간성상세포(HSC)는 간섬유화와 간경변에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 간손상에 의해 둥근 모양의 간성상세포는 활성화되어 세포외기질(ECM)을 생산하는 myofibroblast와 같은 모양으로 활성화 된다. 활성화된 간성상세포의 특징은 빠른 증식 속도와 collagen과 같은 세포외 기질의 생산이다. 활성화된 간성상 세포의 제거방법은 apoptosis를 유도하는 것이다. 가자 추출물은 정상 간세포(rat primary hepatocyte), 간세포주(HepG2) 및 활성화된 간성상세포주인 T-HSC/Cl-6에 $1,000{\mu}g/mL$의 농도까지 처리하여 세포독성을 확인하였다. 그 결과 hepatocyte나 HepG2에서는 최고 농도에서도 독성이 없었으나 T-HSC/Cl-6는 U-shape 모양으로 사멸하는 것을 확인 하였다. T-HSC/Cl-6의 사멸이 apoptosis에 의한 것인지를 Annexin-V/PI double staining을 통하여 확인한 결과 apoptosis에 의해 T-HSC/Cl-6의 사멸이 일어나는 것을 확인하였다.
간성상세포(HSC)는 간섬유화와 간경변에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 간손상에 의해 둥근 모양의 간성상세포는 활성화되어 세포외기질(ECM)을 생산하는 myofibroblast와 같은 모양으로 활성화 된다. 활성화된 간성상세포의 특징은 빠른 증식 속도와 collagen과 같은 세포외 기질의 생산이다. 활성화된 간성상 세포의 제거방법은 apoptosis를 유도하는 것이다. 가자 추출물은 정상 간세포(rat primary hepatocyte), 간세포주(HepG2) 및 활성화된 간성상세포주인 T-HSC/Cl-6에 $1,000{\mu}g/mL$의 농도까지 처리하여 세포독성을 확인하였다. 그 결과 hepatocyte나 HepG2에서는 최고 농도에서도 독성이 없었으나 T-HSC/Cl-6는 U-shape 모양으로 사멸하는 것을 확인 하였다. T-HSC/Cl-6의 사멸이 apoptosis에 의한 것인지를 Annexin-V/PI double staining을 통하여 확인한 결과 apoptosis에 의해 T-HSC/Cl-6의 사멸이 일어나는 것을 확인하였다.
Activation of hepatic stellate cells (HSCs) is known to be responsible for hepatic fibrosis and cirrhosis. When round-shape quiescent HSCs go to activation by liver injury, production of extracellular matrix is increased, and its shape becomes myofibroblast-like shape. The activated HSCs are charact...
Activation of hepatic stellate cells (HSCs) is known to be responsible for hepatic fibrosis and cirrhosis. When round-shape quiescent HSCs go to activation by liver injury, production of extracellular matrix is increased, and its shape becomes myofibroblast-like shape. The activated HSCs are characterized by the high rate of proliferation and the increased production of extracellular matrix. One way of the regeneration of activated HSCs is an apoptosis induction followed by removing the activated myofibroblast-like cells. The effect of extract of Terminalia chebula Retz. (TCE) on cytotoxicity was evaluated using the rat primary hepatocyte, HepG2 and T-HSC/Cl-6 by incubating these cells with TCE up to the dose of $1,000{\mu}g/mL$. At the maximum dose of TCE, no cytotoxicity was found on primary hepatocyte and HepG2, but cytotoxic effect of TCE was found on activated HSCs, and T-HSC/Cl-6 in a U-shaped dose-response manner with the highest effect at $500{\mu}g/mL$ of TCE. Finally, we confirmed the occurrence of apoptotic cell death by annexin-V/PI double staining. The population of annexin-V positive cells was increased in a dose dependent manner.
Activation of hepatic stellate cells (HSCs) is known to be responsible for hepatic fibrosis and cirrhosis. When round-shape quiescent HSCs go to activation by liver injury, production of extracellular matrix is increased, and its shape becomes myofibroblast-like shape. The activated HSCs are characterized by the high rate of proliferation and the increased production of extracellular matrix. One way of the regeneration of activated HSCs is an apoptosis induction followed by removing the activated myofibroblast-like cells. The effect of extract of Terminalia chebula Retz. (TCE) on cytotoxicity was evaluated using the rat primary hepatocyte, HepG2 and T-HSC/Cl-6 by incubating these cells with TCE up to the dose of $1,000{\mu}g/mL$. At the maximum dose of TCE, no cytotoxicity was found on primary hepatocyte and HepG2, but cytotoxic effect of TCE was found on activated HSCs, and T-HSC/Cl-6 in a U-shaped dose-response manner with the highest effect at $500{\mu}g/mL$ of TCE. Finally, we confirmed the occurrence of apoptotic cell death by annexin-V/PI double staining. The population of annexin-V positive cells was increased in a dose dependent manner.
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문제 정의
본 연구에서는 국내에서도 많이 사용되고 있는 가자(Terminalia chebula Retz.)의 열수 추출물이 활성화된 HSC의 증식억제 활성을 가지고 있음을 확인하였다. 가자 추출물의 간경화 억제활성이 U-shape의 모양을 나타내는 것과 활성의 본체 및 동물실험을 통한 보다 심도 깊은 연구 수행이 필요하나 가자 추출물이 간섬유화 억제 효능이 있으며 간기능 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
이에 본 연구에서는 가자 추출물이 간경화의 주요인자인 활성화된 HSC의 사멸을 유도하여 간섬유화 억제 효능이 있음을 확인하고자 한다.
제안 방법
24 well plate에 각각 1.5×105 cells/well로 넣은 후 24시간 후에 배양 용기에 부착된 hepatocytes와 T-HSC/Cl-6에 각각 가자 추출물(100-1,000 µg/mL)을 2시간 처리 후 Mortem 등에 의한 방법(24)을 일부 변형하여 MTT를 이용하여 측정하였다.
실험동물은 고려대학교 동물실험윤리위원회 승인(승인번호 KUIACUC-2009-52)을 받은 후 ‘실험동물 관리 및 이용에 관한 지침(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NRC)’에 맞추어 관리하였다. Rat의 간으로부터 hepatocyte의 분리는 2단계의 collagenase perfusion 방법(19)으로 Bissel 등(20)과 Bonney(21)의 방법을 약간 변형하여 실시하였으며 시료의 처리는 분리된 후 24시간 이내에 실시하였다.
T-HSC/Cl-6는 10% FBS, 100 units/mL penicillin/streptomycin를 함유한 William’s Medium E를 사용하여 37oC, 5% CO2 배양기에서 배양하였으며, 계대배양은 2일마다 시행하였다.
가자 추출물에 의한 활성화된 HSC의 세포사멸이 apoptosis에 의한 것인지 아니면 necrosis에 의한 것인지를 구별하기 위하여 apoptosis 발생의 초기단계로 간주되는 세포내 phosphatidylserine(PS) 발현 정도를 annexin V를 이용하여 측정하였다. Fig.
활성화된 간성상세포의 제거방법은 apoptosis를 유도하는 것이다. 가자 추출물은 정상 간세포(rat primary hepatocyte), 간세포주(HepG2) 및 활성화된 간성상세포주인 T-HSC/Cl-6에 1,000 µg/mL의 농도까지 처리하여 세포독성을 확인하였다. 그 결과 hepatocyte나 HepG2에서는 최고 농도에서도 독성이 없었으나 T-HSC/Cl-6는 U-shape 모양으로 사멸하는 것을 확인 하였다.
세포독성 또는 항간섬유화 활성 즉, 활성화된 hepatic stellate cell line인 T-HSC/Cl-6에 대한 독성은 세포의 대사활성을 측정하여 알아보았다. 24 well plate에 각각 1.
회수된 T-HSC/Cl-6는 4℃ PBS(phosphate buffered saline)로 두번 수세 후 ApopNexinTM FITC apoptosis detection kit(Chemicon, Germany)로 처리하였고, FACS와 Cell Quest Pro software(Becton Dickinson & Co., Franklin lakes, NJ, USA)를 이용하여 각 군마다 총 10,000 event를 취하여 분석을 시행하였다.
대상 데이터
Human liver cell line인 HepG2(ATCC, HB-8065)는 10% FBS를 함유한 DMEM을 이용하여 37oC, 5% CO2 배양기에서 배양하였으며, 배지는 2-3일에 한번 씩 교환해주었다.
T-HSC/Cl-6는 안정한 phenotype과 생화학적 특징을 가지는 immortalized rat stellate cell-line으로(22,23) 원광대학교 손동환 교수로부터 제공받아 사용하였다. T-HSC/Cl-6는 10% FBS, 100 units/mL penicillin/streptomycin를 함유한 William’s Medium E를 사용하여 37oC, 5% CO2 배양기에서 배양하였으며, 계대배양은 2일마다 시행하였다.
)는 2004년 타이완에서 재배, 건조되어 국내에서 성재 건재 약업사(Seoul, Korea)를 통해 소분되어 판매되는 것을 경동 한약재 시장(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 보관용 대조표본(voucher specimen)을 제외한 나머지는 분쇄하여 사용하였다. 분쇄한 시료 150 g을 3L의 증류수를 이용하여 3시간 동안 환류 추출하였다.
본 실험에 사용된 실험동물은 평균 체중 200±10 g의 SPF 웅성 Sprague-Dawley rats을 Samtako Bio Korea(Gyeonggi, Korea)로부터 구입하여 사용하였다.
본 실험에서 사용한 재료 물질인 가자(Terminalia chebula Retzs.)는 2004년 타이완에서 재배, 건조되어 국내에서 성재 건재 약업사(Seoul, Korea)를 통해 소분되어 판매되는 것을 경동 한약재 시장(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 보관용 대조표본(voucher specimen)을 제외한 나머지는 분쇄하여 사용하였다.
세포배양에 사용한 Dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM), Leibovitz’s L-15(L-15) medium, fetal bovine serum(FBS), penicillin, streptomycin은 GIBCO(Grand Island, NY, USA)에서, 3-[4,5-dimethylthiazol]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), William's Medium E는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였으며 이외에 사용된 시약은 특급시약을 사용하였다.
데이터처리
모든 실험 자료는 평균±표준오차로 표현되었으며 one way ANOVA에 의해 분석하여, 다중범위검정(Duncan’s multiple range test)을 실시하여 차이를 검정하였으며, 이때의 유의수준은 5%였다.
성능/효과
1C, HepG2에 대한 독성은 처리농도(100-1,000 µg/mL)에서는 없는 것을 확인하였다.
Apoptosis의 정도를 확인하기 위하여 annexin V 만을 측정한 결과(Fig. 3) 가자 추출물 500 µg/mL(Fig. 3D) 이상의 농도에서 모두 강한 apoptotic signal을 확인할 수 있었다.
T-HSC/Cl-6 세포주에 가자 추출물을 농도를 달리하여 처리한 결과 가자 100 µg/mL의 농도로 처리한 처리군(Fig. 2B)에서 초기 apoptosis(R2)와 후기 apoptosis(R3)에 의한 세포사멸이 증가되었으며 500 µg/mL 처리군에서 후기 apoptosis를 확인할 수 있었으며 그 이상의 농도에서는 세포가 사멸된 annexin V에는 negative이지만 PI에 positive인 완전히 사멸된 세포가 증가한 것을 확인 할 수 있었다.
그 결과 hepatocyte나 HepG2에서는 최고 농도에서도 독성이 없었으나 T-HSC/Cl-6는 U-shape 모양으로 사멸하는 것을 확인 하였다. T-HSC/Cl-6의 사멸이 apoptosis에 의한 것인지를 Annexin-V/PI double staining을 통하여 확인한 결과 apoptosis에 의해 T-HSC/Cl-6의 사멸이 일어나는 것을 확인하였다.
)의 열수 추출물이 활성화된 HSC의 증식억제 활성을 가지고 있음을 확인하였다. 가자 추출물의 간경화 억제활성이 U-shape의 모양을 나타내는 것과 활성의 본체 및 동물실험을 통한 보다 심도 깊은 연구 수행이 필요하나 가자 추출물이 간섬유화 억제 효능이 있으며 간기능 개선 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
1B) 100 µg/mL로 처리한 경우에도 활성화된 HSC의 사멸을 확인 할 수 있었다. 가자 추출물이 immortalized cell line에 대한 독성인지 선택적으로 HSC에 대한 활성인지를 확인하기 위해 사람의 간 세포주인 HepG2에 대한 세포독성을 확인한 결과(Fig. 1C, HepG2에 대한 독성은 처리농도(100-1,000 µg/mL)에서는 없는 것을 확인하였다.
가자 추출물은 정상 간세포(rat primary hepatocyte), 간세포주(HepG2) 및 활성화된 간성상세포주인 T-HSC/Cl-6에 1,000 µg/mL의 농도까지 처리하여 세포독성을 확인하였다. 그 결과 hepatocyte나 HepG2에서는 최고 농도에서도 독성이 없었으나 T-HSC/Cl-6는 U-shape 모양으로 사멸하는 것을 확인 하였다. T-HSC/Cl-6의 사멸이 apoptosis에 의한 것인지를 Annexin-V/PI double staining을 통하여 확인한 결과 apoptosis에 의해 T-HSC/Cl-6의 사멸이 일어나는 것을 확인하였다.
따라서 가자추출물은 활성화된 HSC에 대하여 선택적으로 cytotoxicity를 가지고 있는 것을 알 수 있었으며 이 활성은 U-shape의 형태로 500 µg/mL의 농도에서 가장 높은 항섬유화 활성을 가지고 있음을 알 수 있었다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
가자는 무엇인가?
사군자과(Combfreetaceae)에 속하는 가자나무(Terminalia chebula Retz.)의 성숙한 열매를 말린 가자(訶子, medicinal terminalia fruit)는 가려늑(訶黎勒), 가리늑(訶梨勒), 수풍자(隨風子), 가리(訶梨), 가려(訶黎)라고 해서 아시아에서 약용으로 사용되고 있다(12). 한의학에서는 삽(澁)한 맛과 온(溫)한 약성을 가지며 수렴(收斂), 지혈, 만성 후두염, 후두결핵, 장출혈, 만성자궁염, 이질 등의 치료에 많이 쓰이고 있다(12).
간성상 세포가 간의 섬유화 치료제로서 새로운 표적이 되는 이유는 무엇인가?
그러나 만성적인 손상이 지속될 경우, 활성화된 HSC의 빠른 증식과 이에 따른 ECM 즉, collagen의 과다 생산 및 축적으로(7) ECM에 의해서 간세포들이 둘러싸여 결절이 생기게 되고 마침내 병리학적으로 경변(cirrhosis)이 된다. 간에서 약 5% 정도 있는 HSC는 체내 vitamin A의 저장고로서의 역할이 알려졌고(9), 1972년 이들 세포가 간의 섬유화(liver fibrosis) 과정에서 가장 주요한 역할을 한다고 밝혀지면서(10) 활성화된 HSC의 증식억제는 간의 섬유화 과정을 막을 수 있을 것으로 기대되면서 간의 섬유화 치료제로서 새로운 표적이 되고 있다(11).
가자 추출물은 어떤 생리활성을 가지고 있는가?
한의학에서는 삽(澁)한 맛과 온(溫)한 약성을 가지며 수렴(收斂), 지혈, 만성 후두염, 후두결핵, 장출혈, 만성자궁염, 이질 등의 치료에 많이 쓰이고 있다(12). 가자 추출물은 항암활성(13), 항당뇨활성(14), 항돌연변이활성(15), 항균활성(16), 충치 예방효과(17) 등 다양한 생리활성을 가지고 있음이 알려져 있다. 본 연구진에서도 가자 추출물의 활성산소에 의한 간손상 억제 효능이 있음을 in vivo와 in vitro 연구를 통하여 확인하였으며 가자 추출물로부터 얻은 chebulic acid의 항산화 활성과 활성산소에 대한 간보호 활성이 있음을 발표하였다(18,19).
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