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문제 정의
- 따라서 본 실험에서는 등급 외 더덕을 이용하여 발효더덕을 제조한 후 발효더덕의 건망증에 대한 효과를 scoplamnine으로 유도된 건망증 동물모델을 이용하여 수동회피시험(passive avoidance test)과 Morris 수중미로시험(Morris water maze test)을 이용하여 행동학적 변화를 관찰하고 발효더덕의 기억력 개선 능력 여부를 확인하고자 하였다.
- 본 실험에서는 발효더덕을 제조한 후 발효더덕의 건망증에 대한 효과를 scoplamnine으로 유도된 건망증 모델을 이용하여 수동회피시험(passive avoidance test)과 Morris 수중미로시험(Morris water maze test)을 이용하여 행동학적 변화를 통하여 발효더덕의 기억력 개선 능력 여부를 확인하고자 하였다. 더덕 및 발효더덕 추출물 167, 333, 667 mg/kg을 경구투여 한 결과 발효더덕 추출물의 333 mg/kg 및 667 mg/kg 그룹에서 각각 120.
- 5 mA의 전기 충격이 3초 동안 grid 바닥을 통해 흐르게 되고 생쥐는 이를 기억하게 되는데 이때 길로틴문이 열린 후 생쥐가 어두운 쪽으로 들어갈 때까지의 시간을 측정하였다(학습시험: training trail). 학습 시험이 끝난 후, 24시간 후에 장기기억에 미치는 더덕 및 발효더덕 추출물의 효과를 확인하고자 실시하였다(기억시험: test trail). 실험동물을 왕복상자에 넣고 10초 동안 탐색시간후 길로틴문이 열리고 어두운 쪽으로 생쥐의 네 발이 다 들어가는데 걸리는 시간(latency time: 머무름시간)을 180초까지 측정하였다.
제안 방법
- 수동회피시험의 경우 더덕과 발효더덕 추출물을 인지시험 90분전에 각각 167, 333, 667 mg/kg의 농도로 경구투여하였으며, 기억손상을 유발을 위해 인지시험 30분전에 scopolamine hydrobromide를 1 mg/kg의 농도로 복강투여하였다. Morris 수중미로시험의 경우는 더덕과 발효더덕 추출물을 인지시험 90분전에 333 mg/kg의 농도로 경구투여하였으며, 기억손상을 유발을 위해 인지시험 30분전에 scopolamine hydrobromide를 1 mg/kg의 농도로 복강투여하였다.
- Scopolamine(1 mg/kg, i.p.)을 투여한 기억력 감퇴 동물모델을 이용하여 더덕 및 발효더덕 추출물이 기억력 손상을 억제하여 주는 효과가 있는지 여부를 수동회피 측정 장치를 이용하여 확인하였다.
- 어두운 쪽으로 가는데 걸리는 시간이 길수록 수동회피의 학습과 기억이 좋음을 나타낸다(12). 각 실험이 끝난 후에는 전 실험동물의 흔적을 지우기 위해 70% alcohol로 깨끗이 닦아 다음 실험에 영향을 주지 않도록 하였다.
- 실험시작 90분 전에 실험동물을 행동관실 옮기고 약물을 투여한 후 안정시켰다. 경구투여 30분 후에 증류수에 녹인 scopolamine을 1 mg/kg의 용량으로 복강투여 하였고, scopolamine 투여 30분 후에 mouse를 조명을 비춘 밝은 쪽 구획에 놓고 10초간 탐색시킨후 길로틴문(gillotin door)을 열어 어두운 구획으로 들어갈수 있게 하였다(Gemini Avoidance System, San Diego, CA, USA). 각 구획은 20×20×20 cm의 공간이다.
- 생 더덕은 강원도 횡성지역에서 2007년 9에 채취한 것을 시료로 사용하였다. 구입한 더덕은 선별 후 깨끗이 세정하여 물기를 제거한 후 중량 대비 5중량%의 Leuconostoc mesenteroides(KCCM 35471)를 접종하여 30℃, 습도 75%를 유지하며 7일간 발효한 후, 20℃에서 7일간 숙성하여 발효더덕을 얻었다. 이 발효더덕을 세절하여 동결건조기(PVTFA 10AT, ILSIN, Suwon, Korea)를 사용하여 동결건조 하였다.
- 물과 사료섭취는 제한하지 않고 공급하였다. 대조군, scopolamine 투여군, 더덕과 발효더덕 추출물 투여군으로 나누어 각 군당 10마리씩 4군으로 구성하였다.
- 수동회피시험은 설치류의 working memory ability를 측정하는 방법이며 수많은 연구자들이 학습 및 기억력 측정을 위하여 널리 이용되고 있는 실험으로 본 실험에서는 LeDoux의 방법을 응용하여 시행하였다(11). 실험시작 90분 전에 실험동물을 행동관실 옮기고 약물을 투여한 후 안정시켰다.
- 수동회피시험의 경우 더덕과 발효더덕 추출물을 인지시험 90분전에 각각 167, 333, 667 mg/kg의 농도로 경구투여하였으며, 기억손상을 유발을 위해 인지시험 30분전에 scopolamine hydrobromide를 1 mg/kg의 농도로 복강투여하였다. Morris 수중미로시험의 경우는 더덕과 발효더덕 추출물을 인지시험 90분전에 333 mg/kg의 농도로 경구투여하였으며, 기억손상을 유발을 위해 인지시험 30분전에 scopolamine hydrobromide를 1 mg/kg의 농도로 복강투여하였다.
- 실험동물이 도피대에 도달하면 10초 동안 도피대에 머물도록 하였으며, 120초 안에 도피대을 찾지 못할 경우에는 10초 동안 도피대에 머물도록 하여 도피대를 기억하도록 하였다. 수중미로 실험은 20분 간격으로 반복하였으며, 실험 5일째에는 working memory를 측정하기 위하여 도피대를 제거하고 도피대를 찾아가는 시간(escape latency)을 기록하는 probe test를 실시하였다.
- 수중미로 시험은(13) 원형 수조(직경 150 cm, 높이 65 cm) 안에 물을 30 cm 높이로 채우고(23±2 °C), 수조 4분면의한 구획에 직경 10 cm의 도피대(escape platform)를 수면아래 1 cm에 위치하도록 하고 탈지분유를 풀어 받침대가 보이지 않게 하였다. 실험 첫날은 도피대 없이 수조안에서 실험 동물이 60초간 자유롭게 수영하도록 하였고, 4일 동안 매일 입수하는 사분면을 달리하여 하루 2번씩 반복하여 인지적응 훈련을 수행하였다. 실험동물이 도피대에 도달하면 10초 동안 도피대에 머물도록 하였으며, 120초 안에 도피대을 찾지 못할 경우에는 10초 동안 도피대에 머물도록 하여 도피대를 기억하도록 하였다.
- 학습 시험이 끝난 후, 24시간 후에 장기기억에 미치는 더덕 및 발효더덕 추출물의 효과를 확인하고자 실시하였다(기억시험: test trail). 실험동물을 왕복상자에 넣고 10초 동안 탐색시간후 길로틴문이 열리고 어두운 쪽으로 생쥐의 네 발이 다 들어가는데 걸리는 시간(latency time: 머무름시간)을 180초까지 측정하였다. 어두운 쪽으로 가는데 걸리는 시간이 길수록 수동회피의 학습과 기억이 좋음을 나타낸다(12).
- 실험 첫날은 도피대 없이 수조안에서 실험 동물이 60초간 자유롭게 수영하도록 하였고, 4일 동안 매일 입수하는 사분면을 달리하여 하루 2번씩 반복하여 인지적응 훈련을 수행하였다. 실험동물이 도피대에 도달하면 10초 동안 도피대에 머물도록 하였으며, 120초 안에 도피대을 찾지 못할 경우에는 10초 동안 도피대에 머물도록 하여 도피대를 기억하도록 하였다. 수중미로 실험은 20분 간격으로 반복하였으며, 실험 5일째에는 working memory를 측정하기 위하여 도피대를 제거하고 도피대를 찾아가는 시간(escape latency)을 기록하는 probe test를 실시하였다.
- 구입한 더덕은 선별 후 깨끗이 세정하여 물기를 제거한 후 중량 대비 5중량%의 Leuconostoc mesenteroides(KCCM 35471)를 접종하여 30℃, 습도 75%를 유지하며 7일간 발효한 후, 20℃에서 7일간 숙성하여 발효더덕을 얻었다. 이 발효더덕을 세절하여 동결건조기(PVTFA 10AT, ILSIN, Suwon, Korea)를 사용하여 동결건조 하였다. 건조된 시료는 마쇄하여 유리병에 넣고 밀봉한 후 냉장고(4℃)에 보존하면서 시료로 사용하였다.
- 각 구획은 20×20×20 cm의 공간이다. 이때 길로틴 문이 열린 후 40초 이내에 어두운 쪽으로 들어가지 않는 생쥐는 실험에서 제외시켰으며 일단 mouse가 어두운 쪽으로 들어가면 길로틴문이 닫히고 0.5 mA의 전기 충격이 3초 동안 grid 바닥을 통해 흐르게 되고 생쥐는 이를 기억하게 되는데 이때 길로틴문이 열린 후 생쥐가 어두운 쪽으로 들어갈 때까지의 시간을 측정하였다(학습시험: training trail). 학습 시험이 끝난 후, 24시간 후에 장기기억에 미치는 더덕 및 발효더덕 추출물의 효과를 확인하고자 실시하였다(기억시험: test trail).
대상 데이터
- 생 더덕은 강원도 횡성지역에서 2007년 9에 채취한 것을 시료로 사용하였다. 구입한 더덕은 선별 후 깨끗이 세정하여 물기를 제거한 후 중량 대비 5중량%의 Leuconostoc mesenteroides(KCCM 35471)를 접종하여 30℃, 습도 75%를 유지하며 7일간 발효한 후, 20℃에서 7일간 숙성하여 발효더덕을 얻었다.
- 수중미로 시험은(13) 원형 수조(직경 150 cm, 높이 65 cm) 안에 물을 30 cm 높이로 채우고(23±2 °C), 수조 4분면의한 구획에 직경 10 cm의 도피대(escape platform)를 수면아래 1 cm에 위치하도록 하고 탈지분유를 풀어 받침대가 보이지 않게 하였다.
- 실험동물의 공간기억을 평가하기 위해 흰쥐를 이용하였다. 수중미로 시험은(13) 원형 수조(직경 150 cm, 높이 65 cm) 안에 물을 30 cm 높이로 채우고(23±2 °C), 수조 4분면의한 구획에 직경 10 cm의 도피대(escape platform)를 수면아래 1 cm에 위치하도록 하고 탈지분유를 풀어 받침대가 보이지 않게 하였다.
- 체중이 25～30 g의 4주령 생쥐(ICR계) 수컷과 6주령 흰쥐(Sprague-Dawley계) 수컷을 주식회사 오리엔트(Seongnam, Korea)에서 구입하여 온도 22±2 ℃, 습도 50±5 ℃, 12시간 dark/light cycle 조건의 사육실에서 일주일간 적응시켰다.
데이터처리
- 통계처리는 SPSS 통계 package program(statistical package social science, cersion 14.0)을 이용하여 분산분석 (ANOVA)을 실시하였고, 처리군 간의 유의성은 Duncan's multiple range test로 p<0.05 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
이론/모형
- Scopolamine으로 유도한 기억력 감퇴 흰쥐의 공간학습에 대한 더덕 및 발효더덕 추출물의 효과는 Morris water maze test를 실시하여 Fig. 2에 나타내었다. Scopolamine 처리군은 시험훈련 기간 동안 escape latency 시간이 대조군에 비해 증가하였으며, 더덕 및 발효더덕 추출물 투여군은 시험훈련 3일째부터 도피대를 찾아가는 시간이 유의적으로 감소하였다(p<0.
성능/효과
- Scopolamine 처리군은 시험훈련 기간 동안 escape latency 시간이 대조군에 비해 증가하였으며, 더덕 및 발효더덕 추출물 투여군은 시험훈련 3일째부터 도피대를 찾아가는 시간이 유의적으로 감소하였다(p<0.05).
- Scopolamine(1 mg/kg, i.p.)의 투여에 의한 기억력 손상 여부를 확인한 결과 scopolamine 그룹은 기억시험에서 latency time이 40.2±14.3초로 대조군의 180.0±0.0초에 대하여 통계적으로 유의성 있게 감소하였다(p<0.05).
- 더덕 및 발효더덕 추출물 167, 333, 667 mg/kg을 경구투여 한 결과 발효더덕 추출물의 333 mg/kg 및 667 mg/kg 그룹에서 각각 120.9±15.3초 및 140.7±18.0초에 대하여 통계적으로 유의성 있게 latency time이 증가하였으며, 특히 333 mg/kg의 용량에서 대조군의 85% 수준으로 회복 하는 것을 확인하였다.
- 도피대를 제거한 probe test에서 대조군과 대비하여 더덕 및 발효더덕 추출물 투여군은 각각 47%, 80% 수준으로 escape latency가 감소하였다. 더덕 및 발효더덕 추출물은 4일간의 인지훈련기간 동안 수중미로상의 platform의 위치를 인지하고 반복되는 연속적인 훈련을 통해 공간 지각력을 확실하게 기억하고 있음을 확인할 수 있었다. 이를 통해 볼때 발효더덕추출물은 scopolamine으로 유도한 치매 흰쥐의 장기기억 개선효과가 뛰어난 것으로 나타났다.
- 반면 더덕 및 발효더덕 추출물 처리군에서는 scopolamine에 의한 기억 손상이 개선되어 대조군의 escape latency 수준으로 회복되었다. 도피대를 제거한 probe test에서 대조군과 대비하여 더덕 및 발효더덕 추출물 투여군은 각각 47%, 80% 수준으로 escape latency가 감소하였다. 더덕 및 발효더덕 추출물은 4일간의 인지훈련기간 동안 수중미로상의 platform의 위치를 인지하고 반복되는 연속적인 훈련을 통해 공간 지각력을 확실하게 기억하고 있음을 확인할 수 있었다.
- 본 실험을 통해 발효더덕은 scopolamine으로 유도된 건망증 모델에서 단회 경구투여 했을 때 용량 의존적으로 기억력 개선 효과를 나타냄을 확인하였다. 이와 같은 결과는 더덕에 대한 실험은 이루어져 있지 않기 때문에 비교할 수는 없으나 참외추출물, 치자추출물, 한약복합물(7-9) 등과 비교할 때 기억력 향상 효과는 있는 것으로 판단된다.
- 더덕 및 발효더덕 추출물은 4일간의 인지훈련기간 동안 수중미로상의 platform의 위치를 인지하고 반복되는 연속적인 훈련을 통해 공간 지각력을 확실하게 기억하고 있음을 확인할 수 있었다. 이를 통해 볼때 발효더덕추출물은 scopolamine으로 유도한 치매 흰쥐의 장기기억 개선효과가 뛰어난 것으로 나타났다.
- 한편 더덕 및 발효더덕 추출물 167, 333, 667 mg/kg을 경구투여한 결과 발효더덕추출물의 333 mg/kg 및 667 mg/kg 그룹에서 각각 120.9±15.3초 및 140.7±18.0초에 대하여 통계적으로 유의성 있게 latency time이 증가하였으며, 특히 333 mg/kg의 용량에서 대조군의 85% 수준으로 회복하는 것을 확인하였다(p<0.05, Fig. 1)
- 훈련 5일째 도피대를 제거한 후 probe test를 시행한 결과 scopolamine 투여군은 84.3±10.3초로 대조군의 27.3±6.8초보다 현저히 증가하였다(p<0.01).
후속연구
- 이는 중추신경계 cholinergic 신경의 손상에 의해 나타나는 현상과 유사한 기억력 감퇴를 나타내며 이 모델에서 효과가 있는 약물은 cholinergic 신경계를 경유하여 효능을 타나낼 것이라 생각할 수 있다. 따라서 발효더덕추출물 경구섭취는 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 동물모델에서 기억력 개선 및 인지능력을 향상시킬 수 있다고 생각되며, 효과의 기전 및 효능 성분을 확인 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.
- 또한, Morris water maze test를 실시에서도 더덕 및 발효더덕 추출물 처리군에서는 scopolamine에 의한 기억 손상이 개선되어 대조군의 escape latency 수준으로 회복되었다. 이상의 결과 발효더덕 추출물의 경구섭취는 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 동물모델에서 기억력 개선 및 인지능력을 향상시킬 수 있다고 생각되며, 효과의 기전 및 효능성분을 확인 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.
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