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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 우리나라 주요 연안 산 패류(굴, 바지락)을 대상으로 식중독 원인균인 V. parahaemolyticus 에 대한 오염실태 파악을 위하여 2011년 7월부터 11월까지 남해안 및 서해안 패류양식장을 대상으로 V. parahaemolyticus의 분포를 조사를 하였다. 또한 비브리오균의 항균제 내성패턴 연구의 기초자료로 활용하고자 분리된 균에 대한 항균제 내성 특성에 대해서 검토하였다.
- parahaemolyticus의 분포를 조사를 하였다. 또한 비브리오균의 항균제 내성패턴 연구의 기초자료로 활용하고자 분리된 균에 대한 항균제 내성 특성에 대해서 검토하였다.
제안 방법
- 각 희석단계 별로 alkaline peptone water (pH 8.5±0.2, 2% NaCl 함유)가 들어 있는 3개의 시험관에 접종하고 35±0.5℃에서 18-24시간 배양하였다.
- , 2005)에 준하여 3 tube MPN법으로 정량분석을 실시하였다. 각각 8개 채취지점에서 채취한 굴과 바지락 시료는 채취지점 별로 12개체 이상을 1회 시험에 사용하였으며, 패각을 제거한 패육과 패액 200 g에 phosphate buffered saline (PBS: 140 mM NaCl, 5 mM anhydrous Na2HPO4, and 1.5 mM KH2PO4 pH 7.4)을 2배 비율로 첨가하여 균질화 하였다. 그리고 80 mL의 PBS에 균질액 20 g을 첨가하여 10배 희석액을 만들어 시료로 하였다.
- 동정 시험에는 내염성 시험, 42℃ 발육시험, ONPG (O-nitrophenylβ-D-galacto-pyranoside)시험 등 생화학시험이 이용되었으며 VITEK system (BioMerieux Vitek, France)으로 확정하였다.
- 시험에 사용된 시료는 굴과 바지락이 각각 40개였다. 시료 채취 시 해수의 수온과 염분은 YSI 556 multiprobe system (Yellow Springs, YSI Life Science, OH, USA)을 사용하여 현장에서 측정하였다.
- 시험균주를 Tryptic Soy Broth (Difco, USA) 10 mL에 접종하여 37℃, 18-24시간 배양한 다음 10분간 heating block (EYELA, MG-1200, Japan)에서 가열한 후 균액 5 μL, deoxynucleoside triphosphate mixture (1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP, 1 mM dGTP) 2μL, 10×PCR 용액 5μL, primer (100 pmol/μL) 1 μL, Taq polymerase 1.25 U를 혼합한 후, 총 부피를 50 μL로 조정하고 Thermal Cycle (Takara, Japan)로 94℃에서 60초, 60℃에서 60초, 72℃에서 60초의 반응을 35회 반복하여 PCR을 실시하였다.
- 배양한 후 Thiosulfate Citrate Bile Salt Agar (TCBS agar, Difco)에 획선 도말하여, 35℃에서 18-24시간 배양하였다. 전형적인 청록색 집락을 도말하여 Triple Sugar Iron Agar (Difco)에 접종하고 35℃에서 24시간 배양한 후, 전형적인 반응을 나타내는 균주를 대상으로 동정시험을 실시하였다. 동정 시험에는 내염성 시험, 42℃ 발육시험, ONPG (O-nitrophenylβ-D-galacto-pyranoside)시험 등 생화학시험이 이용되었으며 VITEK system (BioMerieux Vitek, France)으로 확정하였다.
- 시험 항균제는 Amikacin (30μg), Ampicillin (10 μg), Amoxicillin/clavulanic acid (30 μg), Cefepime (30 μg), Cefotaxime (30 μg), Chloramphenicol (5μg), Ciprofloxacin (5 μg), Erythromycin (5 μg), Gentamycin (10 μg), Nalidixic acid (30 μg), Rifampin (5 μg), Streptomycin (10 μg), Sulfamethoxazole/trimethoprim (25 μg), Tetracycline (5 μg), Ttrimethoprim (5 μg) 등 15종(BBL, USA)을 사용하였다. 항균제 디스크를 고착시킨 Muller Hinton Agar 평판은 35℃, 16-18시간 배양한 다음 균의 증식 저해대(inhibition zone)의 크기를 caliper로 측정하여 감수성 유무를 판별하였으며, 감수성 결과의 정도 관리를 위하여 Escherichia coli ATCC 25922를 대조 균주로 사용하여 각 항균제 디스크에 대한 역가를 확인하였다.
대상 데이터
- 2011년 7월부터 11월까지 남해안 및 서해안 패류양식장에서 채취한 굴 40개 및 바지락 40개 총 80개 시료를 대상으로 V. parahaemolyticus 오염실태를 조사한 결과를 Table 1에 나타내었다. 조사 당시 수온의 범위는 16.
- V. parahaemolyticus 분리를 위하여 우리나라 패류의 주 생산지인 남해안(통영·거제) 및 서해안(곰소만) 패류 양식장에서 각각 굴(Crassostrea gigas)과 바지락(Venerupis philippinarum)을 2011년 7월부터 11월까지 매월 채취하여 시료로 하였다.
- 시험 항균제는 Amikacin (30μg), Ampicillin (10 μg), Amoxicillin/clavulanic acid (30 μg), Cefepime (30 μg), Cefotaxime (30 μg), Chloramphenicol (5μg), Ciprofloxacin (5 μg), Erythromycin (5 μg), Gentamycin (10 μg), Nalidixic acid (30 μg), Rifampin (5 μg), Streptomycin (10 μg), Sulfamethoxazole/trimethoprim (25 μg), Tetracycline (5 μg), Ttrimethoprim (5 μg) 등 15종(BBL, USA)을 사용하였다.
- 패류 시료는 멸균된 용기에 채취한 후 10℃ 이하로 유지하면서 실험실로 운반하여 실험에 사용하였다. 시험에 사용된 시료는 굴과 바지락이 각각 40개였다. 시료 채취 시 해수의 수온과 염분은 YSI 556 multiprobe system (Yellow Springs, YSI Life Science, OH, USA)을 사용하여 현장에서 측정하였다.
- 그리고 80 mL의 PBS에 균질액 20 g을 첨가하여 10배 희석액을 만들어 시료로 하였다. 희석액을 이용하여 100배, 1,000배 등 단계별 희석용액을 만들어 사용하였다. 각 희석단계 별로 alkaline peptone water (pH 8.
이론/모형
- V. parahaemolyticus 는 Bacteriological Analytical Manual (Elliot et al., 2005)에 준하여 3 tube MPN법으로 정량분석을 실시하였다. 각각 8개 채취지점에서 채취한 굴과 바지락 시료는 채취지점 별로 12개체 이상을 1회 시험에 사용하였으며, 패각을 제거한 패육과 패액 200 g에 phosphate buffered saline (PBS: 140 mM NaCl, 5 mM anhydrous Na2HPO4, and 1.
- 동정된 V. parahaemolyticus 균주를 대상으로 식중독을 유발시키는 독소 유전자인 tdh, trh 유전자의 존재유무 확인은 PCR 기법을 이용하였다. 독소 유전자 tdh, trh 검출을 위한 primer는 각각 VPD-1/VPD-2와 VPR-1/VPR-2 (Takara, Japan)를 사용하였다.
- 분리 동정된 각 V. parahaemolyticus 균주의 항균제 감수성은 Acar and Goldstein (1991)의 디스크 확산법을 이용하였으며 감수성 판정은 미국 NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) 기준을 근거로 하였다. 분리된 각 균주를 Muller Hinton Broth (Merck, Germany)에 접종한 후 35℃에서 18-24시간 전 배양한 다음 균 배양액의 농도를 McFarland No.
성능/효과
- 5%의 높은 검출율을 나타내었다. 7월부터 10월까지 모든 시료에서 검출되었으며 11월에도 87.5% (7/8)의 검출율을 나타내어 굴보다 높은 검출율을 나타내었다.
- 80개의 시료 중 68개의 시료에서 V. parahaemolyticus가 검출되어 85%의 높은 검출율을 나타내었으며, 특히 7월에는 모든 시료에서 검출되었다. 비브리오균은 보통 염분농도가 낮은 기수지역에서 검출율이 높다고 알려져 있으나(Annie and Marta, 2012), 굴 양식장이 위치한 남해안에서 7월부터 9월까지 나타난 염분농도 변화는 동 시기 발생한 대량강우로 인한 일시적인 환경변화로 V.
- 굴에서 분리된 V. parahaemolyticus 129균주 중 26균주 (20.2%)가 항균제 15종에 감수성을 나타내었고, 나머지 103균주(79.8%)가 한가지 이상의 항균제에 대하여 내성을 나타내었다. 항균제 별 내성양상에 있어 제 1세대 항균제인 penicillin 계열 ampicillin에 대한 내성균 비율이 79%로 높게 나타내었으며 trimethoprim, streptomysin에 대해서는 각각 3.
- 굴의 V. parahaemolyticus 균수는 총 시료 40개 중 70% (28개 시료)가 <30-100 MPN/100 g의 범위를 나타내었으며, 101-1,000 MPN/100 g의 균수를 나타내는 시료는 30% (12개 시료)였다.
- parahaemolyticus의 8개 조합보다 다소 복잡한 경향을 나타내었다. 그러나 대부분이 1개 항생제에 내성(굴-95균주; 73.6%, 바지락-172균주; 56.0%)을 나타내고 있고, 4가지 이상의 항생제에 대하여 내성을 나타내는 다제내성(Multiple antibiotic resistance)균은 굴에서 1균주(0.8%), 바지락에서 3균주(1.0%)로 매우 낮게 검출되었다. 뿐만 아니라 대부분이 ampicillin을 포함한 두 세가지 항균제에만 내성을 보여 단순한 내성 경향을 가지고 있었다 (Table 4, Table 5).
- 5%)이였다. 바지락 중 V. parahaemolyticus 균수는 101-1,000 MPN/100 g의 범위가 가장 많았으며, 10,000 MPN/100 g을 초과하여 검출되는 시료도 40개 시료 중 7개에 달하였다. 이중 57% (4개 시료)가 8월에 채취한 것으로 나타나 8월이 가장 많은 V.
- 바지락에서 분리된 V. parahaemolyticus 307균주 중 111균주(36.2%)가 모든 항균제에 감수성을 나타내었고, 나머지 196균주(63.8%)가 한가지 이상의 항균제에 대하여 내성을 나타내었다. 바지락에서 분리된 V.
- parahaemolyticus의 내성패턴을 Table 4와 Table 5에 나타내었다. 바지락에서 분리된 V. parahaemolyticus의 내성패턴이 22개 조합을 나타내어 굴에서 분리한 V. parahaemolyticus의 8개 조합보다 다소 복잡한 경향을 나타내었다. 그러나 대부분이 1개 항생제에 내성(굴-95균주; 73.
- 이상의 결과 패류 중 V. parahaemolyticus는 수온이 상승하는 하절기에 주로 검출되었나 병원성 인자를 보유한 V. parahaemolyticus 는 검출되지 않아 수확 후 온도-시간 관리와 적절한 가공처리를 통하여 위생학적 안전성을 확보할 수 있을 것으로 사료되었다.
- parahaemolyticus 균수는 101-1,000 MPN/100 g의 범위가 가장 많았으며, 10,000 MPN/100 g을 초과하여 검출되는 시료도 40개 시료 중 7개에 달하였다. 이중 57% (4개 시료)가 8월에 채취한 것으로 나타나 8월이 가장 많은 V. parahaemolyticus 식중독 환자가 발생한 것과 시기적으로 일치하는 경향을 보였다. 그러나 V.
- 동정 시험에는 내염성 시험, 42℃ 발육시험, ONPG (O-nitrophenylβ-D-galacto-pyranoside)시험 등 생화학시험이 이용되었으며 VITEK system (BioMerieux Vitek, France)으로 확정하였다. 정량분석의 결과는 최확수표를 이용하여 100 g 당 MPN으로 나타내었다.
- 즉, 패류에서 분리된 V. parahaemolyticus는 ampicillin에 대해서 높은 내성을 나타내며 그 외의 항균제에 대해서는 대부분 감수성을 나타내어 내성패턴은 비교적 단순하였다. Oh et al.
- 8%)가 한가지 이상의 항균제에 대하여 내성을 나타내었다. 항균제 별 내성양상에 있어 제 1세대 항균제인 penicillin 계열 ampicillin에 대한 내성균 비율이 79%로 높게 나타내었으며 trimethoprim, streptomysin에 대해서는 각각 3.1% 및 1.6%의 내성균 비율을 보였다. 그 외의 항균제에 대해서는 내성균 비율이 1%미만으로 낮았다(Table 2).
후속연구
- 서식지가 연안에 위치하고 있으며 여과섭식의 생리적 특성을 가진 패류의 경우는 V. parahaemolyticus와 같은 식중독 원인균의 전달 매개체로서 나아가 해양세균과 육상세균 간 내성인자 전달 매개체로서도 위험 군에 속하는 수산물이기 때문에 생산단계와 수확 후 단계에서 적절한 위생학적 관리가 이루어져야 할 것으로 생각된다.
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