GABA 생성 젖산균으로 선발한 Lactobacillus acidophilus RMK567 균주를 멸균한 50 L의 MRS broth가 들어 있는 fermenter에 접종하여 40oC의 발효온도에서 24시간 배양 하였다. L. acidophilus RMK567 생균수는 $10.04{\pm}0.13$ Log CFU/mL이었으며, 이때 5.16시간의 유도기(L)를 거쳐 2.203시간의 세대시간(g)으로 증식하였으며, 생장률상수(k)는 0.454세대/h 이었다. 50 L의 MRS 배양액으로부터 회수한 cell paste의 총 중량은 487 g, 수분함량은 40.5%이었으며, 생균수는 12.48 Log CFU/g 이었다. Cell paste에 glycerol, glucose 및 polydextrose 등의 동결보호제를 첨가하여 $-45^{\circ}C$에서 deep frozen하고 84 mtorr의 진공 하에서 3시간 동결건조하여 총 408 g의 FD cell powder를 생산하였다. FD cell powder에 Streptococcus thermophilus를 혼합한 FD starter cultures의 수분함량은 4.25%, 3.90%, 및 4.08%이었으며, 생균수는 각각 12.42(FDA-GY), 12.60(FDB-GG)과 12.91(FDC-GP) Log CFU/g이었다. 모든 FD starter cultures는 $-18^{\circ}C$ 저장 초기부터 급속히 사멸하여 3.24% 이하의 생존률을 보였다. 각 동결보호제 처리구 간의 생균수 차이는 유의성을 보이지 않았으나, 저장기간에 따른 유의성은 p<0.01 수준에서 관찰되었다. 원유를 기초로 하는 요구르트 조제액에 MSG의 농도를 0.02%, 0.04% 및 0.05%을 첨가하고, FD starter culture로 배양한 요구르트의 GABA 함량은 각각 $155.16{\pm}8.53$ppm, $243.82{\pm}4.27$ ppm 및 $198.64{\pm}23.46$ ppm 이었다. 이 결과는 L. acidophilus RMK567의 FD starter culture가 동결건조 공정에 의하여 GABA 생성력이 감소하지 않았으며, GABA 함량이 높은 요구르트 제조에 유용하다는 사실을 보여주는 것이었다.
GABA 생성 젖산균으로 선발한 Lactobacillus acidophilus RMK567 균주를 멸균한 50 L의 MRS broth가 들어 있는 fermenter에 접종하여 40oC의 발효온도에서 24시간 배양 하였다. L. acidophilus RMK567 생균수는 $10.04{\pm}0.13$ Log CFU/mL이었으며, 이때 5.16시간의 유도기(L)를 거쳐 2.203시간의 세대시간(g)으로 증식하였으며, 생장률상수(k)는 0.454세대/h 이었다. 50 L의 MRS 배양액으로부터 회수한 cell paste의 총 중량은 487 g, 수분함량은 40.5%이었으며, 생균수는 12.48 Log CFU/g 이었다. Cell paste에 glycerol, glucose 및 polydextrose 등의 동결보호제를 첨가하여 $-45^{\circ}C$에서 deep frozen하고 84 mtorr의 진공 하에서 3시간 동결건조하여 총 408 g의 FD cell powder를 생산하였다. FD cell powder에 Streptococcus thermophilus를 혼합한 FD starter cultures의 수분함량은 4.25%, 3.90%, 및 4.08%이었으며, 생균수는 각각 12.42(FDA-GY), 12.60(FDB-GG)과 12.91(FDC-GP) Log CFU/g이었다. 모든 FD starter cultures는 $-18^{\circ}C$ 저장 초기부터 급속히 사멸하여 3.24% 이하의 생존률을 보였다. 각 동결보호제 처리구 간의 생균수 차이는 유의성을 보이지 않았으나, 저장기간에 따른 유의성은 p<0.01 수준에서 관찰되었다. 원유를 기초로 하는 요구르트 조제액에 MSG의 농도를 0.02%, 0.04% 및 0.05%을 첨가하고, FD starter culture로 배양한 요구르트의 GABA 함량은 각각 $155.16{\pm}8.53$ ppm, $243.82{\pm}4.27$ ppm 및 $198.64{\pm}23.46$ ppm 이었다. 이 결과는 L. acidophilus RMK567의 FD starter culture가 동결건조 공정에 의하여 GABA 생성력이 감소하지 않았으며, GABA 함량이 높은 요구르트 제조에 유용하다는 사실을 보여주는 것이었다.
${\gamma}-Aminobutyric$ acid (GABA) producing lactic acid bacteria, Lactobacillus acidophilus RMK567 was cultivated in 50 L of sterilized MRS broth using a fermenter at $40^{\circ}C$ for 24 h. The cell number was increased to $10.04{\pm}0.13$ Log CFU/mL with a growth...
${\gamma}-Aminobutyric$ acid (GABA) producing lactic acid bacteria, Lactobacillus acidophilus RMK567 was cultivated in 50 L of sterilized MRS broth using a fermenter at $40^{\circ}C$ for 24 h. The cell number was increased to $10.04{\pm}0.13$ Log CFU/mL with a growth rate constant (k) of 0.454 generation/h and a generation time (g) of 2.303 h after a lapse of a lag phase (L) of 5.16 h. A total of 487 g of cell paste with 40.5% moisture was harvested with viable cell number of 12.48 Log CFU/g cell paste. The cell pastes after preparation with glycerol, glucose, and polydextrose as cryo-protectants were lyophilized under a vacuum of 84 m torr. A total of 408 g of freeze dried (FD) cell powders were mixed with a commercial strain of Streptococcus thermophilus to prepare of three types FD starter cultures with the viable cell numbers of 12.42 (FDA-GY), 12.60 (FDBGG) and 12.91 (FDC-GP) Log CFU/g. During preservation the FD cultures at -$18^{\circ}C$, the cell viability of the FD starter cultures were rapidly dropped to below 3.24% of the day of storage. No significant difference was found in the cell viabilities among three types of FD starters cultures, but significant difference (p<0.01) was found in storage periods. Yoghurts fermented through FD starter culture of L. acidophilus RMK567 were determined to contain $155.16{\pm}8.53$ ppm, $243.82{\pm}4.27$ ppm, and $198.64{\pm}23.46$ ppm of GABA, respectively. This study shows that GABA production activity of L. acidophilus RMK567 is not affected during the freeze drying process and would be available for commercial production of yoghurt containing high GABA content.
${\gamma}-Aminobutyric$ acid (GABA) producing lactic acid bacteria, Lactobacillus acidophilus RMK567 was cultivated in 50 L of sterilized MRS broth using a fermenter at $40^{\circ}C$ for 24 h. The cell number was increased to $10.04{\pm}0.13$ Log CFU/mL with a growth rate constant (k) of 0.454 generation/h and a generation time (g) of 2.303 h after a lapse of a lag phase (L) of 5.16 h. A total of 487 g of cell paste with 40.5% moisture was harvested with viable cell number of 12.48 Log CFU/g cell paste. The cell pastes after preparation with glycerol, glucose, and polydextrose as cryo-protectants were lyophilized under a vacuum of 84 m torr. A total of 408 g of freeze dried (FD) cell powders were mixed with a commercial strain of Streptococcus thermophilus to prepare of three types FD starter cultures with the viable cell numbers of 12.42 (FDA-GY), 12.60 (FDBGG) and 12.91 (FDC-GP) Log CFU/g. During preservation the FD cultures at -$18^{\circ}C$, the cell viability of the FD starter cultures were rapidly dropped to below 3.24% of the day of storage. No significant difference was found in the cell viabilities among three types of FD starters cultures, but significant difference (p<0.01) was found in storage periods. Yoghurts fermented through FD starter culture of L. acidophilus RMK567 were determined to contain $155.16{\pm}8.53$ ppm, $243.82{\pm}4.27$ ppm, and $198.64{\pm}23.46$ ppm of GABA, respectively. This study shows that GABA production activity of L. acidophilus RMK567 is not affected during the freeze drying process and would be available for commercial production of yoghurt containing high GABA content.
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문제 정의
본 연구는 GABA 생성력이 높은 선발 젖산균인 L. acidophilus RMK567을 상업용 동결건조 컬쳐로 생산하기 위하여 회수한 세포 펠렛의 동결건조 공정과 저장 중 생존률을 알아보며, 동결건조 컬쳐로 제조한 요구르트의 GABA 함량과 동시에 동결건조 공정이 GABA 생성력에 미치는 영향을 알아보기 위한 목적으로 실시하였다.
가설 설정
2)DO means dissolved oxygen.
2)Fermentation was stopped at the final pH 4.40.
제안 방법
보존 중인 L. acidophilus RMK567을 3회 이상 MRS broth 에서 계대배양을 통하여 활력을 회복시켰다. 세포배양을 위하여 fermenter(Ko-Biotech Co.
acidophilus RMK567을 3회 이상 MRS broth 에서 계대배양을 통하여 활력을 회복시켰다. 세포배양을 위하여 fermenter(Ko-Biotech Co., Korea)에 MRS broth 50 L를 조제하고, 121oC 에서 15 분간 멸균한 후 39℃로 냉각한 다음 L. acidophilus RMK567을 18시간 배양한 MRS broth 1%를 무균적으로 접종하였다. Fermenter의 배양온도는 40±0.
5oC로 조정하였고, 배지는 40rpm의 속도로 완만하게 교반하였으며, 무균공기는 공급하지 않았다. 배양 중에 일어나는 각종의 변화는 fermenter에 장착된 pH meter, DO meter 및 thermometer로 수집하였다. 특히 멸균한 2 N NaOH 또는 1 N KOH 용액을 멸균 reservoir에 채우고 배지의 pH가 5.
배양 중에 일어나는 각종의 변화는 fermenter에 장착된 pH meter, DO meter 및 thermometer로 수집하였다. 특히 멸균한 2 N NaOH 또는 1 N KOH 용액을 멸균 reservoir에 채우고 배지의 pH가 5.20 이상 유지되도록 30초당 1초씩 자동공급하였다.
동결보호제로서 glycerol(GR grade, Duksan Chem., Korea), glucose와 poly dextrose (Food grade, Samyang Co., Korea) 등을 Table 1과 같이 glycerol(FD-GY), glycerol+ glucose(FD-GG), glycerol+polydextrose(FD-GP) 등으로 배합하여 10% 환원탈지유 500 mL에 각각 첨가한 후 121℃에서 5분간 멸균하여 냉각하였다. 각 첨가구에 cell paste 를 150 g씩 첨가하고 -45oC로 동결한 후 동결건조기 (Freeze Dryer, 증발용량 50 kg, Operon, Korea) 에서 냉열기 온도 -50 ℃, 냉열판 온도 -20oC, 84mton의 진공 하에서 건조하여 FD cell powder를 제조하였다.
, Korea) 등을 Table 1과 같이 glycerol(FD-GY), glycerol+ glucose(FD-GG), glycerol+polydextrose(FD-GP) 등으로 배합하여 10% 환원탈지유 500 mL에 각각 첨가한 후 121℃에서 5분간 멸균하여 냉각하였다. 각 첨가구에 cell paste 를 150 g씩 첨가하고 -45oC로 동결한 후 동결건조기 (Freeze Dryer, 증발용량 50 kg, Operon, Korea) 에서 냉열기 온도 -50 ℃, 냉열판 온도 -20oC, 84mton의 진공 하에서 건조하여 FD cell powder를 제조하였다.
L. acidophilus RMK567 균주로 제조한 FD cell powder (FD-GY, FD-GG, FD-GP)를 각각 100 g와 GABA 생성력이 없는 것으로 확인된 상업용 균주 S. thermophilus(CSL, Abiasa, Canada)를 10% 환원탈지유에서 18시간 배양하여 동결 건조시킨 분말 50 g과 탈지분유 50 g를 혼합하여 최종 3종류의 FD starter cultures(FDA-GY, FDB-GG, FDC-GP)를 제조하였고 각각 플라스틱 bags에 넣어 밀봉하여 냉장고(LG Electronics, Korea)에서 -18oC로 저장하였다.
요구르트 배양탱크(100 L, Buseong Eng., Korea)에 원유를 기초로 하는 요구르트 베이스 70 L을 조제한 후 90℃에서 5분간 살균하였다. 요구르트 베이스는 40oC로 냉각하고 L.
, Korea)에 원유를 기초로 하는 요구르트 베이스 70 L을 조제한 후 90℃에서 5분간 살균하였다. 요구르트 베이스는 40oC로 냉각하고 L. acidophilus RMK567의 FD culture를 1.0-2.0% 접종하였다. 요구르트 배양 후 최종 pH4.
40이 되는 7시간 때에 배양탱크에 냉각수를 공급하여 요구르트를 4oC 로 급속히 냉각시켜 배양을 종료하였다. GABA 생성 기질로서 MSG를 첨가하여 총 4회 요구르트를 제조하였으며, 첨가 수준은 MSG 맛이 느껴지지 않는 0.02% 수준과 GABA 생성량을 고려하여 0.04% 또는 0.05% 수준 첨가하였으며, 대조구로서는 상업용 균주인 ABT-B(Samik Dairy & Food, Korea)를 1.0% 접종하여 요구르트를 제조하였다.
Fermenter에 장착된 시료 채취용 밸브를 통하여 무균적으로 채취한 L. acidophilus RMK567 배양액, 원심분리 공정 후의 cell paste, 동결보호제와 혼합하여 동결한 deep frozen cell, 동결건조 공정 후 FD cell powder, S. thermophilus와 혼합한 FD starter cultures, 2주 및 4주 보존한 cultures, 70 L의 용량으로 제조한 요구르트 등 각 시료의 젖산균 함량을 측정하였다. 측정 시료는 1mL 또는 1 g을 취하여 0.
thermophilus와 혼합한 FD starter cultures, 2주 및 4주 보존한 cultures, 70 L의 용량으로 제조한 요구르트 등 각 시료의 젖산균 함량을 측정하였다. 측정 시료는 1mL 또는 1 g을 취하여 0.1% 펩톤용액에서 십진법으로 희석하고 1회용 멸균 petri dish에 분주한 후 멸균 MRS agai를 분주하여 37℃의 항온배양기 (Vision Scientific, Korea) 에 넣고 48시간 배양하여 나타난 전형적인 젖산균 균락을 계수하여 로그 값(Log CFU/mL)으로 환산하였다.
Cell paste와 FD cell powder의 수분함량은 Moisture Determination Balance(FD-600, Kett, Japan)를 이용하여 120oC 에서 15 분간 건조하여 구하였다.
요구르트 시료 50 μL를 취하여 건조 시킨 후 PICOtag 방법을 이용하여 hydrolysis 및 PITC labeling을 하였다. PITC labeling된 시료를 200 μL의 solvent A에 용해한 후 0.
대상 데이터
국내 원유에서 순수 분리하여 보존 중인 GABA생성력이 우수한 젖산균으로서 16S rDNA에 의한 동정 결과 L. acidophilus로 밝혀진 RMK567 균주를 사용하였다.
45 pm Millipore filter로 여 과하여 HPLC injector에 loading하였다. HPLC systeme 2기의 Hewlett Packard 1100 series pumps, Waters gradient controller, 및 HP 1100 series autosampler로 구성되었다. 분석 용 columne Nova-Pak C18 column(3.
HPLC systeme 2기의 Hewlett Packard 1100 series pumps, Waters gradient controller, 및 HP 1100 series autosampler로 구성되었다. 분석 용 columne Nova-Pak C18 column(3.9x300 mm, 4 m, Waters, USA)이었으며, detector는 HP 1100 series detector를 사용하여 254 nm에서 검출하였다. 용출 용매 a는 1.
데이터처리
본 실험에서 얻어진 동결보호제의 종류별 저장기간에 따른 생존수에 관한 자료의 통계처리는 SAS(1996)의 General Linear Model Procedure를 이용하여 분산분석을 실시하였고, 평균 간의 유의성 검정 (p<0.01)은 Duncan의 다중검정법으로 유의적인 차이를 비교하였다.
이론/모형
GABA 정성분 석은 한국기초과학지원연구원에서 실시하였다. 요구르트 시료 50 μL를 취하여 건조 시킨 후 PICOtag 방법을 이용하여 hydrolysis 및 PITC labeling을 하였다.
GABA 정량분석은 한국식품연구원에서 실시하였다. 요구르트 시료의 전처리는 Zhang과 Bown(1997)의 방법과 같이 eppendorf tube에 시료 0.
다시 13, 600xg 에서 5분간 원심분리한 후 상등액을 1/5 희석하여 550 pL를 cuvette에 넣었다. GABA 함량 측정은 Lim 등 (2009)의 방법에 준하여 실시하였다.
성능/효과
acidophilus RMK567의 생장에 관하여 얻은 결과는 Table 2에서 보는 바와 같다. 50 L 의 MRS broth에 L. acidophilus RMK567을 접종한 후의 생균수는 6.76 Log CFU/mL이었으며, 배양 15시간 때에 9.92 Log CFU/mL, 21시간 때에 10.01 Log CFU/mL의 생균수에 도달하였다. 젖산균 세포는 젖산균 수가 10.
04 Log CFU/mL 에 도달한 24시간 때에 회수하였다. 배양 중 pH를 5.2 이상으로 유지하기 위하여 KOH 또는 NaOH를 공급하였으나, 급격한 생균의 증식이 이루어지는 12시간 이후에는 pH가 5.0 수준으로 떨어졌으며, 정체기가 시작된 21시간 때부터는 젖산 생성속도가 감소하여 다시 pH 5.2 수준을 유지할 수 있었다. 동결 및 동결건조 과정에서 높은 생존력을 위해서는 젖산균 배양 중의 적정 pH가 5.
91(FDC-GP) Log CFU/g 이었다. 동결건조에 의한 세포 사멸률은 사용한 동결보호제 중에서 glycerol 이외의 당류를 첨가한 FDC-GG와 FDB-GP가 약간 낮은 것으로 보였으나, 유의적인 차이가 나타나지 않았다. 이와 같 d이 높은 생균수는, 동결건조를 대신할 수 있도록 조절된 저온진공 탈수조건에서 Response Surface Methodology (RSM) 에 의해 설정된 조성인 비지방성 유성분 107.
3종류의 FD starter cultures의 생균수는 저장 2주일 이내에 97% 이상 사멸하였다. 저장 2주일 후 FDA-GY는 2.45%, FDB-GG는 1.56%, FDC-GP 는 3.24%의 매우 낮은 생존률을 보였다. 저장 8주까지 생균수는 다시 약 90% 정도 감소하여 저장 2주일 후의 생균수에 비하여 각각 15.
24%의 매우 낮은 생존률을 보였다. 저장 8주까지 생균수는 다시 약 90% 정도 감소하여 저장 2주일 후의 생균수에 비하여 각각 15.92%, 13.21%, 8.29%가 생존하였다. 그러나, 동결 건조 직후의 생균수에 비하여 99% 이상 사멸하였다.
서로 다른 동결보호제의 혼합사용은 synergistic 효과 (Santivarankna 등 2007)가 있는 것으로 알려졌으나, Oldenhof 등(2005)은 membrane phase behavior 또는 건조 세포의 단백질 2차 구조에 부정적인 효과를 주기도 한다고 하였다. 본 연구에서 사용한 20% 의 무지고형분과 glycerol, glucose, polydextrose 등 3종류의 동결보호제는 동결건조 과정에서 일어나는 동결상해 방지 효과는 높았으나 저장 중에 일어나는 세포사멸 방지 효과는 크지 않은 것으로 보이며, glycerol 단독 효과에 비하여 혼합사용 효과가 크지 않았던 것으로 나타났다.
동결건조 후 저장 중 생존률은 Yu 등(2005b)이 유아의 변에서 분리한 L. acidophilus KH-1 를 생장적온에서 배양한 후 -20oC에서 냉동 보존하였을 때의 생존율 8.22% 및 9.86%보다 본 연구에서 얻어진 결과는 약간 낮은 수준이었지만, L. lactis LL41-1 를 냉동 저장하였을 때 저장 1일후 생존율은 83%이었고 2주일 후 생존율이 82% 수준 (Kim 등, 1998)에 비하면 매우 낮은 수준이었다. 저장 전동결보호제 처리구 별 생균수는 각각 12.
lactis LL41-1 를 냉동 저장하였을 때 저장 1일후 생존율은 83%이었고 2주일 후 생존율이 82% 수준 (Kim 등, 1998)에 비하면 매우 낮은 수준이었다. 저장 전동결보호제 처리구 별 생균수는 각각 12.28 (FDA-GY), 12.77(FDB-GG) 및 12.93(FDC-GP) Log CFU/g이었으며, 저장 8주일 후 생균수는 각각 10.04, 9.94, 및 10.33으로감소하였다. 이 결과로 볼 때, 저장 초기에는 glycerol+poly- dextrose를 혼합 첨가한 FDC-GP 컬쳐의 생존수가 비교적높은 편이었으나 모든 컬쳐가 유의적인 감소 (p<0.
33으로감소하였다. 이 결과로 볼 때, 저장 초기에는 glycerol+poly- dextrose를 혼합 첨가한 FDC-GP 컬쳐의 생존수가 비교적높은 편이었으나 모든 컬쳐가 유의적인 감소 (p<0.01)를 보였다. 2주일 이후부터는 감소정도가 완화되면서 비교적 높은 생존률을 유지한 반면에 glucose를 혼합 첨가한 FDB- GG구는 8주일 후에는 0.
01)를 보였다. 2주일 이후부터는 감소정도가 완화되면서 비교적 높은 생존률을 유지한 반면에 glucose를 혼합 첨가한 FDB- GG구는 8주일 후에는 0.21% 밖에 생존하지 못하여 생존률이 가장 낮은 편이었다. 저장기간 중 동결보호제 종류에 따른 생균수 감소경향이나 생존률에는 유의적 차이는 없는 것으로 나타났다.
21% 밖에 생존하지 못하여 생존률이 가장 낮은 편이었다. 저장기간 중 동결보호제 종류에 따른 생균수 감소경향이나 생존률에는 유의적 차이는 없는 것으로 나타났다. 본 연구에서 동결건조 후의 세포농도 및 생존수는 매우 높았으나 저장 초기의 생존률이 매우 낮았던 이유는 세포배양 중 대수 증식기에 pH가 5.
53ppm을 생성하였다고 보고하였다. 이 결과들과 비교할 때 L. acidophilus RMK567의 FD starter culture로 제조한 요구르트에서 배양 7시간 만에 생성한 GABA 함량은 그 보다 5-10배 높은 결과이었다. 한편 김치에서 분리한 L.
0.1%의 MSG를 함유하는 12% 환원탈지유에 계대배양한 L. acidophilus를 접종하여 배양 18시간때에 도달한 pH 는 4.50 수준이 었으며 , GABA 함량은 600 ppm 이 었다. 그러나 FD starter culture로 제조한 요구르트는 배양 17시간에 pH 4.
94 ppm 으로 증가하였다. 이와 같은 결과로 볼 때 L. acidophilus RMK567의 GABA 생성력은 동결건조 공정에 의하여 감소하지 않는 것으로 보이며, 특히 낮은 산성 환경에서도 생성력이 높게 유지되는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서 획득한 세포배양 공정 및 동결건조 공정 조건에 의하여 제조된 L.
후속연구
acidophilus RMK567의 GABA 생성력은 동결건조 공정에 의하여 감소하지 않는 것으로 보이며, 특히 낮은 산성 환경에서도 생성력이 높게 유지되는 것으로 나타났다. 따라서 본 연구에서 획득한 세포배양 공정 및 동결건조 공정 조건에 의하여 제조된 L. acidophilus RMK567의 FD starter culture는 GABA 함량이 높은 요구르트의 상업적 제조에 사용할 수 있을 것으로 판단된다.
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