Antimicrobial resistance patterns of Vibrio species isolated from brackish water in Geoje, Tongyeong and Goseong, Gyeongsangnamdo province into which streams, sewage and leachate all flowed. Only 19 strains (10.7%) of 177 V. parahaemolyticus were susceptible to 15 antimicrobials. 146 strains (69.5%)...
Antimicrobial resistance patterns of Vibrio species isolated from brackish water in Geoje, Tongyeong and Goseong, Gyeongsangnamdo province into which streams, sewage and leachate all flowed. Only 19 strains (10.7%) of 177 V. parahaemolyticus were susceptible to 15 antimicrobials. 146 strains (69.5%) proved resistant against more than one antimicrobial and 12 strains (6.8%) were multi-drug resistant. The resistance rate of 152 strains were 85.9% against AM and 26.6% against RA, 16.4% against AN, 13.6% against Sand 13.0% against TMP. 86 strains of 129 V. cholerae non-O1 (66.7%) were susceptible to antimicrobials and 31 strains (24.0%) were resistant to more than one antimicrobial and 12 strains (9.3%) were multi-drug resistant. The antimicrobial resistance rate of 129 strains against 15 antimicrobials, with the exception of C, CIP, E and GM, i.e. 11 antimicrobials, was 0.7-16.2%, 16.2% of 129 strains proved resistant against RA and 13.9% against AM, 9.3% against TMP, 7.7% against SXT and 6.9% against TE. 19 of 49 strains of V. mimicus (38.8%) were susceptible to antimicrobials and 31 strains (61.2%) were resistant against more than one antimicrobial; none of the strains were multi-drug resistant. 15 strains of V. mimicus were resistant against only RA, AmC and TE. The resistance rate was 59.2% against RA (highest) 4.1% against AmC and 2.0% against TE.
Antimicrobial resistance patterns of Vibrio species isolated from brackish water in Geoje, Tongyeong and Goseong, Gyeongsangnamdo province into which streams, sewage and leachate all flowed. Only 19 strains (10.7%) of 177 V. parahaemolyticus were susceptible to 15 antimicrobials. 146 strains (69.5%) proved resistant against more than one antimicrobial and 12 strains (6.8%) were multi-drug resistant. The resistance rate of 152 strains were 85.9% against AM and 26.6% against RA, 16.4% against AN, 13.6% against Sand 13.0% against TMP. 86 strains of 129 V. cholerae non-O1 (66.7%) were susceptible to antimicrobials and 31 strains (24.0%) were resistant to more than one antimicrobial and 12 strains (9.3%) were multi-drug resistant. The antimicrobial resistance rate of 129 strains against 15 antimicrobials, with the exception of C, CIP, E and GM, i.e. 11 antimicrobials, was 0.7-16.2%, 16.2% of 129 strains proved resistant against RA and 13.9% against AM, 9.3% against TMP, 7.7% against SXT and 6.9% against TE. 19 of 49 strains of V. mimicus (38.8%) were susceptible to antimicrobials and 31 strains (61.2%) were resistant against more than one antimicrobial; none of the strains were multi-drug resistant. 15 strains of V. mimicus were resistant against only RA, AmC and TE. The resistance rate was 59.2% against RA (highest) 4.1% against AmC and 2.0% against TE.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 어패류 양식장이 밀집되어 있으며 우리나라 굴 생산량의 약 85%를 차지하고 있는 경남지 역을대상으로 육상으로부터 유입되는 하천수, 마을오수 그리고 쓰레기 매립장에서 바다로 유입되는 기수지역에서 분리한 비브리오균을 중심으로 약제내성세균의 내성 패턴에 대해서 조사하였다.
제안 방법
유전자 검출 PCR시험을 위한 primer는 tdh 및 trh 검출용으로 각각 VPD・1/VPD・2와 VPR-1/VPR-2 (Takara, Japan)를 사용하였다. 시험균주는 Tryptic soy broth (Difco, USA) 10 mL에 접종하여 37℃, 18~24시간 배양한다음 10분간 heating block(EYELA, MG-1200, Japan)에서 가열한 후 균액 5 zzL, deoxynucleoside triphosphate mixture (1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, 1 mM dGTP) 2 “L, lOxPCR 용액 5"L, primer (lOOpmol/zeL) 1 z/L, Taq polymerase 1.25 U를 혼합하여 총 부피를 50就L로 제조하여 Thermal cycle (Takara, Japan)로 94笆에서 60초, 60^에서 60초, 72C에서 60초의 반응을 35회 반복하여 실시하였다.
V. ch。做况와 V. alginolyticus 의 경우에는 황색 집 락을, V. parahaemolyticus, V. mimicus 및 V. 가* dn車海는 녹색집락을 각각 취하여 Triple Sugar Iron Agar (Di財에 접종하여 35笆에서 24시간 배양한 후, 전형적인 반웅을 나타내는 균주를 대상으로 동정시험을 실시하였다. 즉, 내염성 시험, 42℃ 발육시험, ONPG (O-nitrophenyb0-D-galacto -pygoside)시험 등 생화학시험 및 VITEK system (BioMerieux Vitek, France)으로 동정하였다.
이때 자가 응집 여부를 확인하기 위하여 생리식염수와 균 부유액을 반웅시켜 확인하였다. 슬라이드 글라스를 전후로 기울여 응집여부를 광원하에서 관찰하여 1분 이내에 나타내는 강한 응집반응만을 양성으로 판독하였다. 혈청검사는 먼저 Polyvalent (Serovar Ogawa & Inaba)로 응집반응을 확인한 후, 양성이면 Inaba 및 Ogawa 혈청으로 추가로 확인하며 Polyvalent (Serovar Ogawa.
parahaemolyticus 균주를 대상으로 식중독을 유발시키는 독소 유전자인 tdh trh 유전자의 존재유무 확인은 PCR 방법을 사용하였다. 유전자 검출 PCR시험을 위한 primer는 tdh 및 trh 검출용으로 각각 VPD・1/VPD・2와 VPR-1/VPR-2 (Takara, Japan)를 사용하였다. 시험균주는 Tryptic soy broth (Difco, USA) 10 mL에 접종하여 37℃, 18~24시간 배양한다음 10분간 heating block(EYELA, MG-1200, Japan)에서 가열한 후 균액 5 zzL, deoxynucleoside triphosphate mixture (1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, 1 mM dGTP) 2 “L, lOxPCR 용액 5"L, primer (lOOpmol/zeL) 1 z/L, Taq polymerase 1.
5 mL에 넣고 균질하게 부유시켜 슬라이드 글라스에 구획을 그어 각각의 구획에 콜레라균 진단혈청을 1빙울 떨어뜨리고 그 위에 균부유액 20 成를 떨어뜨린 후 잘 섞었다. 이때 자가 응집 여부를 확인하기 위하여 생리식염수와 균 부유액을 반웅시켜 확인하였다. 슬라이드 글라스를 전후로 기울여 응집여부를 광원하에서 관찰하여 1분 이내에 나타내는 강한 응집반응만을 양성으로 판독하였다.
가* dn車海는 녹색집락을 각각 취하여 Triple Sugar Iron Agar (Di財에 접종하여 35笆에서 24시간 배양한 후, 전형적인 반웅을 나타내는 균주를 대상으로 동정시험을 실시하였다. 즉, 내염성 시험, 42℃ 발육시험, ONPG (O-nitrophenyb0-D-galacto -pygoside)시험 등 생화학시험 및 VITEK system (BioMerieux Vitek, France)으로 동정하였다.
동정된 각 비브리오 균주의 항균제 감수성은 Acar and Goldstein (1991)의 디스크 확산법과 미국 NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2004)에 준하여 시험하였다. 즉, 분리된 각 균주는 Muller Hinton Broth (Merck, Germany)에서 35℃, 18~24시간 배양한 다음 균주 배양액의 농도를 McFarland No. 0.5로 희석 조정하였다. 각 희석된 균액은 미리 1% 농도가 되도록 NaCl를 첨가한 두께 4 mm의 MuUer Hinton Agar (Merck, Germany, 이하 MHA) 평판에 도말하였다.
이때 항균제 디스크는 균 접종 후 15분 이내에 고착시켰으며, 시험 항균제는 amikacin (30 〃g, AN), ampicillin (1 0 “g, AM), amoxicillin/clavulanic acid (30 瘗, AmC), cefepime (30 以g, FEP), cefotaxime (30 仕& CTX), 아ilorampheiHcol (5 L电 C), ciprofloxacin (5 “g, CIP), erythromycin (5 県 E), gentamycin (10 GM), nalidixic acid (30 您, NA), rifampin (5 以g, RA), streptomycin (10 〃g, S), sulfamethoxazole/trimethoprim (25 //g, SXT), tetracycline (5 //g, TE), trimethoprim (5 略 TMP) 등 15종으로 BBL사 제품을 사용하였다. 항균제 디스크를 고착시킨 MHA 평판은 35℃, 16~ 18 시간 배양한 다음 균의 증식 저해대 (inhibition zone)의 크기를 calipers로 측정하여 감수성 유무를 판별하였으며, 감수성 결과의 정도관리를 위하여 Escherichia coll ATCC 25922를 표준 균주로 사용하여 각 항균제 디스크에 대한 역가를 확인하였다.
슬라이드 글라스를 전후로 기울여 응집여부를 광원하에서 관찰하여 1분 이내에 나타내는 강한 응집반응만을 양성으로 판독하였다. 혈청검사는 먼저 Polyvalent (Serovar Ogawa & Inaba)로 응집반응을 확인한 후, 양성이면 Inaba 및 Ogawa 혈청으로 추가로 확인하며 Polyvalent (Serovar Ogawa. & Inaba)0]] 음성 일 경우에는 0139 항혈청에 대한 응집여부를 확인하였다. 본시험에 사용한 혈청은 질병관리본부 국립보건연구원에서 제공받은 콜레라균 진단혈청을 사용하였다.
대상 데이터
경남 거저】, 통영 및 고성에 소재하는 지방 2급 하천 5개소(둔덕천, 간덕礼 오수礼 산양천 (거제), 병산천)와 소하천(서정천, 산양천 (통영)), 마을오수 (달아), 그리고 통영 쓰레기 매립장으로부터 유래한 오수가 바다로 유입되는 기수지역을 대상으로 2005년 6월, 8월 및 10월에 채취한 시료를 대상으로 병원성 비브리오균을 분리하였다 (Table 1). 국내 연안해수에서는 특히 하절기에 병원성 비브리오가 빈번히 검출되고 있다는 보고는 많이 있는데 (Chang et al.
본 연구는 2005년 6월, 8워 10월 3회에 걸쳐 경남일원 (거제, 통영, 고성)에 소재하는 주요 하천들 중 지방 2급 하천 5개소(둔덕천, 간덕천, 오수천, 산양천 (거제), 병산천)와 소하천 (서정천, 산양천 (통영)), 마을오수 (달아), 그리고 통영 쓰레기 매립장 등 육상으로부터 발생한 오수가 바다로 유입되는 기수지역에서 각각 시료를 채취하였다(Fig. 1). 시료는 1 1.
& Inaba)0]] 음성 일 경우에는 0139 항혈청에 대한 응집여부를 확인하였다. 본시험에 사용한 혈청은 질병관리본부 국립보건연구원에서 제공받은 콜레라균 진단혈청을 사용하였다.
균액이 접종된 MHA 평판은 5분간 방치하여 균액을 흡수시킨 후 항균제 디스크(0 8 nun)를 평판에 고착시 켰다. 이때 항균제 디스크는 균 접종 후 15분 이내에 고착시켰으며, 시험 항균제는 amikacin (30 〃g, AN), ampicillin (1 0 “g, AM), amoxicillin/clavulanic acid (30 瘗, AmC), cefepime (30 以g, FEP), cefotaxime (30 仕& CTX), 아ilorampheiHcol (5 L电 C), ciprofloxacin (5 “g, CIP), erythromycin (5 県 E), gentamycin (10 GM), nalidixic acid (30 您, NA), rifampin (5 以g, RA), streptomycin (10 〃g, S), sulfamethoxazole/trimethoprim (25 //g, SXT), tetracycline (5 //g, TE), trimethoprim (5 略 TMP) 등 15종으로 BBL사 제품을 사용하였다. 항균제 디스크를 고착시킨 MHA 평판은 35℃, 16~ 18 시간 배양한 다음 균의 증식 저해대 (inhibition zone)의 크기를 calipers로 측정하여 감수성 유무를 판별하였으며, 감수성 결과의 정도관리를 위하여 Escherichia coll ATCC 25922를 표준 균주로 사용하여 각 항균제 디스크에 대한 역가를 확인하였다.
이론/모형
동정된 V. parahaemolyticus 균주를 대상으로 식중독을 유발시키는 독소 유전자인 tdh trh 유전자의 존재유무 확인은 PCR 방법을 사용하였다. 유전자 검출 PCR시험을 위한 primer는 tdh 및 trh 검출용으로 각각 VPD・1/VPD・2와 VPR-1/VPR-2 (Takara, Japan)를 사용하였다.
분리 . 동정된 각 비브리오 균주의 항균제 감수성은 Acar and Goldstein (1991)의 디스크 확산법과 미국 NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 2004)에 준하여 시험하였다. 즉, 분리된 각 균주는 Muller Hinton Broth (Merck, Germany)에서 35℃, 18~24시간 배양한 다음 균주 배양액의 농도를 McFarland No.
K choleme non-Ol 분리균주 129균주 중에서는 15종의 항균제 중 C, CIP, E, GM을 제외한 11종의 항균제에 대하여 0.7~16.2%의 내성율을 나타내었는데, RA에서 16.2%로 가장 높은 내성을 나타내었으며, 다음으로 AM에 13.9%, NA와 TMP에서 9.3%, 그리고 TE과 SXT에서 각각 7.7% 및 6.9%를 나타내었다. 본 연구에서 분리된 V.
1%의 순이었다. V. cholerae non-01 129균주에 있어 항균제별 내성양상은 RA와 AM의 1제 내성이 각각 7.8% 및 7.0%로 높은 값을 나타내었으며, 다제내성 정도는 단일내성이 17.8%, 2제 내성이 6.2%, 5제 및 6제 내성이 3.9%의 순으로 나타났다. V.
V. cholerae non-Ol 129균주에서는 86균주(66.7%)에서 감수성을 나타내었고, 31균주(24.0%)에서 1종 이상, 그리고 12 균주 (9.3%)에서 다제내성을 나타내었다. 이는 Bakhshi et al.
9%의 순으로 나타났다. V. mimicus 49균주에 있어 항균제별 내성양상은 모두 4가지 패턴으로 다른 균종들에 비하여 매우 단순하였는데, 단일내성이 57.1%, 2제 내성이 4.0%로 나타났다. V.
V. mimicus 분리균주 49균주 중에서는 15종의 항균제 중 RA, AmC, TE 등 3종의 항균제에 대해서만 내성을 나타내어 비교적 낮은 내성율을 나타내 었는데, RA에서 59.2%로 가장높은 내성을 나타내었고, AmC과 TE에서 각각 4.1% 및 2.0%의내 성율을 나타내었다. Chowdhuiy et al.
alginolyticus 등 그 외 비브리오속의 균주는 분리되지 않았다. V. pa-ahaemolyticus 는 우리나라 연안의 해수와 수산물에서 널리 분포하여 연중 검출되고 있는데, 경북 동해와 울산, 그리고 통영연안의 해수 및 기수지역을 대상으로 병원성 비브리오를 분리한 결과 K. parahaemolyticus7\ 27.1 ~35.4%로 검출되어 본 연구 결과보다는 낮은 검 줄율을 나타내 었으나 (Choi and Jeong, 2001; Son et al., 2003; Gim et al., 2004), V. parahaemolyticuse\ 검줄율은 다른 비브리오균에 비하면 대체적으로 높은 검출율을 나타내고 있다.
mimicus 49균주에 대한 항균제별 내성양상을 Table 2에 나타내었다. V. parahaemolyticus 177균주에 있어 15종의 항균제에 대한 내성양상을 살펴보면 AM의 단일 내성이 44.1%로 가장 높았으며, 다음으로 AM, RA의 2제 내성이 13.6%를 나타내었다. 다제내성 정도는 단일내성이 차지하는 비율이 47.
V. parahaemolyticus 분리균주 177균주 중 152균주에서 15 종의 항균제 중 AM에 대하여 8第%로 가장 높은 내성을 나타내었으며, RA에 26.6%, AN에 16.4%, S에 13.6%, TMP에 13.0%의 순이었다. 그리고 E과 GM에서 1.
비브리오균을 분리하였다 (Table 1). 국내 연안해수에서는 특히 하절기에 병원성 비브리오가 빈번히 검출되고 있다는 보고는 많이 있는데 (Chang et al., 1986; 1996; Kim et al., 1997a; 1997b), 본 연구에서 분리된 병원성 비브리오는 모두 355 균주로써 V. parahaemolyticus7\ 177균주, V. cholerae non-Ol 129 균주, V. mimicus 49균주 등의 순으로 V. parahaemolyticus가 49.9%로 가장 많이 분리되었으며, V. vulnificus, V. alginolyticus 등 그 외 비브리오속의 균주는 분리되지 않았다. V.
0%의 순이었다. 그리고 E과 GM에서 1.1 ~3.4%의 비교적 낮은 내성을 나타내었으며, 그 외 TE, CIP 등 8종의 항균제에서는 감수성을 나타내었다. 본 연구에서도 알 수 있듯이 자연환경에서 분리된 비브리오균에 있어서 AM에 대한 높은 내성에 관해서는 많은 보고가 이루어져 있는데, Son et al.
그리고 V. cholerae로 동정 된 129균주는 Polyvalent (Serovar Ogawa & Inaba), Inaba, Ogawa 및 0139 antiserum의 4종의 콜레라 진단혈청을 이용하여 시험한 결과 각각의 혈청에 반응하지 않아 모두 V. cholerae non-이인 것으로 확인되었다.
그리고 V. mimicus 49균주에서는 19균주(38.8%)에서 감수성을 나타내었으며, 31균주(61.2%)에서 1종 이상의 감수성을 나타내었고, 다제내성균은 검출되지 않는 것으로 나타났다.
6%를 나타내었다. 다제내성 정도는 단일내성이 차지하는 비율이 47.5%로 가장 높았으며, 2제 내성이 22.2%, 3제 내성이 13.3%, 4제 내성이 4.4%, 5제 내성이 2.1%의 순이었다. V.
있다. 본 연구결과에 의하면 분리한 기수지역의 특성에 따라서 항생제내성패턴에 차이가 나타났으며 특히 인가가 밀집하여 있는 마을 오수로부터 유입되는 지역에서 채취한 시료에서 높은 내성율을 나타내었다. 따라서 다양한 내성인자를 보유한 세균들이 하천이나 마을 하수를 통하여 육지로부터 유입되어 해양환경에 존재하는 이종 또는 동종 세균으로 plasmid, transposon, integron 등과 같은 이동성 인자 (mobile element)의 수평 적전이(horizontal transfer)를 통하여 내성유전자가 전이될 수 있기 때문에 항생제 내성인자의 해양환경으로의 유입은 육상에서 근원적으로 차단되어져야 할 것으로 생각된다.
, 1984; Chow아lury et al, 1989). 본 연구결과에서도 V. par사心emo顷icus의 경우 지역적인 차이없이 전 조사지점에서 검줄된 반면, V. cholerae non-Ole 약 40%이상이, 그리고 V. mimicus는 분리균주의 100%가 생활하수와 자연하천이 합쳐진 생활기수역인 둔덕천에서 분리되었다.
, 1989). 본 연구에서 분리동정된 V. parahaemolyticus 177균주에 대해서도 식중독을 유발시키는 독소 유전자인 내 열성 용혈독 (TDH) 및 그 유사독소 (TRH) 유무시험을 실시하여 병원성 유무를 확인해 본 결과 둔덕천 1개소를 제외하고는 내열성 용혈독소를 생산하는 균주가 검출된 지역은 없었다. 둔덕천에서는 2008년 8월에 분리된 30균주 중 13균주에서 내열성 용혈독소를 생산하는 것으로 확인되었다.
9%를 나타내었다. 본 연구에서 분리된 V. cholerae non-Ol 균주에서는 AM에 대한 내성율이 V. parahaemolyticus비하여 훨씬 낮았는데, 이는 Sciortino et al. (1996)이 전 세계에서 식중독을 일으킨 V. cholerae non-Ol 112균주를 대상으로 23종의 항균제에 대한 감수성시험을 실시한 결과 AM에서 12.6%로 가장 높은 내성을 나타내었다는 보고와 유사하였다. 그러나 멕시코에서 사람들에게 식수용으로 공급되기 전 단계에서의 다양한 원수에서 분리한 V.
분리된 V. parahaemolyticus 177균주에서는 15종의 항균제에 대하여 19균주 (10.7%)에서만 감수성을 나타내었고, 146균주 (82.4%)에서 최소 1종 이상, 그리고 12균주 (6.7%)에서는 다제내성을 나타내었다. 이는 Son et al.
지 역별 검출분포를 살펴보면 V. parahaemolyticus의 경우 지역적인 차이 없이 전 조사지점에서 검출되었으나, V. cholerae non-Ol와 V. wiitnicns는 생활기수역인 둔덕천에서 주로 분리되었다(Table 1). 둔덕천은 한산.
후속연구
0%로 나타났다. V. mimicus 분리균주는 모두 둔덕전에서 분리되었는데, 단일내성 중 RA에 대한 내성율이 55.1%로 모든 분리균주 중에서 가장 높게 나타난 것에 대해서는 K mimicus균의 본질적 인 내성인지, 아니면 분리원인 둔덕천으로 유입되는 하천수에 의한 영향인지는 향후 연구가 보완되어져야 할 것으로 생각된다.
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