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문제 정의
- 역치 진단은 확정 진단(definite diagnosis)에, 역치하 진단은 유망 진단(probable diagnosis)에 해당한다. 본 연구에서는 이를 토대로 하여 ADHD 아동에 대한 진단, 아동의 아형(subtype) 분류, 공존 질환 여부 등을 조사하였다.
- 이러한 제한점이 있음에도 불구하고 본 연구는 그동안 한국 ADHD 아동에서 그다지 많은 보고가 없었던 세로토닌계 중 5-HTTLPR 유전자 다형성에 대해 환자대조군 연구 및 가족 기반 연합 연구를 실시하였다는 점에서 중요한 의미를 지닌다.
- 이에 이 연구에서는 환자-대조군 연합분석 및 가족기반 TDT를 이용하여 5-HTT 유전자 다형성과 한국인 ADHD 환자와의 연관성을 알아보고, ADHD 환자군의 신경심리학적, 기질적, 임상적 특성에 따른 유전자형 혹은 대립유전자의 빈도 분석을 실시하고자 하였다.
- 한편 이번 연구에서는 환자군의 임상척도 및 신경심리검사 결과 등이 5-HTTLPR 유전자 다형성에 따라 어떤 차이가 있는지도 조사하였다. 몇몇 선행연구에서 특정 유전형에 따른 ADHD의 주의력결핍 점수 혹은 과잉 행동-충동성 점수 등을 거론하긴 하였지만23)40)42) 이번 연구처럼 IQ, CPT, DBDS, CBCL, JTCI 등을 종합적으로 조사한 연구는 거의 없었다.
- 한편 환자군 중 ADHD의 특정 아형군과 대조군간에 유전형 분포의 유의한 차이가 나타나는지를 조사하였다. 특정 아형군으로 1) 혼합형 단독군(N=115), 2) 특정불능형을 제외한 ADHD군(N=162)을 선정하고, 이를 각각 대조군과 비교 분석하였다.
제안 방법
- 한편 환자군 중 ADHD의 특정 아형군과 대조군간에 유전형 분포의 유의한 차이가 나타나는지를 조사하였다. 특정 아형군으로 1) 혼합형 단독군(N=115), 2) 특정불능형을 제외한 ADHD군(N=162)을 선정하고, 이를 각각 대조군과 비교 분석하였다. 이 경우 혼합형 단독군과 대조군 사이에는 유전자형 빈도(χ2=.
- ADHD 환자군에서 임상척도 및 신경심리검사를 모두 완수한 환자들을 l/l, l/s, s/s의 3가지 유전형에 따라 세군으로 나눈 뒤 이 세 군간의 임상척도 점수 및 신경심리검사 점수를 비교하였다. 이 경우 JTCI의 자극 추구성(F=3.
- Ha 등의 연구에서 부모 작성용은 7개 소척도 모두에서 내적 일치도가 0.50~ 0.80사이였던 것에 비해 아동 작성용의 경우 지속성 소척도의 내적 일치도가 매우 낮았던 점(α=0.09)을 고려하여, 본 연구에서는 부모 작성용 JTCI만을 선택하였고 기질의 4개 소척도 점수 및 성격의 3개 소척도 점수 각각을 이용하였다.
- 079) 각각에서 Hardy-Weinberg Equilibrium이 유지되었다. 각 유전자별로 전체 ADHD가족(113trio), ADHD 혼합형 환자 가족(67trio), ADHD 주의력결핍형 환자 가족(23trio), 특정불능형을 제외한 ADHD 환자 가족(98trio) 각각에 대해 TDT 분석을 시행하였다. 그러나 ADHD 과잉행동-충동형 가족은 대상군 수가 너무 적어서 TDT 분석을 시행하지 못하였다.
- 각각의 시발체 500nM, 400μM dNTP(Takara, Japan), 0.5 Unit Pfu(Solgent, Korea), 1X Pfu buffer(Solgent, Korea), 1X Band Doctor(Solgent, Korea), 0.3mM betain,(Sigma, USA)를 genomic DNA에 혼합하여 시행하였다.
- 둘째, 5-HTT에서는 현재 3개의 후보유전자가 보고되었는데 이번 연구에서는 5-HTTLPR의 l/s 대립유전자 다형성만을 조사하였고 VNTR 혹은 3’-UTR의 SNP 다형성에 대해서는 조사하지 않았다.
- 미국의 WISC-R에서 문화적 차이가 있다고 생각되는 문항들을 우리 실정에 맞게 수정 및 보완한 아동 및 청소년용 지능검사 도구로써 전체 지능 지수, 언어성 지능 지수, 동작성 지능 지수 및 11개 소검사 영역별로 평가할 수 있도록 구성되어 있다. 본 연구에서는 언어성 지능 지수, 동작성 지능 지수, 전체 지능 지수의 3개 변인을 이용하였다.
- 문제행동증후군 척도는 위축척도, 신체 증상척도, 우울/불안 척도, 사회적 미성숙척도, 사고의 문제척도, 주의집중문제 척도, 비행척도, 공격성척도, 성문제척도, 정서불안정척도, 내재화 문제척도, 외현화 문제척도, 총 문제행동척도 등 모두 13개의 척도로 구성되어 있다. 본 연구에서는 내재화 문제척도, 외현화 문제척도, 총 문제행동척도의 3개 척도점수를 이용하였다.
- 각각의 문항은‘전혀 그렇지 않다’ 0점,‘약간 혹은 가끔 그렇다’ 1점,‘상당히 혹은 자주 그렇다’ 2점,‘매우 자주 그렇다’ 3점으로 평정된다. 본 연구에서는 부주의 점수, 과잉행동-충동성 점수, ADHD 점수, 적대적 반항장애 점수, 품행장애 점수 등 5개의 점수를 이용하였다.
- 또한 시각 자극에 대한 주의력 검사 및 청각 자극에 대한 주의력 검사를 따로 시행할 수 있다. 본 연구에서는 시각 자극에 대한 누락 오류 및 충동성 오류, 청각 자극에 대한 누락 오류 및 충동성 오류 등 총 4개 지표를 이용하였다.
- 미국의 WISC-R에서 문화적 차이가 있다고 생각되는 문항들을 우리 실정에 맞게 수정 및 보완한 아동 및 청소년용 지능검사 도구로써 전체 지능 지수, 언어성 지능 지수, 동작성 지능 지수 및 11개 소검사 영역별로 평가할 수 있도록 구성되어 있다. 본 연구에서는 언어성 지능 지수, 동작성 지능 지수, 전체 지능 지수의 3개 변인을 이용하였다.
- test를 이용하여 TDT를 시행하였다. 본 연구에서는 환자-부-모의 trio가 모두 있는 경우만 TDT 분석에 포함시켰다.
- 증폭된 DNA 10μL에 6X loading dye 2μL를 넣고 mix한 후 1μL를 ethidium bromide로 염색한 1.8% agarose gel에서 200volt로 약 40분간 전기영동한 후자외선 투광기를 통해 DNA molecular marker(100bp ladder)와 비교하여 유전자형을 판별하였다.
대상 데이터
- 4) IQ가 70 이하인 경우(KEDI-WISC 지능평가의 하위 검사 중 어휘문제와 토막짜기로 전체 지능 추정)26) 등의 기준에 해당되는 아동을 제외한 150명을 선정하였다.
- 유전자 분석을 시행하는 모든 대상군(환자군, 부모군, 정상 대조군)에서 각각 10cc 정도의 전혈을 채취한 후-20℃에서 냉동 보관하였다. Genomic DNA는 냉동상태의 혈액에서 G-DEXTM II Genomic DNA Extraction Kit (Intron, Korea)를 사용해서 추출하였다.
- 6%)의 순으로 나타났다. 두 가지 이상의 공존 질환을 지닌 경우는 총 5례(2.7%)로 적대적 반항장애+ 불안장애(2례), 적대적 반항장애+야뇨증(2례), 품행장애+기분장애(1례)였다.
- 6) 정신분열병, 양극성 장애, 기타 소아기 정신증(psychosis), 뚜렛장애, 언어장애, 심한 학습장애 등은 배제된 환자로 이루어졌다. 이러한 선정기준 및 배제기준을 만족시키고 연구에 협조할 것을 동의한 189명의 ADHD 환자와 이들의 생물학적 부모 중 부모 2명 모두 채혈 및 기타 연구에 협조가 가능한 113쌍의 부모(226명)를 연구 대상으로 선정하였다.
데이터처리
- Comparisons were assessed with one-way ANOVA. ADS：ADHD Diagnostic System, OE：Omission Error, CE： Commission Error, Conners：Conner’s Rating Scale, DBDS：Disruptive Behavior Disorder Scale(according to DSMIV), ODD：Oppositional Defiant Disorder, CD：Conduct Disorder, K-CBCL：Korean Child Behavior Checklist, CDI： Children’s Depression Inventory, STAIC-T：State-Trait Anxiety Inventory for Children, Trait, STAIC-S：State-Trait Anxiety Inventory for Children, State, JTCI：Junior Temperament and Character Inventory.
- 또한, 환자군-대조군간 연합 연구에는 역시 χ2 test를 시행하였고, 가족 기반의 연관분석을 위해서는 특정 대립유전자가 더 선호적으로 유전된다는 가설 하에 McNemar’s χ2 test를 이용하여 TDT를 시행하였다.
- (Chi-square) test를 시행하였다. 또한, 환자군에서 유전자형에 따른 임상척도 결과 및 신경심리검사 결과의 분석에는 independent two sample t-test와 one-way analysis of variance(ANOVA)를 시행하였다.
- 연구 대상군의 사회인구학적 및 임상적 특성에서 환자군과 대조군의 연령 및 지능지수의 비교에는 independent two sample t-test를 시행하였고 성별 비교에는 χ2(Chi-square) test를 시행하였다.
이론/모형
- 5-HTTLPR 다형성의 분석은 기존에 확립된 Mann 등37)의 방법을 사용하였다. 분석에 사용된 시발체의 순서는 다음과 같다.
- 그러나 이 방법은‘인구 계층화(population stratification)’ 문제9)로 인한 위양성(false positive) 결과가 가능한데, 가족유전연합분석(family-based association analysis)10) 방법 중 하나인 Transmission/Disequilibrium Test(TDT)의 도입으로 인구 계층화 문제를 해결할 수 있었다.
성능/효과
- Kim 등의 연구에서는 환자군의 유전형 빈도를 기존 우울증 혹은 정신분열병 연구에서 이용하였던 대조군의 유전형 빈도와 비교하였고, 이를 통해 환자군과 대조군간에 유의한 차이를 보이지 않는다고 보고하였다. 이번 연구는 1) 연구에 적합한 대조군을 직접 선정하였고 2) 또한 Kim 등의 연구의 환자군 수보다는 상당히 많은 편이므로, 이번 연구로 한국인에서는 ADHD의 5-HTTLPR의 유전형 분포가 정상인과 차이가 없음을 확증하였다고 할 수 있다.
- 32) K-CBCL은 사회능력척도와 문제행동증후군 척도의 2가지 척도로 나누어져 총 121문항으로 구성되어 있으며 평균이 50이고 표준편차가 10인 T-점수 분포로 변환할 수 있다. 사회능력척도는 사회성 척도, 학업 수행척도, 총사회능력점수 등으로 구성되어 있다.
- 6) 정신분열병, 양극성 장애, 기타 소아기 정신증(psychosis), 뚜렛장애, 언어장애, 심한 학습장애 등은 배제된 환자로 이루어졌다. 이러한 선정기준 및 배제기준을 만족시키고 연구에 협조할 것을 동의한 189명의 ADHD 환자와 이들의 생물학적 부모 중 부모 2명 모두 채혈 및 기타 연구에 협조가 가능한 113쌍의 부모(226명)를 연구 대상으로 선정하였다.
- DSM-IV의 ADHD, 적대적 반항장애, 품행장애에 대한 진단기준에 근거하여 부모가 아동의 행동에 대하여 평가할 수 있도록 개발한 척도이다. ADHD 18문항, 적대적 반항장애 8문항, 품행장애 15문항으로 총 41문항으로 구성되어 있으며 ADHD 18문항은 다시 부주의를 측정하는 9문항, 과잉행동-충동성을 측정하는 9문항으로 구성되어 있다. 각각의 문항은‘전혀 그렇지 않다’ 0점,‘약간 혹은 가끔 그렇다’ 1점,‘상당히 혹은 자주 그렇다’ 2점,‘매우 자주 그렇다’ 3점으로 평정된다.
- K-SADS-PL-K로 진단한 환자군의 ADHD 진단 아형의 분포는 혼합형(60.8%)>주의력결핍형(16.9%)>특정불능형(14.3%)>과잉행동-충동형(7.9%)의 순이었다.
- l/l 유전형은 l/s, s/s 유전형보다 JTCI의 자극 추구성 점수가 유의하게 낮았다. Cloninger에 의하면 자극 추구성은 도파민 시스템과 관련되고 위험 회피성은 세로토닌 시스템과 관련되는데, 이번 결과에서 위험 회피에서 유의한 차이가 없고 도파민 시스템과 연관이 되는 자극 추구성에서 유의한 차이를 보인 것은 l, s 대립유전자에 의한 5-HTTLPR의 기능 변화가 ADHD의 행동 특성을 일으키는 단일 원인이라기보다는, 아마도 도파민계에 먼저 작용을 한 뒤 이에 의해 ADHD의 행동 특성을 나타낼 가능성을 시사한다.
- 가족 기반 분석을 위한 113 trio 중 ADHD 환자군, 부군, 모군 각각에서 5-HTTLPR 유전자의 유전형 분포에 대한 Hardy-Weinberg Equilibrium 분석을 시행하였을때 환자군(χ2=1.68, p=.195), 부군(χ2=.00, p=.950) 모군(χ2=3.09, p=.079) 각각에서 Hardy-Weinberg Equilibrium이 유지되었다.
- 3%로 아형 빈도에서 두 연구가 상당한 차이를 보이고 있다. 결국 두 연구 결과를 종합할 때, 한국인 ADHD에서는 F-HTTLPR 대립유전자의 가족내 선택적 전달을 보이지 않는다고 할 수 있다. 다만, 이번 연구 결과 중 하나인 ADHD 주의력결핍형 가족에서의 l 대립유전자의 선택적 전달에 대해서는 향후 새로운 연구에서 보다 많은 대상군 수를 확보하여 재조사할 필요가 있을 것이다.
- 그러나 ADHD 주의력결핍형 환자 가족 23trio에서는 비록 대상군의 수는 적었지만 분석 결과 l 대립유전자의 선택적 가족내 전달이 통계적으로 유의하였다(χ2=4.57, p=.032)(표 4).
- 기존의 연구에서 제기되어 온 l 대립유전자 빈도의 유의한 증가 혹은 선택적 전달, 혹은 s 대립유전자 빈도의 유의한 증가가 주로 서양인을 포함한 비한국인을 대상으로 한 결과였던 반면 이번 연구는 한국인 ADHD에서는 5-HTTLPR의 유전자 다형성 분포가 일반인과 차이를 보이지 않음을 시사한다.
- 047)에서 유의한 차이가 나타났으며 사후 검정 결과 l/l 유전형의 점수가 l/s 유전형 및 s/s 유전형의 점수보다 낮았다. 또한 JTCI의 자기 초월성-영성(F=4.25, p=.017)에서 유의한 차이가 나타났으며 사후 검정 결과 l/l 유전형의 점수가 l/s 유전형 및 s/s 유전형의 점수보다 유의하게 높았다(표 5).
- 또한 특정불능형을 제외한 ADHD군과 대조군 사이에서도 유전자형 빈도(χ2=.13, p=.936), 대립유전자 빈도(χ2=.14, p=.711), l 대립유전자 유무에 따른 구분(χ2=.11, p=.745) 및 s 대립유전자 유무에 따른 구분(χ2=.07, p=.798) 모두 유의한 차이가 없었다.
- 또한, ADHD 혼합형 환자 가족(χ2= .16, p=.685), 특정불능형을 제외한 ADHD 환자 가족(χ2= .05, p=.819)을 대상으로 한 TDT 분석 모두에서도 대립유전자의 선택적인 전달을 관찰할 수 없었다.
- 또한, 가족기반 연합분석인 TDT에서는 ADHD 전체 환아의 가족, 혼합형 환아의 가족, 특정 불능형을 제외한 환아의 가족에서 모두 유의한 결과가 나타나지 않았다. 반면 비록 23trio의 적은 수이지만 주의력결핍형 가족에서는 l 대립유전자의 선택적 전달이 나타났다.
- 또한, 대립유전자의 유무에 따라 환자군과 대조군을 l 대립유전자가 있는 군(42.9% vs. 42.0%)과 없는 군(57.1% vs. 58.0%)의 두 군으로 구분하였을 경우에도 유의한 차이가 없었으며(χ2=.03, p=.874), 이와 달리 s 대립유전자가 있는 군(92.1% vs. 93.3%)과 없는 군(7.9% vs. 6.7%)의 두 군으로 구분하였을 경우에도 유의한 차이가 없었다(χ2=.20, p=.657)(표 2).
- 사회능력척도는 사회성 척도, 학업 수행척도, 총사회능력점수 등으로 구성되어 있다. 문제행동증후군 척도는 위축척도, 신체 증상척도, 우울/불안 척도, 사회적 미성숙척도, 사고의 문제척도, 주의집중문제 척도, 비행척도, 공격성척도, 성문제척도, 정서불안정척도, 내재화 문제척도, 외현화 문제척도, 총 문제행동척도 등 모두 13개의 척도로 구성되어 있다. 본 연구에서는 내재화 문제척도, 외현화 문제척도, 총 문제행동척도의 3개 척도점수를 이용하였다.
- 우선 환자 가족 전체에 대한 TDT 분석에서는 특정 대립유전자의 선택적인 전달을 관찰할 수 없었다(χ2=.10, p=.753)(표 3).
- 이번 연구 대상군의 사회인구학적 및 임상적 특성에서 환자군과 대조군의 남녀 성비 등은 유의한 차이를 보이지 않았고, 특히 환자군과 대조군의 IQ 역시 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 일반적으로 ADHD 아동들은 IQ 검사 결과 일반 아동보다 평균 5~7점 정도 낮다고 하지만38) 이번 연구에서는 ADHD 환아 중 경계선 정신지체 수준의 IQ에 해당되는 아동이 3명에 불과했고 거의 대부분의 환아가 IQ 80 이상으로 나타난 점 등이 환자군-대조군간 IQ에서 유의한 차이를 보이지 않은 이유로 판단된다.
- 한편, K-SADS-PL-K에 의한 공존질환의 빈도에서는 적대적 반항장애가 9.8%를 보였고 기타 4개 질환(불안장애, 야뇨증, 기분장애, 품행장애)는 최소 1.1%, 최대 3.2%를 보였다. 때로는 이런 공존질환이 ADHD의 유전 연구의 결과 해석에 영향을 미치게 된다.
- 환자 군과 대조군의 대립유전자의 빈도는 l 대립유전자가 각각 25.4%와 24.3%, s 대립유전자가 각각 74.6%와 75.7%로 두 집단간에 유의한 차이는 없었다(χ2=.10, p=.751).
- 환자군 189명과 대조군 150명의 유전형은 l/l형(7.9% vs. 6.7%), l/s형(34.9% vs. 35.3%), s/s형(57.1% vs. 58.0%)으로 나타났으며 두 집단 사이에 유전형 빈도의 유의한 차이는 관찰되지 않았다(χ2=.20, p=.906).
- 환자군과 대조군에서 5-HTTLPR 유전자의 유전형 분포에 대한 Hardy-Weinberg Equilibrium 분석을 시행 하였을 때 환자군(χ2=1.16, p=.281)과 대조군(χ2=.25, p=.620) 모두에서 Hardy-Weinberg Equilibrium이 유지되었다.
- 환자군의 지능지수(IQ)는 105.0±14.6으로 대조군의 지능지수 100.5±8.5와 유의한 차이가 없었다.
후속연구
- 결국 두 연구 결과를 종합할 때, 한국인 ADHD에서는 F-HTTLPR 대립유전자의 가족내 선택적 전달을 보이지 않는다고 할 수 있다. 다만, 이번 연구 결과 중 하나인 ADHD 주의력결핍형 가족에서의 l 대립유전자의 선택적 전달에 대해서는 향후 새로운 연구에서 보다 많은 대상군 수를 확보하여 재조사할 필요가 있을 것이다.
- 이렇게 대상군 수가 충분하지 못하면 결과에 상당한 영향을 미치며 특히 TDT의 경우 이종접합체(heterozyote)인 부모의 유전형만이 분석에 이용되므로 최대한 이상적 수에 근접한 대상군을 확보할 필요가 있다. 향후 이상적 대상군 수에 보다 근접한 실험대상군을 확보하여 상기한 여러 분석 형식을 적용하더라도 분석이 용이할 수 있는 연구 디자인이 꼭 필요할 것이다.
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