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문제 정의
- 일본에서 만성 간염환자에게 널리 사용되는 약초 성분인 Sho-saiko-to(TJ-9)가 항산화 효과가 있어 간섬유화를 억제하고 간내 콜라겐 양과 malondialdehyde(MDA) 양을 감소시켰다는 연구(Miyamura et al 1998, Shimizu et al 1999)와 항산화 효과가 있는 Artemisia asiatica의 추출물인 DA-9601가 지방의 과산화를 억제하고, 간효소치의 상승을 감소시켜 간섬유화 및 간세포 염증 반응을 효과적으로 억제시켰다는 연구(Cheong et al 2002)에서와 같이 지질 과산화를 억제 또는 방지할 수 있는 기능, 즉 항산화 효과는 간 보호 효과 및 항염증 작용이 있는 것으로 보고되고 있어(Yasuda et al 1999) 많은 연구가 진행되고 있으나, 이와 더불어 항섬유화 효과에 대한 연구는 아직은 미비한 실정이다. 이에 본 연구에서는 항산화 효능이 있는 홍차가 흰쥐에 있어서 간 보호 및 간 기능 개선에 미치는 효과가 어느 정도인지 알아보기 위하여 흰쥐에 간 손상을 유도하여, 홍차 추출물을 급여한 후 혈청 중 aspartate aminotransferase(AST), alanine aminotransferase(ALT), alkaline phosphatase(ALP), blood urea nitrogen(BUN), creatinine, high density lipoprotein-cholesterol(HDL-cholesterol), low density lipoprotein-cholesterol(LDL-cholesterol), albumin과 간 조직 중 MDA를 측정하여 간 기능 개선 및 간보호 효과를 연구하였고, 간 조직 중 hydroxyproline을 측정하여 항섬유화 효과에 대해 연구하였다.
제안 방법
- -thiopental sod.(0.312 mL CCl4, 4.69 mg thiopental)와 0.375 mL olive oil의 혼합액을 주 3회 1 mL씩 3주간 경구투여하였다.
- 3주간 관찰 후 실험동물을 희생시켜 혈청 및 간과 신장의 조직을 시료로 사용하였다. 혈청은 심장에서 채혈하여 1시간 이상 실온에 방치한 후 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 -20℃에 보관하면서 사용하였고, 간과 신장 조직의 일부는 -70℃에 보관하면서 hydroxyproline과 MDA를 측정하였다.
- 간 손상을 유도하지 않은 정상군, CCl4에 의해 간 손상이유도된 대조군, CCl4에 의해 간 손상을 유도하고, 홍차 추출물을 급여한 Ba군, Bb군을 3주 동안 관찰하여 혈청 생화학적 변화와 간 조직중 hydroxyproline과 MDA를 측정하여 간기능 개선 및 항섬유화 효과를 연구하였다. 체중 증가량은 홍차 추출물 급여군이 정상군에 비해 감소하는 경향이 나타났으나 유의성은 인정되지 않았고, 식이 섭취량은 대조군에 비해 홍차 추출물 급여군이 감소하는 경향이 나타났으나 유의성은 인정되지 않았다.
- 간 조직(0.5×0.5×0.5 cm)을 절취하여 10% 중성 포르말린 액에 고정시킨 후에 단계적으로 알코올 탈수과정을 거쳐서 파라핀으로 포맷하여 5 μm의 절편을 만들어서 hematoxylin & eosin 염색을 한 다음 광학현미경으로 병변을 관찰하였고, 일부는 masson's trichrome 염색을 실시하여 관찰하였다.
- 홍차 추출물 급여량은 세포 독성 시험 결과와 사람의 하루 평균 차 섭취량을 기준으로 산출하여 결정하였다. 냉동 건조시킨 홍차 추출물 분말을 5 mg/rat/day와 10 mg/rat/day 2가지 용량으로 설정하였고, 실험군 Ba(CCl4-thiopental sod. + 5 mg/rat/day water extracts of black tea)와 Bb(CCl4-thiopental sod. + 10 mg/rat/day water extracts of black tea)로 표시하였다. 동물의 일주일 간의 적응기간 동안에 음수량을 측정한결과, 평균적으로 30 mL/rat/day를 음용한 것을 확인한 후, 위에서 설정된 홍차 추출물을 음용수에 혼합하여 급여하였다.
- + 10 mg/rat/day water extracts of black tea)로 표시하였다. 동물의 일주일 간의 적응기간 동안에 음수량을 측정한결과, 평균적으로 30 mL/rat/day를 음용한 것을 확인한 후, 위에서 설정된 홍차 추출물을 음용수에 혼합하여 급여하였다.
- 체중이 100～110 g인 Sprague-Dawley female 흰쥐를 구입하여 온도 22±2℃, 습도 50～60%의 환경에서 밤과 낮의 리듬을 유지하며, 물과 일반사료를 자유롭게 공급하여 일주일동안 안착시킨 후 실험에 사용하였다. 실험동물은 체중에 따른 난괴법에 의해 4개군으로 분류하였는데, 정상군은 6마리, 대조군과 홍차 추출물 급여군(Ba, Bb)은 각각 11마리씩을 한군으로 설정하였다. 정상군은 일반사료와 물을 급여하였으며, 대조군은 일반사료와 물을 급여고, carbon tetrachloride(CCl4)-thiopental sod.
- 실험동물은 체중에 따른 난괴법에 의해 4개군으로 분류하였는데, 정상군은 6마리, 대조군과 홍차 추출물 급여군(Ba, Bb)은 각각 11마리씩을 한군으로 설정하였다. 정상군은 일반사료와 물을 급여하였으며, 대조군은 일반사료와 물을 급여고, carbon tetrachloride(CCl4)-thiopental sod.를 투여하였다.
- 5 cm)을 절취하여 10% 중성 포르말린 액에 고정시킨 후에 단계적으로 알코올 탈수과정을 거쳐서 파라핀으로 포맷하여 5 μm의 절편을 만들어서 hematoxylin & eosin 염색을 한 다음 광학현미경으로 병변을 관찰하였고, 일부는 masson's trichrome 염색을 실시하여 관찰하였다. 즉, hematoxylin으로 핵을 염색하고 biebrich scarlet-acid fuchsin으로 조직 전체를 염색한 다음 phosphomolybdic-phosphotungstic acid로 콜라겐 부분을 탈색하여 그 부분을 anilin blue나 light green으로 콜라겐을 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 표준물질인 4-trans hydroxyproline을 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5, 2.0 μg /50 μL로 희석하여 표준곡선을 얻었다.
- 홍차 추출물 급여량은 세포 독성 시험 결과와 사람의 하루 평균 차 섭취량을 기준으로 산출하여 결정하였다. 냉동 건조시킨 홍차 추출물 분말을 5 mg/rat/day와 10 mg/rat/day 2가지 용량으로 설정하였고, 실험군 Ba(CCl4-thiopental sod.
대상 데이터
- 체중이 100～110 g인 Sprague-Dawley female 흰쥐를 구입하여 온도 22±2℃, 습도 50～60%의 환경에서 밤과 낮의 리듬을 유지하며, 물과 일반사료를 자유롭게 공급하여 일주일동안 안착시킨 후 실험에 사용하였다.
- 성분 분석은 조회분 직접회 화법(AOAC 1995), 총질소 비색법(AOAC 1995), 타닌 주석 산철시약법(池ケ谷 등1990), 카페인(Blauch & Tarka 1983), 카테킨류(Rah et al 1992)를 분석하였다. 홍차 추출물은 약탕기(DWP-3800T, Daewoong, Korea)에 홍차 200 g과 증류수 10 L를 넣고 5분간 침출시켜 따뜻할 때 여과(filter paper: Watman No. 1)하여 rotary evaporator(Eyela N-1000, Rikakikai Ltd., Japan)를 사용하여 농축시킨 후, 냉동건조(RVTFD 10R, Ilshin lab Co., Ltd., Korea)시켜 약 22.8%의 추출물을 얻었다. 냉동 건조시킨 시료는 냉장보관하면서 실험에 사용하였다.
- 홍차는 지리산 차천지(경남 하동 소재)에서 제조한 국내 시판용을 구입하여 사용하였다. 성분 분석은 조회분 직접회 화법(AOAC 1995), 총질소 비색법(AOAC 1995), 타닌 주석 산철시약법(池ケ谷 등1990), 카페인(Blauch & Tarka 1983), 카테킨류(Rah et al 1992)를 분석하였다.
데이터처리
- 5) Data show mean±S.D. * p<0.05, Significantly different from C group by t-test.
- 실험에서 얻은 결과는 통계프로그램인 SPSS(ver. 11.0)를 이용하여 평균과 표준편차를 구하였으며, 군 간의 비교는 Student's t-test를 통해 분석한 후 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- AST, ALT, ALP는 IFCC method(Tietz NW 1995), BUN은 Urease with GLDH method(Tietz NW 1995), creatinine은 Jaffe method(Tietz NW 1995), HDL-cholesterol은 enzymatic colorimetry(Izawa et al 1997), LDL-cholesterol은 elimination enzymatic assay(Okada et al 1998), albumin은 BCG-Doumas method(Grant et al 1987)으로 Bayer사의 kit(Bayer, Tarrytown, USA)를 사용하여 분석하였다.
- 간 조직 내 MDA의 측정은 Ohkawa et al(1979) 방법을 사용하였다. 조직 0.
- 간 조직 내 hydroxyproline의 측정은 Jamall & Dinelli의 방법(1981)을 사용하였다.
- 성분 분석은 조회분 직접회 화법(AOAC 1995), 총질소 비색법(AOAC 1995), 타닌 주석 산철시약법(池ケ谷 등1990), 카페인(Blauch & Tarka 1983), 카테킨류(Rah et al 1992)를 분석하였다.
성능/효과
- 정상군의 간 조직에서는 portal triads에서 얇은 collagen fiber가 관찰되었고, hepatic lobule의 변화와 특이할 만한 이상이 없었다. CCl4를 투여한 대조군에서는 hepatic lobule의 구조가 파괴되었고, 간세포의 괴사가 심하고 지방적이 매우 많았으며, 염증세포수의 증가가 관찰되었다. 또한, masson's trichrome 염색에서 collagen fiber bundle이 형성되었다.
- 각 장기 무게 변화에 있어서 간 무게는 대조군에 비하여 홍차 추출물 급여군이 유의성 있게 낮았고(p<0.01), 신장 무게는 대조군에 비하여 홍차 추출물 급여군이 감소하는 경향이 나타났으나 유의 성은 인정되지 않았다.
- 간 조직 중 hydroxyproline의 양은 정상군 196.3±27.7 μg/g과 비교하여 대조군 250.4±37.5 μg/g으로 유의적인 증가 현상을 보였으며(p<0.05), 홍차 추출물 급여군인 Ba군과 Bb군에서는 각각 224.8±35.1 μg/g, 226.4±30.1 μg/g으로 대조군과 비교하여 감소하는 경향이 나타났으나 유의성은 인정되지 않았다(Fig. 1).
- 간 조직 중 지질 과산화물인 MDA의 양은 대조군 469.6±46.0 nmol/g으로 정상군 93.7±24.3 nmol/g과 비교하여 유의적인 증가 현상을 보였으며(p<0.01), 홍차 추출물 급여로 Ba군과 Bb군에서는 각각 297.4±23.9 nmol/g, 280.9±31.1 nmol/g으로 대조군과 비교하여 유의적인 감소 현상을 나타내었다(p<0.05, Fig. 2).
- 간/체중 무게비는 대조군(4.95±0.28%)이 정상군(3.54±0.18%)에 비하여 유의적인 증가 현상을 보였고(p<0.01), 홍차 추출물 급여군인 Ba군(4.37± 0.27%), Bb군(4.31±0.24%)은 대조군과 비교하여 유의적인 감소 현상을 나타내었다(p<0.01).
- 간/체중 무게비는 대조군에 비해 홍차 추출물 급여군이 유의성 있게 낮았고(p<0.01), 신장/체중 무게비는 대조군에 비해 홍차 추출물 급여군이 감소하는 경향이 나타났으나 유의성은 인정되지 않았다.
- 01). 간질환 시 이차적으로 발생하는 신장 기능을 평가하는 중요한 지표가 되는 creatinine의 수치를 조사한 결과, 홍차 추출물 급여에 의한 변화는 관찰되지 않았다. 따라서 creatinine 지표를 볼 때 홍차 추출물에 의한 이상반응은 없을 것으로 사료된다.
- 신장 무게는 정상군이 1.65±0.34 g으로 가장 낮았고, 대조군은 2.02±0.29 g으로 가장 높았으며, 정상군과 비교하여 대조군이 유의적인 증가 현상을 나타내었다(p<0.05).
- 영양소의 소화율과 이용율을 나타내는 식이 효율은 체중 증가량을 식이 섭취량에 대한 비율로 나타내며, 대조군에 비하여 홍차 추출물 급여군인 Ba군에서 유의적인 증가 현상을 보였다(p<0.05).
- 21 g이었다. 정상군과 비교했을 때 대조군 및 홍차 추출물 급여군인 Ba군과 Bb군의 체중 증가량이 감소하는 경향이 나타났으나, 유의성은 인정되지 않았다. Yoon & Rhee(1994)는 일반증류수 투여군에 비해 홍차, 오룡차, 녹차 투여군이 체중 증가량이 감소하였다고 보고하여 본 실험 결과와 유사하였다.
- 정상군의 체중 증가량은 39.89±2.86 g, 대조군은 34.92±3.15 g이었으며, 홍차 추출물 급여군인 Ba군과 Bb군의 체중 증가량은 각각 37.46±1.92 g, 34.07±2.21 g이었다.
- 조회분 함량 5.40±0.21%, 총질소 함량 4.05±0.23%, 타닌 함량 18.21±0.21%, 카페인 함량 2.11±0.14%로 나타났다.
- 에 의해 간 손상을 유도하고, 홍차 추출물을 급여한 Ba군, Bb군을 3주 동안 관찰하여 혈청 생화학적 변화와 간 조직중 hydroxyproline과 MDA를 측정하여 간기능 개선 및 항섬유화 효과를 연구하였다. 체중 증가량은 홍차 추출물 급여군이 정상군에 비해 감소하는 경향이 나타났으나 유의성은 인정되지 않았고, 식이 섭취량은 대조군에 비해 홍차 추출물 급여군이 감소하는 경향이 나타났으나 유의성은 인정되지 않았다. 식이 효율은 홍차 추출물 급여군이 대조군에 비해 유의성 있게 높았다(p<0.
- 혈청 중 ALP의 수치는 정상군 170.17±25.52 unit/L와 비교하여 대조군 306.63±61.97 unit/L로 유의적인 증가 현상을 보였고(p<0.01), 홍차 추출물 급여군인 Ba 군과 Bb군에서는 각각 227.90±55.05 unit/L, 200.86± 25.86 unit/L로 대조군과 비교하여 유의적인 감소 현상을 나타내었다(p<0.01).
- 혈청 중 ALT 의 수치는 대조군 40.37±5.66 unit/L로 정상군 25.33±1.97 unit/L와 비교하여 유의적인 증가 현상을 보였으며(p<0.01), 홍차 추출물 급여로 Ba군과 Bb군에서는 각각 32.10±4.65 unit/L, 26.75±2.82 unit/L로 대조군과 비교하여 유의적인 감소 현상을 나타내었다(p<0.01).
- 혈청 중 AST의 수치는 정상군 127.00±16.35 unit/L와 비교하여 대조군 157.71±22.34 unit/L로 유의적인 증가 현상을 보였고(p<0.01), 홍차 추출물 급여군인 Ba군과 Bb군에서는 각각 119.40±18.93 unit/L, 116.88±25.86 unit/L로 대조군과 비교하여 유의적인 감소 현상을 나타내었다(p<0.01).
- 혈청 중 BUN의 수치는 대조군 24.03±2.52 mg/dL로 정상군 16.14±2.19 mg/dL와 비교하여 유의적인 증가 현상을 보였으며(p<0.01), 홍차 추출물 급여군인 Ba군과 Bb군에서는 각각 19.06±2.96 mg/dL, 17.68±2.09 mg/dL로 대조군과 비교 하여 유의적인 감소 현상을 나타내었다(p<0.01).
- 혈청 중 HDL-cholesterol의 수치는 정상군 32.71±3.20 mg/ dL와 비교하여 대조군에서 28.17±3.25 mg/dL로 유의적인 감소 현상을 보였다(p<0.05).
- 혈청 중 LDL-cholesterol의 수치는 대조군에서 12.13 ±1.36 mg/dL로 정상군 7.17±0.75 mg/dL와 비교하여 CCl4 투여에 의한 LDL-cholesterol의 유의적인 증가 현상을 보였다(p<0.01).
- 홍차 추출물 급여군이 대조군에 비해 혈청 중 AST, ALT, ALP, BUN, LDL-cholesterol 수치가 유의성 있게 낮았고(p<0.01), 간 조직학적 관찰에서도 홍차 추출물 급여군은 대조군보다 약한 지방적이 관찰되었고 간세포의 괴사가 약하게 일어났다.
- 홍차 추출물 급여에 의한 LDL-cholesterol 변화는 대조군과 비교하여 홍차 추출물 5 mg 급여한 Ba군에서 유의적인 감소 현상을 보였고(p<0.01), 10 mg 급여한 Bb군에서는 감소하는 경향이 나타났으나 유의성은 인정되지 않았다.
- 또한, masson's trichrome 염색에서 collagen fiber bundle이 형성되었다. 홍차 추출물을 급여한 실험군 Ba, Bb에서는 대조군보다 약한 지방적이 관찰되었고, 간세포의 괴사가 대조군보다 약하게 일어났으며, collagen fiber bundle도 얇았다(Fig. 3). 따라서 간조직 중 hypdroxyproline의 수치가 대조군보다 홍차 추출물 급여군에서 약간 낮았지만, 조직학적 관찰에서 대조군과 비교했을 때 콜라겐의 증가와 지방 변성과 지방적이 약하게 나타남으로써 간섬유화의 지연 효과와 간 보호 효과가 있다고 사료된다.
후속연구
- 01), 간 조직학적 관찰에서도 홍차 추출물 급여군은 대조군보다 약한 지방적이 관찰되었고 간세포의 괴사가 약하게 일어났다. 또한, 간 조직 중 hydroxyproline과 MDA의 양이 낮아, 이를 종합해 볼 때 홍차 추출물이 간세포의 기능을 유지시킴으로써 CCl4 투여에 의해 유발된 간 손상을 억제하여 간 조직 손상 보호를 통해 간 기능 개선과 항섬유화 효과가 있을 것으로 사료되므로 향후 좀 더 많은 연구가 필요하리라 생각된다.
- 신장/체중 무게비는 정상군(0.85±0.16%)과 비교하여 대조군(1.06±0.12%) 이 유의적인 증가 현상을 보였으며(p<0.05), 홍차 추출물 급여군은 대조군보다 유의성은 인정되지 않았지만 감소하여 간섬유화 시 이차적으로 나타나는 신기능의 저하가 홍차 추출물 급여로 인해 어느 정도 감소했다고 사료되므로 정확하게 판단하기 위해 추후에 연구 검토해야 할 과제로 사료된다.
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