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문제 정의
- Odoriferous materials인 isovaleric acids의 gradual dilution을 제대로 판정할 수 있는 전문가로 정하였다.
- 이전에는 hexachlorophene, tetrachlorosalicylanilide, bithionol, thiram 등과 같은 항균성분을 배합하여 외용으로 비누, 바디워시, 스프레이제재 등을 활용하였으나[10] 자극 및 알레르기 반응, 접촉피부염 등의 부작용이 있어서 최근에는 제한소취 효능이 있는 aluminum chlorohydrate 제제와 항균작용이 있는 triclosan과 trichlorocarbanilide 등이 체취방지제의 주 효능성분으로 사용되고 있다[11]. 본 연구의 목적은 1.0 wt% triclosan과 0.4 wt% 죽염을 함유한 바디워시의 액취 등에 미치는 효과를 평가하기 위함이며 이를 위하여 in vitro 항균 시험 및 무작위 배정, 이중맹검, 교차설계로 진행한 임상적 연구를 실시하였다.
제안 방법
- 1.0 % Triclosan과 0.4 % 죽염을 함유한 바디워시의 액취 등에 미치는 효과에 대한 연구를 위하여 in vitro 항균시험 및 무작위 배정, 이중맹검, 교차설계로 진행한 임상시험에서 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 1주차 시험 후 휴식기간(cross-over period)으로 4일 동안(목 ~ 일요일)의 휴식기를 가진 다음 2주차에는 시험 시작 전(월요일) 사전평가를 위하여 내원한 피시험자를 대상으로 액취 평가와 액와 균수 평가를 위한 샘플을 채취하고 피시험자에게는 1주차에 사용하지 않았던 제품(시험군 제품 ↔ 대조군 제품)을 제공하였으며 1주차와 같은 방법으로 임상시험을 실시하였다(Table 3).
- Baxter[4]의 방법을 응용하여 피시험자의 액취 증상을 액취 강도별로 5 grade로 나누어 실험 전, 후 동일한 임상전문의가 피시험자 상의를 탈의한 상태에서 액와의 정중앙 10 cm 정도 부위에서 직접 냄새를 맡고 Table 2의 냄새강도별 grade에 준하여 등급을 매겨 임상적인 평가를 하는 direct sniff test를 시행하였다.
- 겨드랑이의 미생물 총 균수를 측정하는 방법으로 총 세균 측정용인 easy stamp TPC (Komed, Korea)를 이용하여 액와의 정중앙 부위로부터 easy stamp로 액와 균을 직접 채취하였다. Easy stamp에는 피 시험자 식별코드, 날짜, 시간, 좌/우 표시 등을 기록하였으며 easy stamp의 뚜껑을 열고 겨드랑이의 오목한 부분을 가볍게 눌러 찍는 방법으로 액와 균을 채취하였으며 뚜껑이 잘 닫혀있는지를 확인한 후 37 ℃ 배양기에 넣어 24 h 이상 배양하였다.
- 90으로 감소된 균의 수가 증가하지 않고 유지되는 경향을 보였다. 기간 2(2주 차)에는 충분한 휴식기간(cross-over period)을 거쳐 대조군 제품과 시험군 제품을 바꾸어 시험을 진행하였다. 기간 2를 살펴보면 시험군의 경우 샤워 5 min 후 -436.
- 44로 grade가 감소의 상태를 유지하고 있었다(Table 10). 기간 2에서는 휴식시간(cross-over period)을 거쳐 대조제품과 시험제품을 바꾸어 실험을 하였다. 기간 2를 살펴보면 시험군의 경우는 기간 1과 마찬가지로 샤워 5 min 후, 3 h 후, 9 h 후에 각각 -3.
- 본 임상시험의 일차적 효능 평가변수는 실험군과 대조군의 실험물질 투여 전/후의 액취 균 수의 차이며 독립2 표본 t-test를 통하여 항균 수의 개선이 실험군과 대조군 간에 통계적으로 유의한지 평가하였다. 또한 교차설계법에 합당한 분산분석법을 이용하여 군간 유의한 차이가 있는지 분석하였다.
- 무작위 배정에 의하여 “1군"과 ”2군"으로 나누어진 피시험자에게 시험제품 혹은 대조제품을 각각 제공하고 2일 동안(화 ~ 수요일) 사용하게 하였다.
- Easy stamp에는 피 시험자 식별코드, 날짜, 시간, 좌/우 표시 등을 기록하였으며 easy stamp의 뚜껑을 열고 겨드랑이의 오목한 부분을 가볍게 눌러 찍는 방법으로 액와 균을 채취하였으며 뚜껑이 잘 닫혀있는지를 확인한 후 37 ℃ 배양기에 넣어 24 h 이상 배양하였다. 배양 후 형성된 집락 수 전체를 image analyser (Media Cybernetics, USA)를 이용하여 count하고 scoring scale에 따라서 0 ~ 5점으로 등급을 매겨 판정하였다(Table 4)
- 시험물질의 항균 평가는 실험물질을 일정 농도로 희석한 후 40 µL씩 8 mm paper disc 위에 가하고 clean bench에서 수분을 날려 보낸 후, 준비한 고체 성장배지에 올려놓고 1 ~ 3일 동안 배양하며, paper disk 주변에 생긴 균의 성장억제 영역의 지름을 측정하여 평가하였다.
- 즉 미생물 배지를 이용해 실험물질을 serial dilution하여 96 well plate에 100 µL씩 가하고 전 배양한 균주를 동일한 배지를 이용해 106 cfu/mL의 농도로 조정한 후 실험물질이 들어있는 96 well plate에 100 µL씩 가한다. 실험물질의 항균은 1 ~ 3일 동안 배양한 후 균체 성장에 따른 배양액의 탁도 혹은 alamarBlueⓡ를 첨가에 따른 색상변화(Red: 환원된 상태 - 균 성장, Blue: 환원되지 않은 상태 - 균 비성장)를 통해 판단하였다.
- 액취 평가는 임상시험 전날 측정된 초기 값(base line)과 샤워 3 h 후 및 9 h 후의 액취 grade가 평가 되었다. 초기 값(base line)에 대비한 샤워 3 h, 9 h 후의 액취 grade 변화를 살펴보면, 1주차 기간에서 샤워 3 h 후에는 대조군에서는 -1.
- jeikeium에 있어서 매우 우수한 항균 효과가 있음을 알 수 있었다. 임상시험은 총 2주, 시험일 기준으로 6일에 걸쳐 시행하였고 피시험자 50명을 무작위 배정, 이중맹검, 교차설계로 평가하였다. 시험기간 동안 홍반, 구진, 부종, 소양 등의 이상반응 증상은 피시험자 모두에서 나타나지 않았다.
- 임상시험은 무작위 배정, 이중맹검, 교차설계에 의하여 실시되었다. 임상시험은 총 2주, 초기 값(base line)평가를 위한 사전 평가 당일 포함한 시험일 기준으로 1주당 3일씩 총 6일에 걸쳐 실시하였다. 피시험자에게는 1주 당 2일씩, 2주에 걸쳐 총 4일 동안, 1일 1회 바디워시(시험군, 대조군)를 사용하게 하였으며 초기 값(base line) 또는 바디워시 사용 전 대비 바디워시 사용에 따른 액취 정도 및 액와 균수를 평가하였다.
- 무작위 배정에 의하여 “1군"과 ”2군"으로 나누어진 피시험자에게 시험제품 혹은 대조제품을 각각 제공하고 2일 동안(화 ~ 수요일) 사용하게 하였다. 제품 사용은 1일 1회, 아침 6 ~ 7시경에 실시하도록 하였으며 제품 사용 전후의 액와균 샘플링은 피시험자들을 미리 교육하여 직접실시 하도록 하였고 사용 약 3 h 이후인 오전 10시경과 약 9 h 이후인 오후 4시경에는 내원시켜 액취 평가 및 액와 균 샘플링을 직접 실시하였다. 1주차 시험 후 휴식기간(cross-over period)으로 4일 동안(목 ~ 일요일)의 휴식기를 가진 다음 2주차에는 시험 시작 전(월요일) 사전평가를 위하여 내원한 피시험자를 대상으로 액취 평가와 액와 균수 평가를 위한 샘플을 채취하고 피시험자에게는 1주차에 사용하지 않았던 제품(시험군 제품 ↔ 대조군 제품)을 제공하였으며 1주차와 같은 방법으로 임상시험을 실시하였다(Table 3).
- 즉 미생물 배지를 이용해 실험물질을 serial dilution하여 96 well plate에 100 µL씩 가하고 전 배양한 균주를 동일한 배지를 이용해 106 cfu/mL의 농도로 조정한 후 실험물질이 들어있는 96 well plate에 100 µL씩 가한다.
- 피시험자는 대조군 → 시험군 순서군(이하 1군), 시험군 → 대조군 순서군(이하 2군)으로 무작위 배정되었다.
- 임상시험은 총 2주, 초기 값(base line)평가를 위한 사전 평가 당일 포함한 시험일 기준으로 1주당 3일씩 총 6일에 걸쳐 실시하였다. 피시험자에게는 1주 당 2일씩, 2주에 걸쳐 총 4일 동안, 1일 1회 바디워시(시험군, 대조군)를 사용하게 하였으며 초기 값(base line) 또는 바디워시 사용 전 대비 바디워시 사용에 따른 액취 정도 및 액와 균수를 평가하였다.
- 피시험자의 평소 생활환경에 따른 액취 및 액와 균수 수준을 초기 값(base line)으로 설정하기 위하여 임상시험 시행 전날(월요일) 저녁에 피시험자를 내원시켜 액취 평가 및 액와 균수 평가를 위한 액와 균 샘플을 채취하였다. 단 피시험자들은 시험 시작 전 내원하는 당일에는 반드시 샤워하지 않고 내원하게 하였다.
대상 데이터
- 본 인체시험의 일차적인 목적은 시험제품의 투여로 인하여 액취에서 임상적 증상 개선에 효과가 우월하다는 것을 증명하고자 하였으며 이를 입증하기에 필요한 최소 피시험자 수를 결정하기 위하여 전 임상시험 결과를 통한 예측치를 활용하였으며 유의수준 5 % 하에서 약 80%의 검정력을 달성하기 위한 피험자의 수로서 시험군 및 대조군 각각 최소 22명으로 총 44명이었으나 탈락(drop-out)을 10 %를 고려하여 군당 25명씩 50명을 설정하였다.
-
1. 피시험자 선정
선정대상은 20세 이상 70세 이하의 건강한 정상 성인남녀로 피시험자 제외기준에 포함되지 않는 사람으로 액취를 호소하며 냄새강도별 grade[4-6,14]를 0 ~ 5점으로 하였을 때 초기강도가 가능한 3점 이상인 경우와 무향, 항생 및 항균기능이 없는 비누로 매일 세정하는 것을 제외하고 제한소취제(deodorant)는 사용하지 않는 경우와 실험에 앞서 시험의 목적, 내용 등에 대해 충분히 설명을 듣고 자발적으로 동의서에 서명하고 지원한 경우와 실험기간 동안 추적관찰이 가능한 피시험자를 대상으로 정하였다(Table 2)
. - 시험군 제품(active)은 주성분인 1.0 wt% triclosan과 0.4 wt% 죽염을 함유하였고, 대조군 제품(vehicle)은 주성분을 함유하지 않았다(Table 1).
- 시험균주로는 액취 및 무좀의 원인균으로 알려진[11,12,24] Corynebacterium xerosis (KCTC 9105, c. xerosis)과 Corynebacterium glutamicum (ATCC 13032, c. glutamicum) Corynebacterium jeikeium (KCTC 43734, c. jeikeium)을 활용하였다. 또한 대한민국 식품의약품안전청에서 발행한 자료[13]에서도 Corynebacterium 속 균주를 액취방지제 효능평가 위한 표준균주로 사용함을 보고한 바 있다.
데이터처리
- 본 임상시험의 일차적 효능 평가변수는 실험군과 대조군의 실험물질 투여 전/후의 액취 균 수의 차이며 독립2 표본 t-test를 통하여 항균 수의 개선이 실험군과 대조군 간에 통계적으로 유의한지 평가하였다. 또한 교차설계법에 합당한 분산분석법을 이용하여 군간 유의한 차이가 있는지 분석하였다.
- 28로 균수가 증가하였다. 샤워 후 시간(5 min, 3 h, 9 h)에 따라 액와 균수 감소가 시험군, 대조군별로 차이가 있는지를 독립 2 표본 t-test를 통하여 분석하였다. 분석결과 샤워 5 min, 기간 1과 기간 2의 평균이 대조군 -183.
이론/모형
- Minimum inhibition concentration (MIC) 측정은 alamarBlueⓡ (Biosource, USA)를 이용한 MIC 측정법(Drug Research, 1996)을 사용하였다. 즉 미생물 배지를 이용해 실험물질을 serial dilution하여 96 well plate에 100 µL씩 가하고 전 배양한 균주를 동일한 배지를 이용해 106 cfu/mL의 농도로 조정한 후 실험물질이 들어있는 96 well plate에 100 µL씩 가한다.
성능/효과
- 1) 1.0 wt% Triclosan과 0.4 wt% 죽염을 함유한 바디워시는 Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium xerosis, Corynebacterium jeikeium를 균주로 한 in vitro 항균 실험(MIC 및 Clear zone 측정)에서 모두 우수한 항균 효과가 있었다.
- 1군 즉, 대조군 → 시험군의 순서로 실험을 한 군에서는 대조제품이 182.61의 균수의 증가, 시험제품이 -376.61로 균수의 감소를 나타냈고, 2군 즉, 시험군 → 대조군 순서로 실험을 한 군은 -238.9에서 111.28로 균수가 증가하였다.
- 36의 감소를 나타내었다(Table 6). 1주차와 2주차를 통합하여 분석한 결과, 샤워 3 h 후에는 대조군 -1.12의 감소, 시험군 -2.73의 감소로 통계적으로 유의하게 시험군에서 액취 grade의 감소가 이루어졌다. 샤워 9 h 후에는 대조군에서 -0.
- 2) 1.0 wt% Triclosan과 0.4 wt% 죽염을 함유한 바디워시는 액취를 전반적으로 유의성 있게 감소시켰고 그 효과는 최소 9 h 동안 지속되었다.
- 3) 1.0 wt% Triclosan과 0.4 wt% 죽염을 함유한 바디워시는 액와 균수를 유의성 있게 감소시켰고 그 효과는 최소 9 h 동안 지속되었다.
- 4) 임상시험 기간 동안 피시험자 전체에서 이상반응 증상은 나타나지 않았다.
- 5) 결론적으로 1.0 wt% triclosan과 0.4 wt% 죽염을 함유한 바디워시는 액취에 대한 감소효과와 피부 안전성이 우수하였다.
- 46의 감소를 유지하여 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 9 h 후 대조군 0.47의 증가, 시험군 -1.79의 감소로 대조군과 유의한 차이가 있음을 보였다(Table 11).
- C. xerosis (KCTC 9105)와 C. glutamicum (ATCC 13032), C. jeikeium (KCTC 43734)에 대한 MIC 및 clear zone 평가결과, 주성분을 함유한 바디워시(시험군)가 대조군에 비하여 매우 높은 항균효과가 있었다(Table 5).
- 박테리아 외에 아포크린 땀샘의 수와 크기도 액취를 일으키는 요인으로 생각된다[6]. 결론적으로 액취의 원인은 아포크린 땀샘에서 분비되는 땀 자체가 원인은 아니고 피부나 겨드랑이에서 분포하는 세균이 땀을 분해하면서 지방산과 암모니아를 생성하기 때문인 것으로 사료된다. 액취는 임상적으로 진단되는데 그 기준이 다소 주관적이다.
- 61의 감소를 보였다. 반면 대조군의 경우 5 min 후, 3 h 후, 9 h 후의 균수의 감소가 각각 -132.69, -146.17, 111.28로 나타나 시간이 지남에 따라 균수가 급격히 증가함을 알 수 있었다(Table 8). Figure 2는 각 피시험자 군과 기간 사이의 profile plot으로 샤워 후 9 h 후의 균수의 증감을 그래프로 나타내었다.
- 죽염이 구강 내의 미생물에 대해 항균작용과 염증 억제 효과가 있는 것으로 보고되었고[26,27] 또한 죽염을 유효성분으로 한 약학적 조성물이 항균제로 많이 활용되고 있다. 본 연구에서 주성분으로 사용된 triclosan 및 죽염은 C. glutamicum, C. xerosis, C. jeikeium에 있어서 매우 우수한 항균 효과가 있음을 알 수 있었다. 임상시험은 총 2주, 시험일 기준으로 6일에 걸쳐 시행하였고 피시험자 50명을 무작위 배정, 이중맹검, 교차설계로 평가하였다.
- 샤워 후 시간(5 min, 3 h, 9 h)에 따라 액와 균수 감소가 시험군, 대조군별로 차이가 있는지를 독립 2 표본 t-test를 통하여 분석하였다. 분석결과 샤워 5 min, 기간 1과 기간 2의 평균이 대조군 -183.03의 감소, 시험군 -365.57의 감소를 나타냈고 유의확률이 0.0188로 통계적으로 유의한 결과를 나타내었다. 3 h 후는 대조군 -85.
- 61로 증가되었다. 시험군은 샤워 5 min 후에 -294.76로 감소되었고, 3 h 후에는 -279.03, 9 h 후에는 -238.90으로 감소된 균의 수가 증가하지 않고 유지되는 경향을 보였다. 기간 2(2주 차)에는 충분한 휴식기간(cross-over period)을 거쳐 대조군 제품과 시험군 제품을 바꾸어 시험을 진행하였다.
- 이러한 작용은 triclosan과 죽염이 액취 균에 대하여 우수한 항균작용을 갖는다는 것으로 판단 할 수 있으며 더욱이 피부에 잘 흡착되어 장시간 항균효과를 나타낸 결과인 것으로 사료된다. 액와 균수 및 grade 평과 결과, 샤워 전에 비해 시험군 및 대조군 모두 샤워 5 min 후에는 모두 액와 균수가 감소되었다가 대조군은 점차적으로 증가되어 샤워 9 h 후에는 오히려 초기 대비 액와 균수가 더 증가된 것으로 평가된 반면, 시험군은 샤워 5 min 후에는 크게 감소되었다가 3 h, 9 h 후에는 5 min 후보다는 증가되었으나 여전히 감소된 상태로 지속되었다. 시간에 따른 액취 grade의 변화 패턴은 액와 균수의 변화 패턴과 거의 동일했다.
- 시험기간 동안 홍반, 구진, 부종, 소양 등의 이상반응 증상은 피시험자 모두에서 나타나지 않았다. 임상 평가에 있어서 시험 시작 전의 초기에 비해 시간 경과 후의 액취의 변화를 보면 시험군과 대조군 모두 샤워 후 3 h에는 액취 정도가 모두 감소된 것으로 평가되어 일반적인 샤워에 의해서도 액취가 감소되는 것을 확인 할 수 있었다. 하지만 시험군은 샤워 후 9 h 까지도 액취 정도가 크게 증가하지는 못하였으나 대조군은 샤워 9 h 이후에는 거의 초기 상태까지 증가하였다.
- 하지만 시험군은 샤워 후 9 h 까지도 액취 정도가 크게 증가하지는 못하였으나 대조군은 샤워 9 h 이후에는 거의 초기 상태까지 증가하였다. 종합적으로 액취는 샤워에 의하여 시험군과 대조군 모두 감소되나, 대조군의 경우, 시간이 경과 될수록 다시 액취가 초기 상태(base line) 까지 증가된 반면, 시험군은 액취 감소효과가 우수할 뿐만 아니라 감소된 상태가 최소 9 h 까지 지속되었다. 이러한 작용은 triclosan과 죽염이 액취 균에 대하여 우수한 항균작용을 갖는다는 것으로 판단 할 수 있으며 더욱이 피부에 잘 흡착되어 장시간 항균효과를 나타낸 결과인 것으로 사료된다.
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