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문제 정의
- Agmbacterium을 이용한 페레니얼 라이그라스를 형질전환 함에 있어 최적 조건을 조사하기 위하여 Agrobacteri"m 의 감염효율에 가장 큰 요인으로 작용하는 것으로 알려져 있는acetosyringone (AS)의 첨가에 따른 효과를 조사하였다
제안 방법
- 페레니얼 라이그라스 성숙종자 유래의 캘러스를 pCAMBIA 3301을 가지는 Agrobacterium EHA105를 이용하여 감염 시킨 후 형질전환을 실시하였다. Agrobacterium 을 이용한 형질전환에 있어서 중요한 인자로 작용하는 몇 가지 요인에 대한 형질전환 효율 을 GUS 유전자의 발현정도로 조사하였다. Agrobacterium 감염시에 현탁배지와 공동배양 배지에 100 jjM의 acetosyringone (AS)을 첨가해 주었을 때 형질전환 효율이 증가되었으며, 공 동배양기간을 5일까지 증가시켰을 때 형질전환 효율이 증가되었다.
- 준하여 PCR 분석을 실시하였다.pCAMBIA 3301 벡터의 GUS 유전자를 sense primer 5'-AATTGA TCAGCGTTGGTGG-3, 와 anti-sense primer 5'-GGTGTAGAGCATTACG- CTGC-3을 사용하여 증폭시킨 후 1% agarosegel 전기영동으로 유전자의 도입여부를 확인하였다. 또한, PCR로 확인 된 형질전환체의 유전자 발현 양상을 확인하기 위하여 형질전환 페레니얼 라이그라스 식물체의 잎으로부터 total RNA를 분리한 후 Lee 등(2007)의 방법에 준하여 Northern blot 분석을 실시하였다.
- 성숙종자로부터 유도된 캘러스를 Agrobac- terium을 현탁시킨 접종배지에 1시간 침지 시켜 감염시킨 다음 여분의 AgrobactHium을 멸균된 filter paper 위에서 제거하였다. 감염시킨 캘러스를 공동배양배지 (MS medium, 2 mg/L 2, 4-D, 100 pM AS, 500 mg/L L-proline, 30 g/L sucrose,5 g/L gelite)에 계대한 후 25℃에서 5일간 암상태로 공동배양 하였다.
- 공동배양이 끝난 캘러스는 선발배지는 N6 (Chu 등, 1975) 배지를 기본으로 하는 선발배지 (N6 medium, 250 mg/L cefotaxime, 5 mg/L phosphinothricin (PPT), 1 mg/L 2, 4-D, 3 mg/L BA, 1 g/L casein hydrolysate, 500 mg/L L-proline, 30 g/L sucrose, 5 g/L gelrite)에서 3주간 배양하여 PPT 내성을 보이는 캘러스만을 선발하여 다시 10 mg/L PPT가 첨가된 선발배지에 옮겨 4주간 배양하여 살아남은 식물체는 10mg/J PPT가 첨가된 Rooting 게]지 (1/2 MS medium, 30 g/L sucrose, 2 g/L gelrite)에 옮겨준 후 4주간 배양하여 정상적으로 뿌리가 발육되고 살아남는 개체만을 선발하여 pot로 이식하여 온실에서 재배하였다.
- 성숙 종자의 종피를 제거하기 위해 50% sulfuric acid(H2SO4)에서 30분간 처리한 다음 70% ethanol 에 5분간 살균한 후, 10% (v/v) sodium hypochlorite 용액에서 30분간 교반하면서 표면살균 하였다. 살균한 종자를 MS (Murashige와 Skoog, 1962) 배지를 기본으로 하는 캘러스 유도배지 (MS medium, 9 mg/L 2, 4-D, 0.1 mg/L BA, 500 mg/L L-proline, 30 g/L sucrose, 3 g/Lgelrite)에 치상하여 8주간 배양하여, 형성된 배 발생 캘러스를 Agrobacterium 감염에 이용하였다.
- 성숙 종자의 종피를 제거하기 위해 50% sulfuric acid(H2SO4)에서 30분간 처리한 다음 70% ethanol 에 5분간 살균한 후, 10% (v/v) sodium hypochlorite 용액에서 30분간 교반하면서 표면살균 하였다. 살균한 종자를 MS (Murashige와 Skoog, 1962) 배지를 기본으로 하는 캘러스 유도배지 (MS medium, 9 mg/L 2, 4-D, 0.
- GUS 활성염색은 Jefferson (1987)의 방법에준하여 실시하였다. 캘러스에 있어서 GUS 발현조사는 5일간 공동 배양한 캘러스를 이용하였으며, 재분화된 형질전환 식물체의 잎을 이용한 GUS 활성염색은 선발배지에서 재분화된 식물체의 잎 조직을 재료로 하여 GUS 활성염색을 실시한 후 형질전환 여부를 판단하였다.
- 신품종 페레니얼 라이그라스를 개발할 목적으로 Agrobacterium을 이용한 효율적인 형질전 환 체계를 확립하였다. 페레니얼 라이그라스 성숙종자 유래의 캘러스를 pCAMBIA 3301을 가지는 Agrobacterium EHA105를 이용하여 감염 시킨 후 형질전환을 실시하였다. Agrobacterium 을 이용한 형질전환에 있어서 중요한 인자로 작용하는 몇 가지 요인에 대한 형질전환 효율 을 GUS 유전자의 발현정도로 조사하였다.
- 형질전환 식물체의 genome 내에 삽입된 pCAMBIA3301 발현벡터가 가지는 GUS 유전자가 도입되었는지를 확인하기 위해 PPT가 첨가된 배지에서 선발된 형질전환 식물체의 잎으로부터 genomic DNA를 분리하여 PCR 분석을실시하였다. 그 결과 비형질전환 식물체에서는 증폭된 단편을 확인할 수 없었으나 형질전환 식물체에서는 약 0.
대상 데이터
- 형질전환을 위한 식물재료로는 페레니얼 라이그라스의 Accent, 품종을 사용하였다. 성숙 종자의 종피를 제거하기 위해 50% sulfuric acid(H2SO4)에서 30분간 처리한 다음 70% ethanol 에 5분간 살균한 후, 10% (v/v) sodium hypochlorite 용액에서 30분간 교반하면서 표면살균 하였다.
이론/모형
- GUS 활성염색은 Jefferson (1987)의 방법에준하여 실시하였다. 캘러스에 있어서 GUS 발현조사는 5일간 공동 배양한 캘러스를 이용하였으며, 재분화된 형질전환 식물체의 잎을 이용한 GUS 활성염색은 선발배지에서 재분화된 식물체의 잎 조직을 재료로 하여 GUS 활성염색을 실시한 후 형질전환 여부를 판단하였다.
- pCAMBIA 3301 벡터의 GUS 유전자를 sense primer 5'-AATTGA TCAGCGTTGGTGG-3, 와 anti-sense primer 5'-GGTGTAGAGCATTACG- CTGC-3을 사용하여 증폭시킨 후 1% agarosegel 전기영동으로 유전자의 도입여부를 확인하였다. 또한, PCR로 확인 된 형질전환체의 유전자 발현 양상을 확인하기 위하여 형질전환 페레니얼 라이그라스 식물체의 잎으로부터 total RNA를 분리한 후 Lee 등(2007)의 방법에 준하여 Northern blot 분석을 실시하였다.
- 온실에서 재배한 형질전환 식물체로부터genomic DNA를 분리한 후, Lee 등(2006)의 방법에 준하여 PCR 분석을 실시하였다.pCAMBIA 3301 벡터의 GUS 유전자를 sense primer 5'-AATTGA TCAGCGTTGGTGG-3, 와 anti-sense primer 5'-GGTGTAGAGCATTACG- CTGC-3을 사용하여 증폭시킨 후 1% agarosegel 전기영동으로 유전자의 도입여부를 확인하였다.
성능/효과
- Agrobacterium 감염시에 현탁배지와 공동배양 배지에 100 jjM의 acetosyringone (AS)을 첨가해 주었을 때 형질전환 효율이 증가되었으며, 공 동배양기간을 5일까지 증가시켰을 때 형질전환 효율이 증가되었다. 10mg/L의 phosphinothricin (PPT)이 첨가된 선발배지에서 살아남은 캘러스 로부터 정상적인 식물체가 재분화 되었으며 이들 형질전환체를 GUS 염색과 PCR 분석을 실 시하여 본 결과 발현벡터의 GUS 유전자가 형 질전환 식물체의 genome에 성공적으로 도입되 었음을 확인할 수 있었다 또한 RNA 수준에서 도입 유전자의 발현을 확인한 결과 도입 유전 자가 안정적으로 발현하는 것을 확인하였다.
- AS 100 |iM 첨가구에서 감염시킨 전체 캘러스 중에서 GUS 활성염색이 되는 캘러스가 33.3%로 가장 높은 형질전환 효율을 확인할 수 있었다. 이보다 높은 200 및 300 gM AS 첨가구에서는 무첨가구에 비해 높은 형질전환 효율을 보였으나 100 μM 이상의 농도에서는 AS 첨가농도가 증가될수록 형질전환 효율이 감소하는 경향을 보였다.
- Agrobacterium 을 이용한 형질전환에 있어서 중요한 인자로 작용하는 몇 가지 요인에 대한 형질전환 효율 을 GUS 유전자의 발현정도로 조사하였다. Agrobacterium 감염시에 현탁배지와 공동배양 배지에 100 jjM의 acetosyringone (AS)을 첨가해 주었을 때 형질전환 효율이 증가되었으며, 공 동배양기간을 5일까지 증가시켰을 때 형질전환 효율이 증가되었다. 10mg/L의 phosphinothricin (PPT)이 첨가된 선발배지에서 살아남은 캘러스 로부터 정상적인 식물체가 재분화 되었으며 이들 형질전환체를 GUS 염색과 PCR 분석을 실 시하여 본 결과 발현벡터의 GUS 유전자가 형 질전환 식물체의 genome에 성공적으로 도입되 었음을 확인할 수 있었다 또한 RNA 수준에서 도입 유전자의 발현을 확인한 결과 도입 유전 자가 안정적으로 발현하는 것을 확인하였다.
- 2와 같다. Agrobacterium으로 감염시킨 다음 1일간 공동배양한 후 캘러스의 GUS 염색 정도로 관찰한 형질전환효율은 18.3%였으며, 3 일간 공동배양한 경우 31.7%의 효율을, 5일간 공동배양 했을 때는 41.7%로 가장 높은 형질전환 효율을 나타내었다. 그러나 7일간 공동배양한 경우는 20%의 효율을 나타내었다.
- 배지에서 선발된 형질전환 식물체의 잎으로부터 genomic DNA를 분리하여 PCR 분석을실시하였다. 그 결과 비형질전환 식물체에서는 증폭된 단편을 확인할 수 없었으나 형질전환 식물체에서는 약 0.4 kb의 PCR 증폭산물이 관찰되었다 (Fig. 3).
- 2B). 또한 10mg/J의 PPT가 첨가된 선발 배지에서 선발되어 재분화된 형질전환 식물체를 GUSexpression in seed-derived callus of perennial유전자의 발현 여부를 활성염색으로 조사하여본 결과 식물체의 거의 모든 조직부위에서 청색으로 염색되어 dgrobacferium법에 의해 성공적으로 형질전환 되었음을 확인할 수 있었다(Fig. 2C, D). 이렇게 PPT 내성을 가지는 식물체는 pot로 이식하여 온실에서 재배하였다(Fig.
- 또한, Northern 분석을 통해 도입유전자의 발현을 조사한 결과 (Fig. 4) 비형질전환 식물체에서는 도입 유전자의 발현을 확인할 수 없었으나, 형질전환 식물체에서는 개체간 발현양의차이는 있으나 도입한 GUS 유전자가 안정적으로 발현되고 있음을 관찰하였다.
- 3%로 가장 높은 형질전환 효율을 확인할 수 있었다. 이보다 높은 200 및 300 gM AS 첨가구에서는 무첨가구에 비해 높은 형질전환 효율을 보였으나 100 μM 이상의 농도에서는 AS 첨가농도가 증가될수록 형질전환 효율이 감소하는 경향을 보였다.
- 그러나 7일간 공동배양한 경우는 20%의 효율을 나타내었다. 즉, 공동배양 기간이 5일째 까지는 기간이 길어질수록 형질전환 효율이 증가하였으나, 그 이상의 기간에서는 오히려 감소하는 경향을 나타내었다. 공동배양기간이 7일 이상인 경우에는 캘러스의 갈변현상이 심하여 괴사되는 세포의 비율이 높았으며 이로 인하여 GUS 활성염색정도가 저하된 것으로 사료되었다.
- 페레니얼 라이그라스 성숙종자로부터 유래된 캘러스 (Fig. 2A)를 Agrobactering으로 감염 시켜 공 동배 양한 후 형 질전환 여부를 GUS (P- glucuronidase) 활성염색으로 확인한 결과 형질 전환된 캘러스는 푸른색으로 염색되었다 (Fig. 2B). 또한 10mg/J의 PPT가 첨가된 선발 배지에서 선발되어 재분화된 형질전환 식물체를 GUSexpression in seed-derived callus of perennial유전자의 발현 여부를 활성염색으로 조사하여본 결과 식물체의 거의 모든 조직부위에서 청색으로 염색되어 dgrobacferium법에 의해 성공적으로 형질전환 되었음을 확인할 수 있었다(Fig.
후속연구
- 또한 최근에는 유용이 차대사 산물을 생산하는 고부가가치 신 기능성 작물의 창출로 식품의약분야, 및 백신 개발에도 도입이 되고 있다. 따라서 사료작물의 유용 유전자를 육종소재로 이용하여 기존의 전통적인 육종방법과 병행연구를 수행하면 사료작물의 신품종 개발연한을 앞당길 수 있을 것이다.
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