으로부터 Aloe saponariae\ callus 배양에 의해 다당의 생성을 확인할 수 있었다. 또 이에 의한 다당의 생산은 식물체 분화나 callus의 현탁배양을 통한 대사산물의 생산에 비하면 상대적으로 배양기간이 짧고, 생산시설이 간편하며 또, 운전비용의 절감 등 경제적이므로 이의 현탁배양과 함께 알로에 다당 생산의 효율적인 수단으로서 차후 검토의 필요성이 매우 높다고 생각되었다.
- Gas liquid chromatogram의 면적으로부터 각 당의 함량비를 구한 결과는 Table 2와 같다. 표에서 보는 바와 같이, glucose가 77.6%로 대부분을 차지하였고, galactose 와 mannose도 각각 17.7 및 4.7% 함유하였으며, glucose, galactose 및 mannose의 비는 1 : 0.23 : 0.06이이었다.
후속연구
- 차이를 보였다. 따라서 intact Aloe saponaria 유래의 다당과는 다른 신규한 다당으로 생각되었으며, Silene vulgarise callus 유도시 배지조성이나 효소 처리에 따라 다당의 조성이 변하거나 수식 (modification) 된다는 보고(22, 24, 26) 사실을 고려할 때 추가 검토의 필요성이 있다고 판단되었다.
- 생성을 확인할 수 있었다. 또 이에 의한 다당의 생산은 식물체 분화나 callus의 현탁배양을 통한 대사산물의 생산에 비하면 상대적으로 배양기간이 짧고, 생산시설이 간편하며 또, 운전비용의 절감 등 경제적이므로 이의 현탁배양과 함께 알로에 다당 생산의 효율적인 수단으로서 차후 검토의 필요성이 매우 높다고 생각되었다.
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