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문제 정의
- 홍경천은 높은 약리작용에도 불구하고 특수한 배양 조건 및 낮은 번식율로 인해 홍경천 활성 성분의 대량생산이 불가능한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 환경에 구애받지 않고 대량생산 및 품질유지가 가능한 식물조직배양 공정을 통해 홍경천 조직으로부터 유도된 callus를 대상으로 초음파 추출공정을 적용하여 활성성분의 용출을 극대화 및 독성저감을 가능하게 하고 callus에 대한 항암활성을 탐색하여 홍경천 callus의 기능성 식품 소재로서 가치를 발견하고자 하였다.
- 이에 본 연구에서는 홍경천의 노지재배를 통한 유용물질 생산의 한계성을 극복할 수 있는 방안으로 외부 환경조건을 적절히 조절할 수 있고 좁은 공간에서도 대량생산이 가능한 기내배양기술을 적용하여 기내에서 홍경천 조직을 유도하여 얻은 홍경천 callus를 이용(10)하여 기존의 홍경천의 생리활성 연구에 있어 대표적인 약리기능으로 보고되었던 항암활성(2,9)을 평가함과 동시에 초음파 추출을 통한 홍경천 callus의 유용 활성성분의 효과적인 용출(11)이 항암 활성 증진 및 세포독성 저감에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
가설 설정
- 1)R.sachalinensis A. Bor root extracts by water extraction for 24 h at 100℃.
- 2)Callus extracts from R.sachalinensis A. Bor by water extraction for 24 h at 100℃.
제안 방법
- 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 배양한 macrophage를 4-5×104 cells/mL의 농도로 조절하여 24 well plate에 분주하여 실험에 사용하였으며, 추출물은 상기의 정상 세포를 이용한 독성 측정 실험에서 나타난 결과를 참고하여, 본 실험의 대상세포 활성에 있어서 세포독성을 배제할 수 있는 농도로 조절하여 실험에 사용하였다.
- 반응을 완료한 후 UV spectrophotometer를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH free radical 소거 활성은 대조구에 대한 시료 첨가구의 흡광도를 비교하여 다음과 같이 계산하여 측정하였다.
- DPPH(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) radical 소거활성은 Blois의 방법(13)을 변형하여 측정하였다.
- DPPH는 홀전자로 인해 전자나 hydrogen radical(H-)을 얻어 쉽게 안정화되는 대표적인 안정한 free radical의 모델로서 이러한 DPPH radical 소거능 측정을 통해 추출물의 전자공여능(electron donating abilities, EDA) 및 지질 과산화 초기 반응 저해활성을 평가하였다. DPPH(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) radical 소거활성은 Blois의 방법(13)을 변형하여 측정하였다.
- Ethanol을 용매로 하여 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL의 농도로 조절한 각 시료 10 µL와 100 mM sodium acetate buffer(pH 5.5) 990 µL를 분주한 시험관에 ethanol을 용매로 하여 제조된 0.5 mM DPPH 용액 0.5 mL를 넣고 vortex mixer를 이용하여 10초간 vortexing하여 완전히 혼합한 후 실온 암실에서 30분 정치하여 반응을 유도하였다.
- J774.1 macrophage(mouse)를 이용하여, 홍경천 및 홍경천 callus 의 첨가를 통하여 활성화 된 대식세포 배양액에 축적되어 있는 nitric oxide의 양을 microplate assay를 통해 정량하였다(15). 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지에서 배양한 macrophage를 4-5×104 cells/mL의 농도로 조절하여 24 well plate에 분주하여 실험에 사용하였으며, 추출물은 상기의 정상 세포를 이용한 독성 측정 실험에서 나타난 결과를 참고하여, 본 실험의 대상세포 활성에 있어서 세포독성을 배제할 수 있는 농도로 조절하여 실험에 사용하였다.
- 정상세포에 대한 독성은 인간 신장세포인 HEK293(human embryonic kidney cell line)과 인간 간세포인 HEL299(human embryonic lung cell line)을 통하여 측정하였으며 인간 면역세포인 T cell(Jurkat, ATTC, Manassas, VA, USA)과 B cell(Raji, ATTC, Manassas, VA, USA)를 사용하여 면역 세포 생육도를 측정하였다. Nitric oxide 생성능은 마우스 유래 macrophage(J774.1, ATTC, Manassas, VA, USA)를 사용하여 측정하였으며 위암세포인 AGS (human stomach adenocacinoma, ATTC, Manassas, VA, USA), 폐암세포인 A549(human lung carcinoma, ATTC, Manassas, VA, USA) 그리고 간암세포인 HEP3B(human hepatoma carcinoma, ATTC, Manassas, VA, USA)를 이용하여 소화기 및 호흡기 계통의 암에 대한 항암활성을 측정하였다. 본 실험에 사용한 인간 전과립 세포와 대식세포는 RPMI1640 배지에 10% heating inactivated FBS를 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 4-5세대 계대 배양하여 실험에 사용하였다.
- Nitrite의 표준물질로 sodium nitrite를 사용하였으며 농도는 32 µM부터 0.25 µM까지 RPMI1640 배지를 이용하여 단계 희석하여 얻어지는 표준곡선과 비교하여 생성량을 계산하였다.
- Selectivity는 SRB assay를 이용하여 각각의 시료 농도에서 각 정상세포에 대한 세포독성 및 각 암 세포주에 대한 생육 억제 활성을 측정한 후 각 농도에서의 세포 독성에 대한 암세포 생육 억제 활성의 비로 계산하였다.
- 각각의 시료의 최종 농도가 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 0.1 mg/mL가 되도록 조절한 후 배양된 정상세포에 농도별로 각각 100 µL씩 첨가하여 48시간 배양하였다(37℃, 5% CO2).
- 그 다음 0.1N HCl에 녹인 10% SDS 100 µL를 각 well에 첨가하고 차광상태에서 18시간 추가 배양 후 발색 된 각 well의 흡광도를 microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 통해 570 nm에서 측정하여 대조군의 흡광도에 대한 실험군의 흡광도를 백분율로 환산하여 세포 생존율을 계산하였다.
- 수득한 추출물에 대하여 초음파 발생기(Asia industry, Incheon, Korea)를 사용하여 40 kHz에서 60분 동안 초음파 추출을 시행하였다. 대조군에 적용한 추출 공정은 일반적인 열수 추출 공정으로써, 시료를 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 플라스크에 시료와 시료 중량의 10배수의 증류수를 용매로 넣고 100℃에서 12시간 씩 2회 추출을 시행하였다. 상기와 같은 초음파 추출과 열수 추출공정으로부터 얻어진 각각의 추출물은 감압농축기(rotary vacuum evaporator N-N series, Eyela, Tokyo, Japan)를 이용하여 여과, 농축한 뒤 동결건조를 통해 용매를 완전히 제거하여 건조한 Powder 상태로 제조하여 본 실험에 사용하였다.
- MTT assay(29)는 세포내 미토콘드리아의 dehydrogenase에 의한 MTT 환원을 통한 formazan의 농도를 측정함으로써 세포의 증식 및 생존율을 비교적 정확히 측정할 수 있으며, 실험 시 육안으로 그 발색을 확인할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 따라서 본 실험의 MTT assay를 통해 홍경천 및 홍경천 callus 추출물의 인간 면역 B, T 세포에 대한 생존율을 농도별로 측정하였으며 그 결과를 Table 1에 나타냈다.
- 배양이 종료되면 상등액을 제거하고 4℃, 10%(w/v) TCA(trochloroacetic acid)을 100 µL씩 가하여 4℃에서 1시간 동안 정치한 후 증류수로 5회 세척하여 TCA를 제거하고 실온에서 plate를 완전히 건조하였다.
- 본 실험에 사용한 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) assay(14)는 Yellow tetrasolium salt MTT가 살아있는 세포에서 미토콘드리아 dehydrogenase에 의해 물에 녹지 않는 자주색 formazan crystal로 환원되는 원리에 바탕을 두고 있으며, 이렇게 생성되는 crystal을 DMSO로 용해시켜 분광학적인 방법(spectroscopic method)으로 그 양을 정량하여 세포의 생존율을 확인하는 방법으로이다. 본 실험에서는 인간 유래 면역세포인 T cell(Jurkat)과 B cell(Raji)를 이용하여 홍경천 및 홍경천 callus의 첨가를 통한 면역세포의 생육 증식율을 측정하는 방법으로 면역 증진 활성을 평가하였다.
- cells/mL의 농도로 조절하여 single 세포의 상태로 96 well plate에 분주하였다. 상기 세포독성 측정 방법과 동일한 SRB assay를 통해 암세포 생육 저해 활성을 측정하였다.
- 대조군에 적용한 추출 공정은 일반적인 열수 추출 공정으로써, 시료를 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 플라스크에 시료와 시료 중량의 10배수의 증류수를 용매로 넣고 100℃에서 12시간 씩 2회 추출을 시행하였다. 상기와 같은 초음파 추출과 열수 추출공정으로부터 얻어진 각각의 추출물은 감압농축기(rotary vacuum evaporator N-N series, Eyela, Tokyo, Japan)를 이용하여 여과, 농축한 뒤 동결건조를 통해 용매를 완전히 제거하여 건조한 Powder 상태로 제조하여 본 실험에 사용하였다.
- 소화기계 암세포주인 인간 위암세포(AGS) 및 인간 간암세포(HEP3B), 호흡기계 암세포주인 인간 폐암세포(A549)를 이용하여 홍경천 및 홍경천 callus의 첨가를 통한 인간 유래 암세포의 생육 저해활성 측정을 통해 항암활성을 평가하였다.
- 초음파 추출은 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 플라스크에 시료와 시료 중량의 10배수의 증류수를 용매로 넣고 60℃에서 12시간 동안 추출을 2회 반복하였다. 수득한 추출물에 대하여 초음파 발생기(Asia industry, Incheon, Korea)를 사용하여 40 kHz에서 60분 동안 초음파 추출을 시행하였다. 대조군에 적용한 추출 공정은 일반적인 열수 추출 공정으로써, 시료를 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 플라스크에 시료와 시료 중량의 10배수의 증류수를 용매로 넣고 100℃에서 12시간 씩 2회 추출을 시행하였다.
- 실온에서 완전히 건조 후 10 mM Tris buffer 100 µL를 첨가하여 염색액을 녹여낸 후 540 nm에서 micropalte reader(THERMO max, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 흡광도를 측정하여 정상세포에 대한 독성을 측정하였다.
- 인간 신장 정상 세포인 HEK293에 대한 홍경천 및 홍경천 callus 추출물과 항피로(16), 항염증(17) 및 항바이러스 작용(18) 등에 대해 높은 활성을 갖는 것으로 보고되어 있는 홍경천의 대표적 활성 성분으로 배당체의 일종인 salidroside의 세포독성을 측정하였다. Fig.
- 인간 유래 면역세포는 10%의 FSB를 포함하는 RPMI1640 배지에서 배양하였으며, 1×105 cells/mL의 농도로 조절하여 96 well plate의 각 well에 100 µL씩 분주하고 최종 농도를 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL로 조절한 시료를 각각 100 µL씩 첨가하여 48시간 동안 배양하였다(37℃, 5% CO2).
- 인간 정상 신장 세포 HEK293와 인간 정상 간 세포인 HEL299를 이용하여 SRB(sulforhodamine B) assay(12)를 통해 홍경천 및 홍경천 callus의 정상세포에 대한 독성을 측정하였다. SRB assay는 세포 단백질 염색을 통하여 세포의 증식이나 독성을 측정하는 방법으로 실험에 앞서 상기의 각 정상세포의 농도가 4-5×104 cells/mL가 되도록 배양한 후 96 well plate의 각 well에 100 µL씩 분주하여 24시간 동안 배양하였다(37℃, 5% CO2).
- 정상세포에 대한 독성은 인간 신장세포인 HEK293(human embryonic kidney cell line)과 인간 간세포인 HEL299(human embryonic lung cell line)을 통하여 측정하였으며 인간 면역세포인 T cell(Jurkat, ATTC, Manassas, VA, USA)과 B cell(Raji, ATTC, Manassas, VA, USA)를 사용하여 면역 세포 생육도를 측정하였다. Nitric oxide 생성능은 마우스 유래 macrophage(J774.
- 초음파 추출은 수직 환류 냉각기가 부착된 추출 플라스크에 시료와 시료 중량의 10배수의 증류수를 용매로 넣고 60℃에서 12시간 동안 추출을 2회 반복하였다. 수득한 추출물에 대하여 초음파 발생기(Asia industry, Incheon, Korea)를 사용하여 40 kHz에서 60분 동안 초음파 추출을 시행하였다.
- 홍경천 및 홍경천 callus 추출물의 항암활성 평가를 위해 인간 유래 폐암 세포주 A549, 위암 세포주 AGS, 간암 세포주 Hep3B를 이용하여 농도별 추출물 첨가에 따른 세포 생육을 SRB assay를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 홍경천 활성 단리 물질인 Salidroside은 R&S Pharmchem Co.(Zhejiang Province, P. R. China)로부터 구입하여 본 연구에 사용하였다.
- 25 µM까지 RPMI1640 배지를 이용하여 단계 희석하여 얻어지는 표준곡선과 비교하여 생성량을 계산하였다. NO 생성의 양성대조구 물질로는 LPS(lipopolysaccharide)를 사용하였다.
- 1, ATTC, Manassas, VA, USA)를 사용하여 측정하였으며 위암세포인 AGS (human stomach adenocacinoma, ATTC, Manassas, VA, USA), 폐암세포인 A549(human lung carcinoma, ATTC, Manassas, VA, USA) 그리고 간암세포인 HEP3B(human hepatoma carcinoma, ATTC, Manassas, VA, USA)를 이용하여 소화기 및 호흡기 계통의 암에 대한 항암활성을 측정하였다. 본 실험에 사용한 인간 전과립 세포와 대식세포는 RPMI1640 배지에 10% heating inactivated FBS를 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 4-5세대 계대 배양하여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 홍경천은 2004년 중국 연변에서 백두산에서 채취한 홍경천(Rhodiola sachalinensis A. Bor) 뿌리를 수입하여 세척한 후 상온 음지에서 건조 후 약 0.5 cm의 적당한 크기로 분쇄하여 사용하였으며, 홍경천 조직에서 유도된 callus는 전남대학교 식물생리학실험실에서 30일 동안 배양된 홍경천 callus 배양체를 건조한 상태로 제공 받았다. 홍경천 뿌리는 열수 추출하였으며, 홍경천 callus는 열수 추출과 초음파 추출을 각각 시행하여 추출물을 획득하였다.
- 혈청은 HYCLONE(Walsam, MA, USA)의 Fetal bovine serum(FBS)을 이용하였고 gentamycin sulfate, trypsin-EDTA는 SIGMA사의 것을 사용하였다. 세포 염색을 위한 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetra-zilium bromide(MTT)와 sulforthodamine B(SRB), 그리고 nitric oxide 생성량 측정에 사용된 Lipopolysaccharide(LPS)는 SIGMA사로부터 구입하였다. 본 연구에 사용한 홍경천 활성 단리 물질인 Salidroside은 R&S Pharmchem Co.
- 세포배양 배지로 Roswell park memorial institute medium(RPMI1640), Dulbecco's modifide eagle medium(DMEM)를 GIBCO(Carlsbad, CA, USA)로부터 구입하였고, Hepes buffer는 SIGMA(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 혈청은 HYCLONE(Walsam, MA, USA)의 Fetal bovine serum(FBS)을 이용하였고 gentamycin sulfate, trypsin-EDTA는 SIGMA사의 것을 사용하였다. 세포 염색을 위한 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetra-zilium bromide(MTT)와 sulforthodamine B(SRB), 그리고 nitric oxide 생성량 측정에 사용된 Lipopolysaccharide(LPS)는 SIGMA사로부터 구입하였다.
- 5 cm의 적당한 크기로 분쇄하여 사용하였으며, 홍경천 조직에서 유도된 callus는 전남대학교 식물생리학실험실에서 30일 동안 배양된 홍경천 callus 배양체를 건조한 상태로 제공 받았다. 홍경천 뿌리는 열수 추출하였으며, 홍경천 callus는 열수 추출과 초음파 추출을 각각 시행하여 추출물을 획득하였다.
데이터처리
- 본 연구에서 실험값의 통계는 SPSS package program(ver. 12.0, SPSS Inc, Chicago, IL USA)의 paired t-test로 검정하였으며 모든 Data는 평균±표준편차(Mean±SD)로 나타내었다.
성능/효과
- 인간 신장 정상 세포인 HEK293에 대한 홍경천 및 홍경천 callus 추출물과 항피로(16), 항염증(17) 및 항바이러스 작용(18) 등에 대해 높은 활성을 갖는 것으로 보고되어 있는 홍경천의 대표적 활성 성분으로 배당체의 일종인 salidroside의 세포독성을 측정하였다. Fig. 1은 인간 신장 정상 세포인 HEK298에 대한 세포 독성 측정 결과로 salidroside가 0.6 mg/mL 이상의 농도에서 유의적인 독성 증가를 보이며 모든 농도에서 가장 높은 세포독성을 나타낸 것과 비교해 모든 추출물이 이보다 낮은 세포독성을 나타내었으며, 특히 홍경천 callus 초음파 추출물이 최고 농도 1.0 mg/mL에서 21.78%의 가장 낮은 세포독성을 나타냈다. 인간 신장 정상 세포에서 홍경천과 callus 추출물이 유의적인 큰 세포독성 차이를 나타내지 않은 것으로 미루어 볼 때 조직 배양공정이 인간 신장 정상세포에 독성으로 작용하는 물질의 파괴나 변성에는 크게 영향을 주지 않은 것으로 사료된다.
- Fig. 3의 결과 에서 확인할 수 있듯이 모든 추출물 첨가를 통하여 AGS의 생육이 저해되었으며, 홍경천 callus 초음파 추출물에서 0.6 mg/mL의 농도일 때 59.95%의 세포생육 저해활성 및 6.42의 높은 selectivity를 나타내어 효과적인 항암활성을 확인하였다. 이와 같은 결과는 항암활성을 갖는 식용식물로 생약재로 암환자에게 많이 처방되는 약재 중 그 활성이 매우 높다고 보고된 사자발쑥 추출물의 항암활성에 관한 연구(22)에서 초음파 추출공정을 통한 사자발쑥 추출물이 1.
- 8 mg/mL 이상의 농도에서 급격한 암세포 저해 활성 증진을 나타내었으며 전체적으로 홍경천 callus 추출물의 활성이 높게 나타난 것을 확인할 수 있다. callus 초음파 추출물은 최고농도 1.0 mg/mL에서 73.19%의 가장 높은 활성을 나타냈으며 selectivity 또한 0.8 mg/mL에서 5.94로 가장 높게 나타났다. 간암은 잔존 간 기능과 환자의 활력상태 및 지속적인 관리 등이 치료에 영향을 미치는 중요한 인자로 작용한다는 점에서 다른 암과는 구별되며 종양 특성상 성장과 침윤이 빨라 암화가 상당히 진행된 상태에서의 치료가 어렵다는 특징이 있다(23).
- 또한 인간 간 정상 세포인 HEL299를 대상으로 동일한 세포독성 실험 결과, salidroside가 HEK293에서의 독성 결과와 유사한 패턴을 보이고 0.6 mg/mL 이상의 농도에서 급격한 증가를 나타내었으며, 최고 농도 1.0 mg/mL에서 28.08%의 가장 높은 세포독성을 나타낸 반면 홍경천 callus 추출물은 농도에 따른 급격한 세포독성의 증가 없이 전체적으로 완만하고 유의적인 낮은 세포독성을 나타내었으며, 특히 최고 농도 1.0 mg/mL에서 홍경천 추출물보다 약 10% 낮은 13.16%를 나타내며 가장 낮은 세포독성을 확인 할 수 있었다.
- 암의 예방 및 억제에 중요한 기전으로 작용할 수 있는 항산화 활성 평가를 위해 DPPH radical 소거능을 측정한 결과, 초음파 공정을 통한 callus 추출물에서 홍경천의 높은 항산화 작용을 확인할 수 있었다. 또한 인간 면역세포 생존율의 측정을 통해 홍경천 및 callus 추출물에 의해 면역세포가 자극을 받는 것을 확인할 수 있었으며 대식세포의 NO생성량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 면역계 세포들의 면역체계의 항상성 유지 및 antibody와 cytokine과 같은 면역물질 생성을 통한 암세포 억제 및 제거작용이 가능할 것이라 사료된다.
- 또한 인간 유래 간암세포, HEP3B에 대한 항암활성을 측정한 결과(Fig. 4), salidroside를 포함한 모든 추출물이 0.8 mg/mL 이상의 농도에서 급격한 암세포 저해 활성 증진을 나타내었으며 전체적으로 홍경천 callus 추출물의 활성이 높게 나타난 것을 확인할 수 있다. callus 초음파 추출물은 최고농도 1.
- 또한 초음파 공정을 통해 추출한 홍경천 callus 추출물이 열수 추출물에 비해 약 9.64%의 높은 소거능을 보이며 활성이 증진된 것으로 보아 초음파 공정을 통해 callus의 항산화 활성 성분 용출이 용이하였음을 알 수 있다, 따라서 항산화 활성 성분 용출의 극대화가 가능한 효과적인 초음파 추출 공정을 통해 홍경천 callus가 항산화 및 암의 예방 및 억제가 가능한 식품 소재로서의 가치 창출에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
- 인간 면역세포인 B, T cell은 홍경천 및 홍경천 callus 추출물 첨가에 따라 농도 의존적으로 면역 활성에 자극을 받는 것을 확인할 수 있으며 홍경천 열수 추출물의 첨가를 통해 B세포와 T 세포에서 모두 가장 높은 생존율을 나타냈다. 또한 홍경천 callus 초음파 추출물이 평균적으로 callus 열수 추출물에 비해 높은 생존율을 나타내었다. 이러한 결과는 홍경천 조직으로부터 유도된 callus에 면역 활성에 유효한 영향을 미치는 활성 성분이 존재함과 동시에 앞선 항산화 실험 결과에서와 마찬가지로 이러한 유용 활성성분이 초음파 추출공정을 통해 용출이 용이해짐에 따라 결과적으로 그 활성이 높아 졌다는 것을 알 수 있다.
- 세포내 독소로 작용하는 LPS(lipopolysaccharide)와 추출물을 J774.1 세포 주에 처리하여 이틀간 배양한 후, 배양액 중에 NO−;농도를 측정한 결과, 시료처리를 하지 않은 대조군과 비교하였을 때 모든 시료 첨가군에서 높은 NO−; 생성을 나타내었다.
- 암의 예방 및 억제에 중요한 기전으로 작용할 수 있는 항산화 활성 평가를 위해 DPPH radical 소거능을 측정한 결과, 초음파 공정을 통한 callus 추출물에서 홍경천의 높은 항산화 작용을 확인할 수 있었다. 또한 인간 면역세포 생존율의 측정을 통해 홍경천 및 callus 추출물에 의해 면역세포가 자극을 받는 것을 확인할 수 있었으며 대식세포의 NO생성량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- 또한 홍경천 callus 초음파 추출물이 평균적으로 callus 열수 추출물에 비해 높은 생존율을 나타내었다. 이러한 결과는 홍경천 조직으로부터 유도된 callus에 면역 활성에 유효한 영향을 미치는 활성 성분이 존재함과 동시에 앞선 항산화 실험 결과에서와 마찬가지로 이러한 유용 활성성분이 초음파 추출공정을 통해 용출이 용이해짐에 따라 결과적으로 그 활성이 높아 졌다는 것을 알 수 있다. 따라서 초음파 추출 공정의 최적화를 통한 활성 성분의 용출 극대화를 통해 홍경천 callus의 기능성 식품 소재로서의 부가가치를 높일 수 있을 것이라 사료된다.
- 이상의 세포독성 실험 결과, 홍경천과 홍경천 조직으로부터 유도 된 callus의 세포독성이 큰 차이를 보이지 않은 것으로 미루어 보아 조직 배양 공정을 통해 독성 물질의 파괴나 변성을 기대하기 어려울 것으로 사료되나 자연산 홍경천 뿌리와 기내에서 배양된 callus에서 동일한 salidroside 성분이며 HPLC를 통한 정량 분석 결과 자연 상태의 홍경천의 뿌리가 건중량 당 0.17%의 salidroside를 함유하고 있음에 비해 callus에서 0.41%의 salidroside 생산성을 보여 자연산 홍경천 뿌리에 비해 callus에서 salidroside의 함량이 높은 것으로 보고된 바와 같이(19) 홍경천 조직에서 유도된 callus가 홍경천 식물체와 비교하였을 때 비교적 높은 활성성분 함량과 더불어 기내 조직 배양 공정을 통한 홍경천의 조직배양이 우수한 종자 유지와 기후 및 환경에 영향을 받지 않으며 대량생산이 가능함을 생각해 볼 때, 이러한 callus를 통한 유용 활성 성분의 생산이 홍경천의 기능성 식품 소재의 활용에 있어 매우 효율적인 방법임을 알 수 있다. 또한 이미 초음파 추출 공정을 통해 추출 수율 증진이나 홍경천의 세포독성 저감이 가능하다는 연구 결과가 보고되어 있으며(20) 홍경천 조직으로부터 유도된 callus 역시 본 실험에서 결과에서 확인된 바와 같이 일반 추출물에 비해 낮은 세포독성을 나타냄을 미루어 보아 초음파 추출 공정을 통한 홍경천 callus의 세포독성 저감으로 callus의 기능성 식품 소재화가 용이할 것으로 사료된다.
- 전자공여능 측정에 사용된 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)는 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 free radical로서 전자나 수소를 받아 불가역적으로 안정한 분자를 형성하여 환원되는데 이러한 radical을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 크면 높은 항산화 활성 및 활성산소를 비롯한 다른 radical에 대하여 소거 활성을 기대할 수 있다(26). 이에 홍경천 및 홍경천 callus 추출물의 DPPH radical 소거 활성을 농도별로 측정하여 비교한 결과, Fig. 7에 나타낸 바와 같이 홍경천 열수 추출물이 최고 농도 1.0 mg/mL에서 69.71%의 양호한 DPPH 전자 공여능을 나타낸 것과 비교해 callus 열수 추출물과 초음파 추출물은 동일 농도에서 각각 48.94%, 58.57%의 비교적 낮은 항산화 활성을 나타내었다. 하지만 이는 보편적인 식용식물로서 산화스트레스를 중화시키는 대표적인 자연 항산화제로 항산화 효소계를 강화함으로써 지질과 산화물의 형성을 억제하는 항산화 작용이 뛰어나다고 알려진 흑마늘의 DPPH radical 소거활성(27)이 10 mg/mL의 농도에서 69.
- 인간 면역세포인 B, T cell은 홍경천 및 홍경천 callus 추출물 첨가에 따라 농도 의존적으로 면역 활성에 자극을 받는 것을 확인할 수 있으며 홍경천 열수 추출물의 첨가를 통해 B세포와 T 세포에서 모두 가장 높은 생존율을 나타냈다. 또한 홍경천 callus 초음파 추출물이 평균적으로 callus 열수 추출물에 비해 높은 생존율을 나타내었다.
- 인간 정상 세포인 HEK293과 HEL299에 대한 세포독성을 측정한 결과, 홍경천과 callus의 독성이 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 홍경천 callus 초음파 추출물이 전체적으로 낮은 독성을 나타내는 것으로 미루어 보아 초음파 공정을 통한 세포독성 저감효과를 확인할 수 있었으며, 조직배양 공정을 통해 홍경천의 독성 저감이 이루어지지 않은 것을 미루어 볼 때 callus가 홍경천과 같거나 비슷한 정도의 활성 성분을 함유하고 있을 것이라 사료된다.
- 추출물 단독 첨가군과 추출물 및 LPS 혼합 첨가군의 NO−;생성량을 비교해 볼 때 홍경천 열수 추출물이 4.12 µm, 홍경천 callus 열수 추출물이 7.43 µm, 홍경천 callus 초음파 추출물이 8.82 µm로 LPS와 혼합 처리하였을 때 nitric oxide의 생성능이 큰 폭으로 증진되는 것을 확인하였으며, 이는 LPS 등 세균 내 독소와 함께 추출물의 활성성분이 대식세포의 면역 조절에 있어 상승작용을 이루었음을 알 수 있다.
- 홍경천 및 callus의 소화기, 호흡기 계통의 암세포 생육억제 활성 및 selectivity를 측정한 결과, 특히 간암 세포(HEP3B)에 대해 홍경천 및 callus 추출물의 고농도 첨가 시 암세포 저해 활성이 급격히 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, callus 초음파 추출물은 최고농도 1.0 mg/mL에서 73.19%의 암세포 생육저해 활성과 최고 5.94의 selectivity를 나타내었다. 전체적인 항암활성 측정 결과, callus 추출물에서 높은 항암활성을 나타냈으며 특히 위암 및 간암에 대한 탁월한 항암효과가 확인됨에 따라 앞으로 홍경천 및 홍경천 callus의 소화기계 암 또는 특정 암에 대한 항암활성 연구가 필요할 것으로 생각된다.
후속연구
- 간암은 잔존 간 기능과 환자의 활력상태 및 지속적인 관리 등이 치료에 영향을 미치는 중요한 인자로 작용한다는 점에서 다른 암과는 구별되며 종양 특성상 성장과 침윤이 빨라 암화가 상당히 진행된 상태에서의 치료가 어렵다는 특징이 있다(23). 그러므로 간암에 관여하는 인자를 중점적으로 조절할 수 있는 표적치료가 필요하며, HEP3B에 대한 홍경천 callus의 항암활성을 평가한 결과와 같이 고농도 첨가 시 특정 암세포에서 높은 생육 저해활성 및 selectivity를 나타내었던 홍경천 callus 추출물이 간암에 대한 탁월한 항암효과를 나타낼 것으로 사료되며, 앞선 결과와 마찬가지로 정상세포에 대한 낮은 독성에 비해 암세포에 대한 높은 생육저해를 가짐으로써 callus의 기능성 식품 소재로서의 활용을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
- 생체 내의 대사 활동에 의한 활성 산소의 과잉 생성은 인체의 효소 및 단백질, DNA 등의 손상을 가져오고 최근 연구에 의하면 이러한 과잉 공급된 활성 산소로 인해 유전자를 손상시키는 암의 개시 단계뿐만 아니라 촉진 단계에서도 작용하여 발암의 원인이 되는 것으로 알려졌다(25). 따라서 이러한 활성 산소를 조절하여 암 예방에 중요한 방어 기작으로 작용할 수 있는 항산화 소재에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.
- 이러한 결과는 홍경천 조직으로부터 유도된 callus에 면역 활성에 유효한 영향을 미치는 활성 성분이 존재함과 동시에 앞선 항산화 실험 결과에서와 마찬가지로 이러한 유용 활성성분이 초음파 추출공정을 통해 용출이 용이해짐에 따라 결과적으로 그 활성이 높아 졌다는 것을 알 수 있다. 따라서 초음파 추출 공정의 최적화를 통한 활성 성분의 용출 극대화를 통해 홍경천 callus의 기능성 식품 소재로서의 부가가치를 높일 수 있을 것이라 사료된다. 또한 면역세포 생존율을 통해 면역세포의 직접적인 사멸이 관찰되지 않음에 따라 추출물의 세포독성이 면역세포에 큰 영향을 미치지 않은 것으로 사료된다.
- 41%의 salidroside 생산성을 보여 자연산 홍경천 뿌리에 비해 callus에서 salidroside의 함량이 높은 것으로 보고된 바와 같이(19) 홍경천 조직에서 유도된 callus가 홍경천 식물체와 비교하였을 때 비교적 높은 활성성분 함량과 더불어 기내 조직 배양 공정을 통한 홍경천의 조직배양이 우수한 종자 유지와 기후 및 환경에 영향을 받지 않으며 대량생산이 가능함을 생각해 볼 때, 이러한 callus를 통한 유용 활성 성분의 생산이 홍경천의 기능성 식품 소재의 활용에 있어 매우 효율적인 방법임을 알 수 있다. 또한 이미 초음파 추출 공정을 통해 추출 수율 증진이나 홍경천의 세포독성 저감이 가능하다는 연구 결과가 보고되어 있으며(20) 홍경천 조직으로부터 유도된 callus 역시 본 실험에서 결과에서 확인된 바와 같이 일반 추출물에 비해 낮은 세포독성을 나타냄을 미루어 보아 초음파 추출 공정을 통한 홍경천 callus의 세포독성 저감으로 callus의 기능성 식품 소재화가 용이할 것으로 사료된다.
- 또한 이전의 연구(9)에서 홍경천의 ethylether 분획물의 각종 암세포에 대한 항암활성 측정 결과, 간암세포(HepG2) 및 대장암세포(HT29)에 있어 500 µg/mL의 농도에서 각각 약 90%와 60%의 항암 활성을 나타내었으며 특히 간암에 대해 큰 효과를 나타낸 것을 미루어 보아 홍경천 및 callus가 소화기계 암 또는 특정 암에 대하여 나타내는 항암활성에 대해 더 검토할 가치가 있다고 생각된다.
- 이는 추출물 자체가 가지고 있는 세포독성에기인한 것으로 사료되며 LPS를 처리한 실험군에서 9.57 µm의 NO−;가 생성된 것과 비교하여 낮은 수치로서, 홍경천 추출물 및 홍경천 callus가 염증반응 및 면역 활성에 있어 항상성을 유지하면서 면역기능조절 물질인 NO 생성에 있어 효과적인 결과를 나타낼 수 있을 것이라 사료된다.
- 또한 인간 면역세포 생존율의 측정을 통해 홍경천 및 callus 추출물에 의해 면역세포가 자극을 받는 것을 확인할 수 있었으며 대식세포의 NO생성량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해 면역계 세포들의 면역체계의 항상성 유지 및 antibody와 cytokine과 같은 면역물질 생성을 통한 암세포 억제 및 제거작용이 가능할 것이라 사료된다.
- 특히 홍경천 callus에서 NO−; 생성이 비교적 큰 폭으로 증가하는 것을 통해 홍경천 callus에 macrophage의 NO−;생성을 활성화시키는 성분이 존재하며, 이러한 NO−;가 항종양 및 항미생물 작용을 통해 면역체계를 조절하며 P53의 발현을 통해 암세포를 사멸시킨다는 연구결과(30,31)에 미루어 보아 홍경천 callus의 NO−; 생성 증진이 항암활성에 기여할 수 있을 것이라 기대할 수 있다. 이상의 결과로부터 홍경천 callus 추출물의 면역증강 활성을 통한 항암 소재로서의 가능성을 제시하고 있으며 이러한 높은 면역 활성의 규명을 위해 암세포에 대한 독성 및 선택적인 면역 활성을 나타내는 유효성분에 대한 탐색이 진행되어야 할 것이라 생각된다.
- 94의 selectivity를 나타내었다. 전체적인 항암활성 측정 결과, callus 추출물에서 높은 항암활성을 나타냈으며 특히 위암 및 간암에 대한 탁월한 항암효과가 확인됨에 따라 앞으로 홍경천 및 홍경천 callus의 소화기계 암 또는 특정 암에 대한 항암활성 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 최근 소화기계 위장관암의 한 종류인 인간 유래 위암세포(AGS)를 포함한 많은 종양세포가 정상세포에 영향을 주지 않으면서 암세포와 같은 형질변형 세포의 apoptosis를 유도하는 TNF-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)에 대한 저항성을 획득하고 있는 것으로 보고(21)됨에 따라 효율적인 암치료를 위한 새로운 항암 방법으로 상기 연구 결과에서 정상세포에 낮은 독성을 나타내었던 홍경천 callus가 식품의학적인 항암 소재로서의 기능적 역할을 할 수 있을 것이라 생각된다.
- 특히 홍경천 callus에서 NO−; 생성이 비교적 큰 폭으로 증가하는 것을 통해 홍경천 callus에 macrophage의 NO−;생성을 활성화시키는 성분이 존재하며, 이러한 NO−;가 항종양 및 항미생물 작용을 통해 면역체계를 조절하며 P53의 발현을 통해 암세포를 사멸시킨다는 연구결과(30,31)에 미루어 보아 홍경천 callus의 NO−; 생성 증진이 항암활성에 기여할 수 있을 것이라 기대할 수 있다.
- 하지만 상기의 세포독성 실험에서 고농도에서의 세포독성이 급격이 증가함을 고려해 볼 때 홍경천 callus의 항암 소재로의 활용을 위해서는 항암에 관여하는 활성성분의 용출을 극대화 할 수 있는 공정의 최적화뿐만 아니라 정상세포에 독성을 크게 주지 않으면서도 높은 항암 활성을 나타낼 수 있는 농도 최적화가 일차적으로 이루어져야 한다고 사료된다.
- 홍경천 조직으로부터 유도된 callus에 초음파 추출 공정을 적용할 시 세포독성 저감과 활성 성분 용출량의 극대화에 기인한 항암 및 암 발생과 억제 기작에 영향을 주는 항산화 및 면역증강 활성의 증가를 확인함에 따라 홍경천 callus가 기능성 항암 소재로서의 가치가 매우 높다고 사료된다. 하지만 이와 같은 홍경천 callus의 항암 소재로서 활용을 위해서는 활성성분의 용출을 극대화 할 수 있는 추출 공정의 확립과 홍경천 본래의 독성은 줄이고 암세포에 선택적인 활성을 나타낼 수 있는 활성 성분의 규명 및 정상세포 독성을 배제할 수 있는 추출물 농도의 최적화에 대한 연구가 이루어져야 하겠다.
- 홍경천 조직으로부터 유도된 callus에 초음파 추출 공정을 적용할 시 세포독성 저감과 활성 성분 용출량의 극대화에 기인한 항암 및 암 발생과 억제 기작에 영향을 주는 항산화 및 면역증강 활성의 증가를 확인함에 따라 홍경천 callus가 기능성 항암 소재로서의 가치가 매우 높다고 사료된다. 하지만 이와 같은 홍경천 callus의 항암 소재로서 활용을 위해서는 활성성분의 용출을 극대화 할 수 있는 추출 공정의 확립과 홍경천 본래의 독성은 줄이고 암세포에 선택적인 활성을 나타낼 수 있는 활성 성분의 규명 및 정상세포 독성을 배제할 수 있는 추출물 농도의 최적화에 대한 연구가 이루어져야 하겠다.
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