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문제 정의
- 아동의 충동성-과잉행동 요인을 평가하기 위해 코너스 부모용 단축평정척도를 실시했다. 또한 담임교사와의 상담이 가능했던 경우에는 아동이 지속적이고 심각한 행동문제 보였는지를 조사했다.
- 이러한 관점에서 본 저자들은 한국인 주의력결핍 과잉행동장애 환자군과 대조군에서 5HT1B 수용체 유전자의 G861C 다형성 분포를 조사하고 이 다형성이 주의력결핍 결핍 과잉행동장애의 발병에 영향을 주는지 살펴보기 위해 환자-대조군 연구를 시행했다. 아울러 주의력결핍 과잉행동장애 환자군과 부모군의 비교를 통해 환자의 가족 내에서 이러한 다형성이 어떻게 전달되는지를 알아보고자 가족기반 연구를 함께 실시했다.
- 그러나 이러한 긍정적 결과에도 불구하고 5HT1B 수용체 유전자의 G861C 다형성과 주의력결핍 과잉행동장애 간의 관련성에 대한 연구가 매우 적었기 때문에 과연 이 유전자 다형성이 주의력결핍 과잉행동장애의 발병에 어떤 영향을 미치는지는 아직 미지수이다. 이러한 관점에서 본 저자들은 한국인 주의력결핍 과잉행동장애 환자군과 대조군에서 5HT1B 수용체 유전자의 G861C 다형성 분포를 조사하고 이 다형성이 주의력결핍 결핍 과잉행동장애의 발병에 영향을 주는지 살펴보기 위해 환자-대조군 연구를 시행했다. 아울러 주의력결핍 과잉행동장애 환자군과 부모군의 비교를 통해 환자의 가족 내에서 이러한 다형성이 어떻게 전달되는지를 알아보고자 가족기반 연구를 함께 실시했다.
제안 방법
- 0ng of genomic DNA를 잘 혼합했다. 95℃에서 15분간 denaturation 시킨 후, 95℃에서 20초, 56℃에서 30초, 72℃에서 1분씩 45주기를 반복 수행했으며, 72℃에서 3분간 최종 extension을 실시했다.
- 프로토콜은 94℃에서 2분간 시발체 extension을 시행한 후, 94℃에서 5초, 52℃에서 5초, 72℃에서 5초씩 모두 55주기를 반복 수행했다. SpectroCLEAN(Sequenom, Inc., Sardiego, USA)를 이용해 반응 산물을 탈염화(desalting)한 다음에 SpectroJET(Sequenom, Inc., Sardiego, USA)를 사용해 384 well SpectroCHIP(Sequenom, Inc., Sardiego, USA) 위에 나눠 담았다. 이 SpectroCHIP들은 모든 과정이 자동화되어 있는 MALDI-TOF MassARRAY system(Bruker-Sequenom, Billerica, USA)에 의해 분석되었다(그림 1).
- 주요 내과적/신경과적/정신과적 과거 병력을 평가하기 위해 부모를 대상으로 자체 제작한 설문지를 통해 조사를 시행했다. 아동의 충동성-과잉행동 요인을 평가하기 위해 코너스 부모용 단축평정척도를 실시했다. 또한 담임교사와의 상담이 가능했던 경우에는 아동이 지속적이고 심각한 행동문제 보였는지를 조사했다.
- 대상 환자군과 부모, 정상 대조군을 대상으로 전주 정맥에서 2~4ml의 말초 혈액을 EDTA tube에 채취한 후 -20℃에 냉동 보관했다. 이를 녹인 후, AccuprepTM Genomic DNA Extraction Kit(Bioneer, Daejon, Korea)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 유전자를 분리했다.
- , Sandiego, USA)를 사용하여 분석을 시행했다. 전체 과정에서 약간의 수정은 있었지만 대체로 제조사의 표준 프로토콜에 따라 실험을 진행했다.
- 주요 내과적/신경과적/정신과적 과거 병력을 평가하기 위해 부모를 대상으로 자체 제작한 설문지를 통해 조사를 시행했다. 아동의 충동성-과잉행동 요인을 평가하기 위해 코너스 부모용 단축평정척도를 실시했다.
- 증폭된 DNA로부터 얻어진 primer extension 산물을 Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF；Sequenom, Inc., Sandiego, USA)를 사용하여 분석을 시행했다. 전체 과정에서 약간의 수정은 있었지만 대체로 제조사의 표준 프로토콜에 따라 실험을 진행했다.
- 환자와 부모군이 모두 동일한 유전자형인 경우는 분석에서 제외했다. 최종적으로 분석이 가능했던 환자-부모군 53trio와 14pair를 대상으로 TDT 분석과 HHRR 분석을 시행했다. 그 결과 TDT 분석과 HHRR 분석 모두 유의한 선택 전달이 관찰되지 않았다(TDT：χ2= 0.
대상 데이터
- 상기 과정을 거쳐 최종적으로 106명의 환자군이 선정되었다. 450명의 초등학생 중에서 환자군과 성별, 연령대별 1：2 빈도짝짓기를 통해 212명의 대조군을 선정했다. 환자군이 결정되면서 부모군은 자동적으로 선정되었다.
- Extension 시발체는 5’-ATCCGGATCTCCTGTGTATGT를 사용했다. hME enzyme(Thermosequenase：Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK), 적당량의 termination mix, extension 시발체 5uM 등이 포함된 각 반응의 전체 부피는 9μl이었다.
- 각 대학병원의 소아정신과 전문의에 의해 DSM-Ⅳ 진단기준에 따라 주의력결핍 과잉행동장애로 진단받은 7~14세 아동을 일차적인 대상으로 선정했다. 코너스 부모용 평가척도(Conners Rating Scale for Parents), 한국판 아동 행동평가조사표(Korean Child Behavior Checklist：K-CBCL) 등의 부모용 자가보고 설문검사를 이용하여 임상적 특징을 확인했으며, 한국판 KiddieSchedule for Affective Disorders and Schizophrenia-Present and Lifetime Version(K-SADS-PL) 검사를 주의력결핍 과잉행동장애의 최종적인 진단에 적용했다.
- 대조군은 서울 시내 초등학교 한 곳과 전주 시내 초등학교 한 곳의 학생을 대상으로 선별검사와 선정기준을 통해 서울 지역 300명, 전주지역 150명 등 총 450명의 대조군을 일차적으로 선발했다.
- 미국 Whitehead Institute, Cambridge, USA)에서 제공한 Primer3 program(http://www-genome.wi. mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi)을 이용해 시발체(primer)를 제작했다. 중합효소 연쇄반응에서 사용된 시발체는 다음과 같다.
- 상기 과정을 거쳐 최종적으로 106명의 환자군이 선정되었다. 450명의 초등학생 중에서 환자군과 성별, 연령대별 1：2 빈도짝짓기를 통해 212명의 대조군을 선정했다.
- 서울과 지방의 네 곳의 대학병원(서울대학병원, 경상대학병원, 단국대학병원, 전북대학병원) 소아 정신과 외래를 방문하여 주의력결핍 과잉행동장애로 진단받은 환자를 대상으로 했다.
- 이번 연구에 포함된 환자군은 서울 지역 대학병원 51명과 지방 지역 대학병원 55명으로 구성되었다.
- 주의력결핍 과잉행동장애 아동의 생물학적 부모를 대상으로 선정했다.
- 8이었다.환자-부모 대상군은 78trio와 28pair로 구성되었는데, pair인 경우는 세 쌍을 제외하고는 모두 환자-어머니 쌍으로 구성되었다.
데이터처리
- 환자군과 대조군의 대립 유전자 빈도 비교는 Chi-square test와 unconditional logistic regression analysis 를 사용했다. logistic regression analysis는 성별, 연령별 보정을 통해 결과를 산출했다.
이론/모형
- 대상 아동 지능검사를 위해 Sattler30)가 제안했던 평가방법을 사용했다. 이는 KEDI-WISC 지능평가의 하위 검사 중 토막짜기와 어휘문제로 전체 지능을 추정하는 방법으로, 언어성 검사에서는 어휘문제가, 동작성 검사에서는 토막짜기 소검사가 전체 지능 지수와 상관이 가장 높은 것으로 알려져 있다.
- 유전자형 및 대립유전자 빈도분석으로 transmission disequilibrium test(TDT)과 haplotype-based haplotype relative risk(HHRR) 방법을 사용했다. 가족기반 연구에서 TDT 분석법이나 HHRR 분석법은 인구계층화를 고려한 통계분석방법이다.
- 각 대학병원의 소아정신과 전문의에 의해 DSM-Ⅳ 진단기준에 따라 주의력결핍 과잉행동장애로 진단받은 7~14세 아동을 일차적인 대상으로 선정했다. 코너스 부모용 평가척도(Conners Rating Scale for Parents), 한국판 아동 행동평가조사표(Korean Child Behavior Checklist：K-CBCL) 등의 부모용 자가보고 설문검사를 이용하여 임상적 특징을 확인했으며, 한국판 KiddieSchedule for Affective Disorders and Schizophrenia-Present and Lifetime Version(K-SADS-PL) 검사를 주의력결핍 과잉행동장애의 최종적인 진단에 적용했다.
성능/효과
- 지금까지 발병 위험인자로 거론되는 것으로 주의력결핍 과잉행동장애의 가족력, 낮은 사회경제 수준, 남성, 가정불화, 이혼, 아동 학대, 정신지체, 행동장애의 동반, 출생 시 저체중, 경한 신체이상, 뇌 외상 병력 등이 있는데, 일반적으로 환경적 요인이나 심리적 요인보다는 기질적인 요인이 작용할 가능성이 크다고 알려져 있다.3) 쌍생아 연구, 입양 연구, 환자의 가족 연구 등 지금까지 보고 된 유전학적 연구를 종합하면 주의력결핍 과잉행동장애의 평균 유전율(heritability)은 대략 0.75~0.80 정도인데, 최근에는 0.85~0.95로 이전보다 높게 보고되는 추세이다.4-7)
- TDT는 특정 대립유전자가 부모로부터 환자에게 전달되는 경우의 수와 전달되지 않는 경우의 수를 산출해서 McNemar x2 test를이용해 분석해 내는 방식31)인데 반해, HHRR은 일종의 가족 내 환자-대조군 형태 분석방법으로서 환자와 내부 대조군의 haplotype을 각각 고려하여 유전된 경우의 수를 세는 방식이다.32) TDT와 HHRR 방법은 각기 장단점을 지니고 있는데,33-35) TDT 분석방법은 HHRR과 달리 인구계층화를 확실하게 배제할 수 있다는 장점이 있으나, HHRR분석방법은 TDT로는 산출이 불가능한 비교위험도(relative risk：RR)을 얻을 수 있다.
- 5HT1B 수용체 유전자의 G861C 유전자형과 대립유전자의 분포는 표 1에 제시한 바와 같다. CC 유전자형이 환자군에서 29.4%, 대조군에서는 27.5%로 나타났고 유전자형 CG는 각각 46.1%와 46.5%, 유전자형 GG는 24.5%와 26.0%였다. 대립유전자 C의 빈도는 환자군에서 52.
- 결론적으로 우리는 이번 연구에서 세로토닌 1B(5HT1B) 수용체 유전자의 G861C 다형성과 주의력결핍 과잉행동장애 간에 어떠한 관련성도 발견하지 못했다. 환자-대조군 연구에서 환자군과 대조군은 유전자형이나 대립유전자의 분포에 있어 차이가 없었으며 이는 일본인을 대상으로 했던 Nishiguchi 등36)의 연구 결과에서 나타난 분포와 유사했다.
- 최종적으로 분석이 가능했던 환자-부모군 53trio와 14pair를 대상으로 TDT 분석과 HHRR 분석을 시행했다. 그 결과 TDT 분석과 HHRR 분석 모두 유의한 선택 전달이 관찰되지 않았다(TDT：χ2= 0.00, df=1, P=1.00；HHRR：χ2=0.00, df=1, P=1.00).
- 두 번째로, 대상 수가 적었기 때문에 주의력결핍 과잉행동장애를 아형이나 동반질환에 따라 세분하여 비교하기가 어려웠다는 점이다. 부모군은 78쌍(전체 환자-부모군의 73.6%)의 trio와 28쌍(전체 환자-부모군의 26.4%)의 pair로 구성되었는데, 부모 전체에서 pair가 차지하는 빈도가 높은 편이었기 때문에 상대적으로 부모군 수가 부족하였으며 환자군과 부모군이 동일한 유전자형을 보이는 경우에는 분석에서 제외했기 때문에 유전자 분석이 가능했던 53trio와 14 pair(전체 환자의 65.1%)에서만 결과 산출이 가능했고 이러한 이유로 통계적 검정력(statistical power)이 떨어지게 되었다. 5HT1B 수용체가 충동성이나 공격성과 관련된다는 기존 연구 결과들13)19)20)이나 세로토닌계가 주의력결핍 과잉행동장애 아동의 공격성이나 부모의 공격성과 관련된다는 연구8)37)38) 등을 감안한다면 향후 충분한 주의력결핍 과잉행동장애 환자를 대상으로 하여 아형, 아동의 공격성이나 충동성, 부모의 정신병리, 동반질환 등에 따라 구분하여 조사하는 것이 바람직할 것이다.
- 3%였다. 유전자형과 대립유전자의 분포 모두에서 환자군과 대조군 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다(χ2=0.14, df=2, P=0.93；χ2=0.16, df=1, P=0.69).
- 09)이 관찰되었다. 특히, 부모 중에서 어머니를 제외하고 아버지만을 대상으로 해서 분석했을 때는, 비록 sample size가 현저히 줄긴 했지만 대립유전자 G의 선택 전달(P=0.03)이 관찰되었다.
- 남녀 성비에서는 환자군과 대조군 모두 93：13으로 남자가 월등히 많았다. 환자군의 지능지수는 97.5±14.2였으며 지능평가가 가능했던 대조군의 지능지수는 100.5±12.7로서 양군 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다(P>0.05).
후속연구
- 5HT1B 수용체 유전자의 G861C 다형성이 주의력결핍 과잉행동장애의 발병에 영향을 미칠 수 있다는 기존의 가족기반 연구와는 달리, 이번 환자-대조군 및 가족 기반 연구에서는 세로토닌 1B 수용체 유전자의 G861C 다형성이 한국인 주의력결핍 과잉행동장애의 발병에 영향을 준다는 증거를 발견할 수 없었다. 그러나 연구대상 수가 상대적으로 적은 편이었고 구체적으로 주의력결핍 과잉행동장애의 특성을 세분하여 비교하지 못했기 때문에 향후 이를 보완한 추가적인 연구가 필요하다 할 것이다.
- 1%)에서만 결과 산출이 가능했고 이러한 이유로 통계적 검정력(statistical power)이 떨어지게 되었다. 5HT1B 수용체가 충동성이나 공격성과 관련된다는 기존 연구 결과들13)19)20)이나 세로토닌계가 주의력결핍 과잉행동장애 아동의 공격성이나 부모의 공격성과 관련된다는 연구8)37)38) 등을 감안한다면 향후 충분한 주의력결핍 과잉행동장애 환자를 대상으로 하여 아형, 아동의 공격성이나 충동성, 부모의 정신병리, 동반질환 등에 따라 구분하여 조사하는 것이 바람직할 것이다.
- 5HT1B 수용체 유전자의 G861C 다형성이 주의력결핍 과잉행동장애의 발병에 영향을 미칠 수 있다는 기존의 가족기반 연구와는 달리, 이번 환자-대조군 및 가족 기반 연구에서는 세로토닌 1B 수용체 유전자의 G861C 다형성이 한국인 주의력결핍 과잉행동장애의 발병에 영향을 준다는 증거를 발견할 수 없었다. 그러나 연구대상 수가 상대적으로 적은 편이었고 구체적으로 주의력결핍 과잉행동장애의 특성을 세분하여 비교하지 못했기 때문에 향후 이를 보완한 추가적인 연구가 필요하다 할 것이다.
- 현재 주의력결핍 과잉행동장애를 아형이나 동반질환에 따라 분류하거나, 약물유전체 연구, 뇌 영상 연구 등을 도입하여 비교적 동질한 표현형을 가지는 집단으로 구분하여 비교 분석하려는 연구가 활발히 시도되고 있다. 비록 이번 연구에서 5HT1B 수용체 유전자와 주의력결핍 과잉행동 장애 간의 관련성을 확인하지 못했지만 향후 보다 동질한 표현형을 가지는 집단으로 재분류하여 이와 같은 연구를 진행해 나가야 할 것이다.
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