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문제 정의
- 따라서 기능성 식품으로써 산수유의 다양한 활용을 위해서는 기능 성분 추출에 대한 다양한 연구가 필요한 실정이다. 본 연구에서는 산수유로부터 떫은 맛을 내며 항산화 물질로 알려진 gallic acid를 추출하기 위해 삼투압, pH, 온도, 주정의 함량을 달리하여 추출 조건을 확립 하고 기능성 식품 및 한방 재료의 다양한 활용을 위한 기초 자료로 제시하고자 본 실험을 수행 하였다.
제안 방법
- 0 mL/min, 시료 주입량은 20 L를 사용하였다. Gallic acid의 동정은 표준품인 gallic acid의 LC/MS/MS 분석 결과와 비교하여 동정하였고, gallic acid 표준용액을 물에 녹여 0.01, 0.1, 0.35 mg/mL로 각각 조제하여 검량선을 작성한 후 계산된 함량으로 나타내었다. 함량을 나타내기 위한 단위로 mg gallic acid equivalents(GAE)/g dry weight을 이용하였다.
- Gallic acid의 표준 용액을 바탕으로 ESI/Ion Trap MS를 negative mode로 분석하여 [M-H]−값과 이온화 되었을 때의 fragment MS/MS의 값을 확인하였다.
- HPLC를 통해 분리된 gallic acid를 확인 하기위해 LC/MS/MS를 이용하여 분석하였다. Gallic acid의 표준 용액을 바탕으로 ESI/Ion Trap MS를 negative mode로 분석하여 [M-H]−값과 이온화 되었을 때의 fragment MS/MS의 값을 확인하였다.
- 각각의 추출물에 ethyl acetate를 첨가하여 혼합한 후 ethyl acetate 층을 분리 추출하였다. 이 과정을 2회 반복하여 ethyl acetate 층을 회수하고, 여기에 무수 황산나트륨을 가하여 여과지로 분리한 후 감압 농축기(Eyela, Tokyo, Japan)로 농축한 후 시액(0.
- 기존의 HPLC/UV 방법은 ppm 수준에서 분석을 수행하는 반면 LC/MS/MS 방법은 ppb 수준까지 정량성을 나타내므로 미량의 물질도 용이하게 검출될 수 있다. 따라서 HPLC상에서 검출된 gallic acid 성분을 확인하기 위해 LC/MS/MS를 시행하여 분석하였다. LC-MS/MS는 Agilent 1200 series HPLC와 Agilent 6410 Triplequdrupole mass spectrometer(Agilent Technologies, Foster city, CA, USA)를 사용하였으며 칼럼은 Zorbax Eclipse Plus C18(2.
- 떫은 맛을 내며 항산화 물질 등으로 알려진 tannin 류의 gallic acid 추출 최적 조건을 검색하기 위해 삼투압, pH, 열처리, 물과 주정 함량을 달리하여 추출 조건별로 gallic acid 함량을 측정하였다.
- 떫은 맛을 내며 항산화 물질 등으로 알려진 tannin 류의 gallic acid 추출 최적 조건을 검색하기 위해 삼투압, pH, 열처리, 주정 함량을 달리하여 추출 조건 별로 gallic acid 함량을 조사하였다. NaCl 농도를 이용한 삼투압 작용은 gallic acid 추출에 큰 영향을 주지 않는 것으로 사료되며 추출 용매의 pH가 3.
- 0 로 맞춘 각각의 용액에 산수유를 24시간 침지 후 여과지로 침전물을 분리 하였으며 열수 추출 조건은 에탄올(50, 60, 80, 100%)을 추출용매로 80℃에서 1시간 동안 환류 추출하였다. 물과 에탄올을 이용한 추출 실험은 우선 다양한 비율의 에탄올 용액(20, 40, 50, 60 70, 80, 100%)을 준비한 후 각각의 추출용액을 일정한 시간(12, 24, 48 hr) 동안 37℃에서침지한 후 추출하였다.
- 삼투압 추출 실험을 위해 산수유 과육을 일정한 시간(24, 48 hr), 일정한 농도(0, 1, 3, 5%)의 NaCl 용액에 침지한 후 추출물을 여과지로 분리하였다. 산 가수분해는 증류수에 구연산을 첨가하여 pH 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0 로 맞춘 각각의 용액에 산수유를 24시간 침지 후 여과지로 침전물을 분리 하였으며 열수 추출 조건은 에탄올(50, 60, 80, 100%)을 추출용매로 80℃에서 1시간 동안 환류 추출하였다. 물과 에탄올을 이용한 추출 실험은 우선 다양한 비율의 에탄올 용액(20, 40, 50, 60 70, 80, 100%)을 준비한 후 각각의 추출용액을 일정한 시간(12, 24, 48 hr) 동안 37℃에서침지한 후 추출하였다.
- 삼투압 추출 실험을 위해 산수유 과육을 일정한 시간(24, 48 hr), 일정한 농도(0, 1, 3, 5%)의 NaCl 용액에 침지한 후 추출물을 여과지로 분리하였다. 산 가수분해는 증류수에 구연산을 첨가하여 pH 3.
- Gallic acid의 표준 용액을 바탕으로 ESI/Ion Trap MS를 negative mode로 분석하여 [M-H]−값과 이온화 되었을 때의 fragment MS/MS의 값을 확인하였다. 선택한 이온과 모드에서 충돌에너지를 가하여 분자 이온을 딸이온(쪼개짐 이온)으로 쪼개고 에너지별 쪼개짐과 딸이온의 세기를 비교하여 최적의 딸이온을 생성하는 충돌에너지 및 기타 파라미터를 저장하여 MRM조건을 확립하였다(18). MRM은 구조가 다른 분자의 쪼개짐 에너지와 쪼개짐 패턴의 차이를 이용하여 분자의 확인과 정량을 하므로 정량성과 분자에 대한 특이성을 제공하는 것으로 알려져 있다(19).
- 각각의 추출물에 ethyl acetate를 첨가하여 혼합한 후 ethyl acetate 층을 분리 추출하였다. 이 과정을 2회 반복하여 ethyl acetate 층을 회수하고, 여기에 무수 황산나트륨을 가하여 여과지로 분리한 후 감압 농축기(Eyela, Tokyo, Japan)로 농축한 후 시액(0.2 M 인산완충액:메탄올:물=2:3:15, v/v/v, pH 3.0)에 용해시킨 후 0.2 m membrane filter로 여과하여 이를 HPLC 분석 시료로 사용하였다. 사용한 HPLC는 NS3000 system(FUTECS, Deajeon, Korea)이였고, column은 Hypersil-ODS(200×4.
- 표준용액 gallic acid를 0.01, 0.1, 0.35 mg/mL 되게 희석하여 검량선을 구한 결과 상관계수(r2)는 0.999로 양호한 직선성을 나타내었고 함량을 나타내기 위한 단위로 mg gallic acid equivalents(GAE)/g dry weight을 이용하였다.
대상 데이터
- 2 µL/min 유속으로 흘려주었고, 시료의 주입량은 1 µL를 사용하였다. Curtain gas와 collision gas로는 고순도 N2를 사용하였다. LC-MS/MS 분석 조건으로는 음이온 모드에서 ESI needle voltage는 4000V이며 gas temperature는 350℃, gas flow는 10 L/min, nebulizer pressure는 45 psi로 하였다[Table 1].
- 본 실험에서 사용한 산수유는 전남 구례군 산동면(2009년도산)에서 수확한 것을 수세하여 과육과 씨를 분리한 다음 과육을 −20℃에서 냉동 보관한 후, 건조·분쇄하여 사용하였다.
- LC-MS/MS 분석 조건으로는 음이온 모드에서 ESI needle voltage는 4000V이며 gas temperature는 350℃, gas flow는 10 L/min, nebulizer pressure는 45 psi로 하였다[Table 1]. 분석에 사용되는 acetonitrile, acetic acid, methanol, water는 HPLC grade로 J.T. Baker사(Phillipsburg, NJ, USA) 제품을 사용하였다.
- 사용한 HPLC는 NS3000 system(FUTECS, Deajeon, Korea)이였고, column은 Hypersil-ODS(200×4.6 mm i.d., 5 µm 40℃, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였으며, UV 280 nm 파장에서 측정하였다.
- , 5 µm 40℃, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였으며, UV 280 nm 파장에서 측정하였다. 이동상으로는 acetonitrile:acetic acid:methanol:water(113:5:20:862, v/v/v/v)를 사용하였으며 유속은 1.0 mL/min, 시료 주입량은 20 L를 사용하였다. Gallic acid의 동정은 표준품인 gallic acid의 LC/MS/MS 분석 결과와 비교하여 동정하였고, gallic acid 표준용액을 물에 녹여 0.
- 함량을 나타내기 위한 단위로 mg gallic acid equivalents(GAE)/g dry weight을 이용하였다. 추출과 분석에 사용되는 acetonitrile, acetic acid, methanol, water는 HPLC grade로 J.T. Baker사(Phillipsburg, NJ, USA) 제품을 사용하였고 gallic acid, tannic acid, ethyl acetate, sodium sulfate anhydrous 등 기타 시약은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
데이터처리
- 결과 수치들은 평균과 표준편차로 나타내었으며, 실험군 간의 통계학적인 분석은 Sigma-Stat 3.5(Jandel Co., San Rafeal, CA, USA)를 이용하여 one-way analysis of variance(ANOVA)분석을 실시하였으며 유의성 검정은 p-value가 0.05 이하일 경우를 유의한 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 8 µm, Agilent Technologies)를 사용하였다. 데이터 처리 및 기기운용 프로그램으로서 Agilent masshunter workstation data acquisition을 사용하였다. LC-MS/MS 분석 조건으로 이동상은 acetonitrile:acetic acid:methanol: water(113:5:20:862, v/v/v/v)를 0.
성능/효과
- 0에서 gallic acid 함량이 감소되는 경향을 나타내었다. 80℃에서 다양한 주정 농도로 1시간 동안 환류 추출한 경우 주정의 농도가 높을수록 gallic acid 함량이 유의적으로 증가하였고 산수유 과육을 일정한 온도(37℃)에서 주정 농도 별로 12, 24, 48시간 침지 하여 추출한 결과 침지 시간과 주정 농도가 증가할수록 gallic acid 함량도 증가하였지만 주정의 농도가 70-80% 이후에는 오히려 gallic acid의 추출 효율이 감소되는 경향을 나타내었다. 따라서 산수유로부터 gallic acid 의 추출 최적 조건으로는 산수유 과육을 37℃에서 침지 시 주정 70%로 48시간 추출한 경우 gallic acid 함량이 높았고, 환류 추출의 경우 80℃에서 주정 100%로 1시간 열처리 하였을 때 상대적으로 gallic acid 함량이 높게 나타났다.
- 떫은 맛을 내며 항산화 물질 등으로 알려진 tannin 류의 gallic acid 추출 최적 조건을 검색하기 위해 삼투압, pH, 열처리, 주정 함량을 달리하여 추출 조건 별로 gallic acid 함량을 조사하였다. NaCl 농도를 이용한 삼투압 작용은 gallic acid 추출에 큰 영향을 주지 않는 것으로 사료되며 추출 용매의 pH가 3.0에서 6.0으로 갈수록 gallic acid 함량이 증가하다가 pH 7.0에서 gallic acid 함량이 감소되는 경향을 나타내었다. 80℃에서 다양한 주정 농도로 1시간 동안 환류 추출한 경우 주정의 농도가 높을수록 gallic acid 함량이 유의적으로 증가하였고 산수유 과육을 일정한 온도(37℃)에서 주정 농도 별로 12, 24, 48시간 침지 하여 추출한 결과 침지 시간과 주정 농도가 증가할수록 gallic acid 함량도 증가하였지만 주정의 농도가 70-80% 이후에는 오히려 gallic acid의 추출 효율이 감소되는 경향을 나타내었다.
- NaCl 농도를 이용한 삼투압 추출은 Fig. 1에서와 같이 NaCl 1, 3, 5% 침지 용액보다 NaCl 무 첨가구에서 gallic acid 함량이 유의적으로 증가하였으며 침지시간은 24시간보다 48시간에서 gallic acid 함량이 유의적으로 증가하였다. 이는 삼투압 작용이 gallic acid 추출에 영향을 주지 않는 것으로 생각되어지며, 이러한 결과는 삼투압 차로 인한 추출 저하로 추출용매에 대한 gallic acid의 용해속도가 감소하여 나타난 것으로 생각되어진다[Fig.
- 가수 분해성 타닌은 glucose의 수산기에 gallic acid가 ester 결합을 하고 있기 때문에, 산 가수 분해 시 gallic acid 함량이 증가할 것으로 사료되어 구연산을 이용해 pH 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0로 맞춘 각각의 용액에 산수유를 24시간 침지하여 gallic acid의 용해속도를 조사한 결과는 Fig. 2에 나타난 바와 같이 pH 3.0에서 pH 6.0으로 갈수록 gallic acid 함량이 증가하다 pH 7.0에서 gallic acid 함량이 감소하는 경향을 알 수 있었다. pH 7.
- 80℃에서 다양한 주정 농도로 1시간 동안 환류 추출한 경우 주정의 농도가 높을수록 gallic acid 함량이 유의적으로 증가하였고 산수유 과육을 일정한 온도(37℃)에서 주정 농도 별로 12, 24, 48시간 침지 하여 추출한 결과 침지 시간과 주정 농도가 증가할수록 gallic acid 함량도 증가하였지만 주정의 농도가 70-80% 이후에는 오히려 gallic acid의 추출 효율이 감소되는 경향을 나타내었다. 따라서 산수유로부터 gallic acid 의 추출 최적 조건으로는 산수유 과육을 37℃에서 침지 시 주정 70%로 48시간 추출한 경우 gallic acid 함량이 높았고, 환류 추출의 경우 80℃에서 주정 100%로 1시간 열처리 하였을 때 상대적으로 gallic acid 함량이 높게 나타났다. 본 실험 결과 산수유 과육으로부터 떫은 맛을 내는 gallic acid의 추출률은 주정의 농도와 온도, 추출 시간에 영향을 받는 것으로 사료된다.
- 따라서 산수유로부터 gallic acid 의 추출 최적 조건으로는 산수유 과육을 37℃에서 침지 시 주정 70%로 48시간 추출한 경우 gallic acid 함량이 높았고, 환류 추출의 경우 80℃에서 주정 100%로 1시간 열처리 하였을 때 상대적으로 gallic acid 함량이 높게 나타났다. 본 실험 결과 산수유 과육으로부터 떫은 맛을 내는 gallic acid의 추출률은 주정의 농도와 온도, 추출 시간에 영향을 받는 것으로 사료된다.
- 5에 나타내었다. 분리된 각 성분들의 retention-time(RT)별 LC/MS/MS을 분석한 결과, Fig. 5은 LC 분리 성분 중 RT 1.0분의 성분이 MS에 도입되면서 분석된 결과이며 RT 1.0분에서 분리된 성분은 m/z 125.0과 169.0의 두 가지 질량 분석 피크가 강하게 나타났다. LC/MS/MS 분석에서 negative mode로 측정할 경우 일반적으로 양성자(proton)가 하나가 빠진 형태의 molecular ion이 측정되는데 여기에서 m/z 169.
- 침지 시간과 주정의 농도가 증가할수록 gallic acid 함량이 증가되었다. 산수유를 주정 80%로 12시간 침지 시 gallic acid 함량이 1.25 mg/g로 나타났으며, 주정 70%로 24, 48시간 침지했을 경우 gallic acid 함량이 각각 1.35, 1.50 mg/g로 보다 높은 추출 효율을 보였다. 주정 농도를 달리하여 일정시간(12, 24, 48시간) 동안 침지 시, gallic acid 함량은 침지 시간과 주정의 농도에 크게 영향을 받는 것으로 사료되어진다.
- 4에 나타내었다. 침지 시간과 주정의 농도가 증가할수록 gallic acid 함량이 증가되었다. 산수유를 주정 80%로 12시간 침지 시 gallic acid 함량이 1.
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